CN103665161A - 纯化水溶性纳米银颗粒鼠源性IgG类单抗偶联物方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适合规模化高效纯化水溶性纳米银颗粒与鼠源性IgG类单克隆抗体偶联物的新方法，属生物技术领域。针对目前纳米银颗粒抗体偶联物纯化工艺复杂，回收率低，难以实现规模化生产的弊端，本发明通过采用氨基葡萄糖封闭纳米银颗粒与抗体偶联物的残留羧基，降低偶联产物的表面ζ电位，通过调整溶液pH值至4.5～5.0，进一步降低偶联产物在溶液中的净电荷含量、实现普通高速离心法规模化高效纯化纳米银颗粒与抗体偶联物。本发明简化了纳米银颗粒与抗体偶联物的实验操作流程，降低了对分离设备的要求，适合大批量纯化纳米银颗粒鼠源性IgG类单克隆抗体偶联物，得率在90%以上，且偶联产物的光特性以及生物活性未见明显变化。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料生物学修饰以及偶联物纯化的新方法，具体是涉及一种高效纯化羧基化水溶性纳米银颗粒鼠源性IgG类单克隆抗体偶联物的新方法。
背景技术
自从1975年应用细胞融合技术首次制备出单克隆抗体以来，杂交瘤技术得到了迅速发展。大量的单克隆抗体被成功制备，并被广泛应用于免疫学、生物化学、药理学、细胞生物学、微生物学及临床等各个领域。目前已制备了小鼠、大鼠及人的杂交瘤细胞株，其中应用最广泛的仍然是小鼠杂交瘤细胞株。因此，鼠源性鼠源性IgG类单克隆抗体自然而然地成为了一类最主要且应用最为广泛的单克隆抗体。该类抗体不仅具有重要的科研价值，而且具有巨大的商业价值。然而，鼠源性鼠源性IgG类单克隆抗体不具有类似纳米材料的光、电等性质，因此在实际应用中往往需要结合其他的一些材料，如荧光物质、有机染料，磁性材料等。
以金、银纳米颗粒为代表的贵金属纳米颗粒，具有特殊的光、电、磁等性质，已经发展为一种非常有效的生物探针。目前，金纳米颗粒以其良好的生物相容性和光学稳定性，非常高的消光系数，散射光强等优势代替了传统的荧光标记物，在细胞成像、DNA 杂交、蛋白质相互作用等领域具有广泛的应用价值。银纳米颗粒（Sliver nanoparticle，SNP）是一种金属胶体，它和金纳米颗粒一样具有相当强的消光系数，散射信号强，但是与之相比，同等粒径的两种纳米颗粒，银纳米颗粒的消光系数更高，一般是其 100 倍左右。以20 nm 的金、银纳米颗粒为例，金纳米颗粒的消光系数为8.78×108 M-1·cm-1，而银纳米颗粒达到了2.87×1010 M-1·cm-1。如此强的散射信号为检测提供了良好的信噪比，有效的降低了检测限、提高了单分子检测的灵敏度，为 DNA/RNA、活体病毒样本的医疗检验等微量以及痕量的检测提供了良好的标记探针。
金属纳米颗粒及其表面表现出多样且复杂的光学特性。包括贵金属纳米颗粒的强色彩，薄金属层的表面等离子共振吸收，以及对金属表面附近受激发染料的淬灭等。最近发现，荧光标记物与金属纳米颗粒或者贵金属表面的相互作用被用于获得荧光信号的增强、基于金纳米胶体淬灭的分析以及薄金属层附近荧光标记物的定向辐射等实验现象。银纳米颗粒在金属-增强荧光方面也表现出很大的优势。除了增强亮度外，金属-荧光标记物体系还表现出荧光寿命的缩短和稳定性的增加以及光漂白的减少等优点。金属纳米材料与荧光标记物间的距离直接决定了荧光增强的效率，一般认为，10 nm 是一个荧光增强效率的距离最优值。但是，在一些大分子蛋白如绿色荧光蛋白以及免疫体系中，银纳米颗粒也存在着金属-增强荧光的特性。
作为一种新型的生物标记物，纳米银颗粒结合有机染料或荧光染料后，在细胞标记、活体细胞成像、活体动物体内荧光显微成像以及荧光标记的免疫学快速诊断技术等领域具有更为显著的优势。其中羧基功能团表面的水溶性纳米银颗粒应用最为广泛，采用多羧基以及疏水链的两性聚合物是油溶性纳米银颗粒转化为羧基表面的水溶性纳米银颗粒最常用方法。羧基化纳米银颗粒鼠源性IgG类单克隆抗体偶联常用方法为EDC/NHSS介导的活泼酯方法。在纳米银颗粒与鼠源性IgG类单克隆抗体偶联过程中，将纳米银颗粒鼠源性IgG类单克隆抗体偶联物与溶液中游离鼠源性IgG类单克隆抗体进行高效分离，是保证纳米银颗粒鼠源性IgG类单克隆抗体偶联物使用效率的前提。目前，纳米银颗粒鼠源性IgG类单克隆抗体偶联物纯化方法主要包括以下几种。第一，超速离心方法。由于水溶性纳米银颗粒纳米粒子粒径小，比表面积大，纳米材料与鼠源性IgG类单克隆抗体偶联物表面含有大量的羧基，因此采用常规离心（低于30000 g离心力），纳米银颗粒鼠源性IgG类单克隆抗体偶联物回收效率普遍偏低（小于50%），若要将纳米银颗粒鼠源性IgG类单克隆抗体偶联物回收效率提高至90%以上，离心速度一般需大于50，000 g。 第二种常见纯化方法为凝胶色谱法。该方法利用纳米银颗粒鼠源性IgG类单克隆抗体偶联物与鼠源性IgG类单克隆抗体的分子量差异（表现为光学以及水化粒径的差异），利用排阻层析原理进行分离。第三种常用分离方法为超滤分离法。该法利用超滤管的超滤膜截流分子量差异将鼠源性IgG类单克隆抗体与纳米银颗粒鼠源性IgG类单克隆抗体偶联物进行分离的一种方法。同时还有基于琼脂糖凝胶以及琼脂糖-聚丙烯酰胺杂合凝胶电泳等的纯化分离方法。总之，利用以上纯化方法虽然可以获得较高质量的纳米银颗粒鼠源性IgG类单克隆抗体偶联物，但仍存在操作条件苛刻，流程复杂，得率低等缺陷，很难实现规模化生产。
发明内容
水溶性纳米银颗粒是一种良好的纳米荧光标记材料，该材料通过与抗体、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G以及配体或受体分子偶联，可广泛应用于细胞标记、活体细胞成像、活体动物体内荧光显微成像以及免疫快速诊断等诸多领域。但是传统的纳米银颗粒单克隆抗体偶联物纯化方法存在操作条件苛刻，流程复杂，得率低以及很难实现规模化生产等缺陷。
本发明的目的是提供一种操作简便、分离效率高、大批量纯化纳米银颗粒单克隆抗体偶联物的新方法，具体包括以下步骤：
纯化纳米银颗粒与鼠源性IgG类单克隆抗体偶联物的方法，包括如下步骤：（1）将水溶性羧基修饰的纳米银颗粒活化，加入鼠源性IgG类单克隆抗体溶液，调整溶液pH至7.0～9.0后，偶联反应；（2）偶联反应结束后，溶液中加入氨基葡萄糖封闭偶联产物中纳米银颗粒表面残留的羧基，将反应溶液pH值调整至弱酸性；（3）高速离心，弃上清液，取沉淀。
步骤（3）后，还有将沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L pH 7.0～7.5磷酸盐缓冲液溶解步骤。
所用的水溶性纳米银颗粒为核壳结构的纳米银颗粒，壳层由双亲聚合物组成，外部为大量亲水羧基表面，内层为长链疏水基团通过与三辛基氧化磷的疏水作用将油溶性纳米银颗粒包裹在壳层内部。
所述步骤（1）中活化为将水溶性羧基修饰的纳米银颗粒溶解于pH 5.0～6.0，0.05 mol/L硼酸盐缓冲液中，分别加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时，活化纳米银颗粒羧基。
所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺与纳米银颗粒的摩尔比均为100～200：1，优选为150:1；所述鼠源性IgG类单克隆抗体与纳米银颗粒的摩尔比为1～10：1。
偶联反应结束后，溶液中加入氨基葡萄糖至氨基葡萄糖终浓度为1.5～3%，充分混匀15～30分钟。
步骤（2）中将反应溶液pH值调整至弱酸性为将pH值调整至4.5～5.0，优选为5.0。
步骤（3）所述高速离心离心力为28，000～30，000g。
所述鼠源性IgG类单克隆抗体为抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体、抗赭曲霉毒素单克隆抗体、抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体、抗恩诺沙星单克隆抗体、抗盐酸克伦特罗单克隆抗体、抗沙丁胺醇单克隆抗体、抗孔雀石绿单克隆抗体、抗莱克多巴胺单克隆抗体、抗沙门氏菌单克隆抗体、抗志贺氏菌单克隆抗体、或抗空肠弯曲菌单克隆抗体。
所述水溶性羧基修饰的纳米银颗粒制备方法为：
将浓度为98%浓硫酸（H2SO4）和浓度为30%双氧水（H2O2）以体积比（1:3）均匀混合后，置电炉丝加热至沸腾。取一定量的石英和硅晶片缓缓加入到上述沸溶液中，反应20 min后，用大量的蒸馏水漂洗。漂洗后的石英和硅晶片浸入到聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液（PDDA，1.0 mg/mL）中，反应20 min。将上述反应溶液加入到10 mM Ti(SO4)2水溶液（0.1 M H2SO4）中，反应5 min。然后将反应基质转移到磷酸缓冲液（pH 4.0）中，放置几秒后又转移到另一磷酸缓冲液（pH 4.0）中，放置5 min。最后，用大量的蒸馏水漂洗并置于氮气（N2）中干燥，形成硅基片。在50℃下，将上述硅基片浸入于10 mM AgNO3溶液，反应24 h后用蒸馏水漂洗1 min并置于氮气（N2）中干燥，形成银离子掺杂的磷酸肽基质片。将上述基质片浸入于新鲜制备的10 mM NaBH4溶液中5 min，然后用蒸馏水漂洗1 min并置于氮气（N2）中干燥，即得到纳米银颗粒。分别取1 g聚马来酸酐十八醇酯、1.2 g 2-(2-氨基乙氧基)乙醇和1.26 g纳米银颗粒溶解于5 mL 96%乙醇溶液中，置于70℃下反应1 h，加热挥发乙醇，最后得到水溶性羧基化纳米银颗粒。
水溶性羧基修饰的纳米银颗粒为核壳结构的纳米银颗粒，壳层由双亲聚合物组成，外部为大量亲水羧基表面，内层为长链疏水基团，通过与三辛基氧化磷的疏水作用将油溶性纳米银颗粒包裹在壳层内部。将纳米银颗粒溶解于pH 6.0，0.05 mol/L硼酸盐缓冲液中，加入摩尔比为100～200：1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时，将纳米银颗粒表面羧基转化为酸性条件下稳定的活泼酯。加入鼠源性IgG类单克隆抗体溶液，其中鼠源性IgG类单克隆抗体与纳米银颗粒摩尔比为10：1，用1 M NaOH溶液调整溶液pH至8.0～9.0。在pH 8.0～9.0条件下，鼠源性IgG类单克隆抗体氨基酸残基中的氨基易于质子化，而纳米银颗粒表面活泼酯化的羧基在弱碱性条件下发生水解，与质子化氨基偶联形成稳定的酰胺键，从而将鼠源性IgG类单克隆抗体偶联至纳米银颗粒表面。纳米银颗粒与单克隆抗体偶联后，由于空间位阻的原因，纳米银颗粒表面仍会残留大量未被偶联的羧基，因此纳米银颗粒单克隆抗体偶联物仍旧保持较大的ζ电位，因此采用普通离心方法无法将纳米银颗粒单克隆抗体偶联物与未标记单克隆抗体进行有效分离。为了降低纳米银颗粒单克隆抗体偶联物表面的ζ电位，本发明通过氨基葡萄糖的氨基与纳米银颗粒表面游离羧基发生离子交换，使纳米银颗粒单克隆抗体偶联物残留羧基转换为羟基，提高纳米银颗粒单克隆抗体偶联物等电点，同时进一步通过高浓度氨基葡萄糖（2%～5%）破坏鼠源性IgG类单克隆抗体表面的水化层，当将溶液pH值调整至4.5时，纳米银颗粒单克隆抗体偶联物在普通高速离心下（18，000 g～20，000 g）即可与溶液中未偶联单克隆抗体实现有效分离，其中纳米银颗粒与单克隆抗体偶联物的回收率大于90%。
为了验证氨基葡萄糖是否能有效降低羧基化纳米银颗粒的ζ电位，我们以羧基化的水溶性纳米银颗粒为原料，以氨基葡萄糖为封闭剂，采用EDC法封闭纳米银颗粒表面羧基。然后采用0.1M HCl或 NaOH调整羧基化的纳米银颗粒（浓度为0.1 μM）pH分别至2，3，4，5，6和7，同时加入同等量的0.1M HCl或 NaOH溶液至相同浓度的羟基化纳米银颗粒溶液中。以上两类不同pH值的纳米银颗粒经马尔文表面电位粒径仪分析，结果见表1。从表1可知，在相同pH值下，氨基葡萄糖修饰的羟基化纳米银颗粒表面电位显著低于羟基化纳米银颗粒，当溶液pH值降至4～5之间，羟基化纳米银颗粒ζ电位下降明显。
表1 不同pH条件下，羧基化以及羟基化纳米银颗粒的表面电位
| pH 2 | pH 3 | pH 4 | pH 5 | pH 6 | pH 7 | |
| 羧基化纳米银颗粒 | -6.23 | -15.21 | -14.19 | -34.5 | -49.11 | -61.19 |
| 羟基化纳米银颗粒 | 11.201 | -7.15 | -4.63 | -31.66 | -34.34 | -53.28 |
采用本发明技术方案具有如下有益效果：
1、本发明方法通过添加氨基葡萄糖封闭纳米银颗粒表面未被反应的羧基，使羧基转变为羧基，降低水溶性纳米银颗粒鼠源性IgG类单克隆抗体偶联物表面的ζ电位，同时破坏鼠源性IgG类单克隆抗体表面的水化层，有利于水溶性纳米银颗粒鼠源性IgG类单克隆抗体偶联物从反应溶液中析出。
2、本发明方法借助调酸，改变反应溶液pH值至4.5，使水溶性纳米银颗粒单克隆抗体偶联物在溶液中容易析出。
3、本发明技术通过添加氨基葡萄糖和调酸，使得水溶性纳米银颗粒单克隆抗体偶联物更加容易从反应溶液中析出，采用普通离心方法28，000 g～30，000 g就可以将水溶性纳米银颗粒单克隆抗体偶联物与未偶联单克隆抗体进行高效分离（分离效率达90%以上）。与传统的水溶性纳米银颗粒单克隆抗体偶联物纯化方法相比，具有操作简单，设备要求低（一般实验室均能达到），纯化效率高（90%以上）以及可以实现规模化生产等。
具体实施方式
为了使本发明更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
磷酸盐缓冲液（PBS，0.05 M，pH 7.4）的配置方法：NaCl 40 g，Na2HPO4 13.5 g, KH2PO4 1.0 g，KCl 1.0 g溶于1 L超纯水中。用0.1 M NaOH调pH值至8.0～9.0。
硼酸盐缓冲液（0.05 M，pH 6.0）的配制方法：取1.0 g硼酸溶于1 L超纯水。调pH值至6.0。
实施例1 合成以两亲聚合物为壳层的水溶性羧基纳米银颗粒
将浓度为98%浓硫酸（H2SO4）和浓度为30%双氧水（H2O2）以体积比（1:3）均匀混合后，置电炉丝加热至沸腾。取一定量的石英和硅晶片缓缓加入到上述沸溶液中，反应20 min后，用大量的蒸馏水漂洗。漂洗后的石英和硅晶片浸入到聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液（PDDA，1.0 mg/mL）中，反应20 min。将上述反应溶液加入到10 mM Ti(SO4)2水溶液（0.1 M H2SO4）中，反应5 min。然后将反应基质转移到磷酸缓冲液（pH 4.0）中，放置几秒后又转移到另一磷酸缓冲液（pH 4.0）中，放置5 min。最后，用大量的蒸馏水漂洗并置于氮气（N2）中干燥，形成硅基片。在50℃下，将上述硅基片浸入于10 mM AgNO3溶液，反应24 h后用蒸馏水漂洗1 min并置于氮气（N2）中干燥，形成银离子掺杂的磷酸肽基质片。将上述基质片浸入于新鲜制备的10 mM NaBH4溶液中5 min，然后用蒸馏水漂洗1 min并置于氮气（N2）中干燥，即得到纳米银颗粒。分别取1 g聚马来酸酐十八醇酯、1.2 g 2-(2-氨基乙氧基)乙醇和1.26 g纳米银颗粒溶解于5 mL 96%乙醇溶液中，置于70℃下反应1 h，加热挥发乙醇，最后得到水溶性羧基化纳米银颗粒。
合成后的水溶性羧基化纳米银颗粒（0.5 nmol/L）经透射电镜（JEOL 2100F）测定其粒径为10±0.7 nm。
实施例2水溶性纳米银颗粒抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体偶联物及纯化工艺
取5 mL商业化羧基化水溶性纳米银颗粒（浓度为50 nmol/L）与等体积pH 6.0的0.05 mol/L 硼酸盐缓冲液混合；分别加入与纳米银颗粒摩尔比为150：1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时；加入与纳米银颗粒摩尔比为10：1的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液，用1 M NaOH溶液调整溶液pH至7.5后，室温反应3小时；最后向溶液中加入终浓度为2%氨基葡萄糖，进一步用1 M HCl溶液调pH至4.5。18，000 rpm（约29，000 g）4℃离心30 min，弃上清夜，沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0～7.5）溶解即获得了不含游离抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的水溶性纳米银颗粒抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体偶联物。实验结果，本发明技术方案合成的水溶性纳米银颗粒抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体偶联物经2%氨基葡萄糖处理后，偶联物离心纯化的回收率为92.5%。
实施例3水溶性纳米银颗粒抗赭曲霉毒素单克隆抗体偶联物及纯化工艺
取5 mL商业化的羧基化水溶性纳米银颗粒（浓度为50 nmol/L）与等体积pH 6.0的0.05 mol/L 硼酸盐缓冲液混合；分别加入与纳米银颗粒摩尔比为150：1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时；加入与纳米银颗粒摩尔比为5：1的抗赭曲霉毒素单克隆抗体溶液，用1 M NaOH溶液调整溶液pH至8.0后，室温反应3小时；最后向溶液中加入终浓度为2.5%氨基葡萄糖，进一步用1 M HCl溶液调pH至4.5。18，000 rpm（约29，000 g）4℃离心30 min，弃上清夜，沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0～7.5）溶解即获得了不含游离抗赭曲霉毒素单克隆抗体的水溶性纳米银颗粒抗赭曲霉毒素单克隆抗体偶联物。本发明技术方案合成的水溶性纳米银颗粒抗赭曲霉毒素单克隆抗体偶联物经3%氨基葡萄糖处理后，偶联物离心纯化的回收率为91.4%。
实施例4 水溶性羧基纳米银颗粒抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体偶联物及纯化工艺
取5 mL商业化羧基化水溶性纳米银颗粒（浓度为50 nmol/L）与等体积pH 5.5的0.05 mol/L 硼酸盐缓冲液混合；分别加入与纳米银颗粒摩尔比为150：1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时；加入与纳米银颗粒摩尔比为3：1的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体溶液，用1 M NaOH溶液调整溶液pH至8.0～9.0后，室温反应3小时；最后向溶液中加入终浓度为3%氨基葡萄糖，进一步用1 M HCl溶液调pH至4.5。18，000 rpm（约29，000 g）4℃离心30 min，弃上清夜，沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0～7.5）溶解即获得了不含游离抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的水溶性纳米银颗粒抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体偶联物。实验结果，本发明技术方案合成的水溶性纳米银颗粒抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体偶联物经3%氨基葡萄糖处理后，偶联物离心纯化的回收率为90.7%。
实施例5 水溶性羧基纳米银颗粒抗恩诺沙星单克隆抗体偶联物及纯化工艺
取5 mL商业化羧基化水溶性纳米银颗粒（浓度为50 nmol/L）与等体积pH 6.0的0.05 mol/L 硼酸盐缓冲液混合；分别加入与纳米银颗粒摩尔比为150：1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时；加入与纳米银颗粒摩尔比为10：1的抗恩诺沙星单克隆抗体溶液，用1 M NaOH溶液调整溶液pH至8.0～9.0后，室温反应3小时；最后向溶液中加入终浓度为2.5%氨基葡萄糖，进一步用1 M HCl溶液调pH至4.5。18，000 rpm（约29，000 g）4℃离心30 min，弃上清夜，沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0～7.5）溶解即获得了不含游离抗恩诺沙星单克隆抗体的水溶性纳米银颗粒抗恩诺沙星单克隆抗体偶联物。实验结果，本发明技术方案合成的水溶性纳米银颗粒抗恩诺沙星单克隆抗体偶联物经2.5%氨基葡萄糖处理后，偶联物离心纯化的回收率为94.2%。
实施例6水溶性羧基纳米银颗粒抗盐酸克伦特罗单克隆抗体偶联物及纯化工艺
取5 mL商业化的羧基化水溶性纳米银颗粒（浓度为50 nmol/L）与等体积pH 6.0的0.05 mol/L 硼酸盐缓冲液混合；分别加入与纳米银颗粒摩尔比为150：1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时；加入与纳米银颗粒摩尔比为3：1的抗盐酸克伦特罗单克隆抗体溶液，用1 M NaOH溶液调整溶液pH至8.0～9.0后，室温反应3小时；最后向溶液中加入终浓度为3%氨基葡萄糖，进一步用1 M HCl溶液调pH至4.5。18，000 rpm（约29，000 g）4℃离心30 min，弃上清夜，沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0～7.5）溶解即获得了不含游离抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的水溶性纳米银颗粒抗盐酸克伦特罗单克隆抗体偶联物。实验结果，本发明技术方案合成的水溶性纳米银颗粒抗盐酸克伦特罗单克隆抗体偶联物经3%氨基葡萄糖处理后，水溶性纳米银颗粒抗盐酸克伦特罗单克隆抗体偶联物离心纯化的回收率为90.2%。
实施例7水溶性纳米银颗粒抗沙丁胺醇单克隆抗体偶联物及纯化工艺
取5 mL商业化的羧基化水溶性纳米银颗粒（浓度为50 nmol/L）与等体积pH 6.0的0.05 mol/L 硼酸盐缓冲液混合；分别加入与纳米银颗粒摩尔比为150：1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时；加入与纳米银颗粒摩尔比为10：1的抗沙丁胺醇单克隆抗体溶液，用1 M NaOH溶液调整溶液pH至8.0～9.0后，室温反应3小时；最后向溶液中加入终浓度为3%氨基葡萄糖，进一步用1 M HCl溶液调pH至4.5。18，000 rpm（约29，000 g）4℃离心30 min，弃上清夜，沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0～7.5）溶解即获得了不含游离抗沙丁胺醇单克隆抗体的水溶性纳米银颗粒抗沙丁胺醇单克隆抗体偶联物。实验结果，本发明技术方案合成的水溶性纳米银颗粒抗沙丁胺醇单克隆抗体偶联物经3%氨基葡萄糖处理后，偶联物离心纯化的回收率为95.3%。
实施例8 水溶性羧基纳米银颗粒抗孔雀石绿单克隆抗体偶联物及纯化工艺
取5 mL商业化羧基化水溶性纳米银颗粒（浓度为50 nmol/L）与等体积pH 6.0的0.05 mol/L 硼酸盐缓冲液混合；分别加入与纳米银颗粒摩尔比为150：1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时；加入与纳米银颗粒摩尔比为2：1的抗孔雀石绿单克隆抗体溶液，用1 M NaOH溶液调整溶液pH至8.0后，室温反应3小时；最后向溶液中加入终浓度为3%氨基葡萄糖，进一步用1 M HCl溶液调pH至4.5。18，000 rpm（约29，000 g）4℃离心30 min，弃上清夜，沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0～7.5）溶解即获得了不含游离抗孔雀石绿单克隆抗体的水溶性羧基纳米银颗粒抗孔雀石绿单克隆抗体偶联物。实验结果，本发明技术方案合成的水溶性纳米银颗粒抗孔雀石绿单克隆抗体偶联物经3%氨基葡萄糖处理后，偶联物离心纯化的回收率为90.6%。
实施例9 水溶性羧基纳米银颗粒抗莱克多巴胺单克隆抗体偶联物及纯化工艺
取5 mL商业化羧基化水溶性纳米银颗粒（浓度为50 nmol/L）与等体积pH 6.0的0.05 mol/L 硼酸盐缓冲液混合；分别加入与纳米银颗粒摩尔比为150：1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时；加入与纳米银颗粒摩尔比为10：1的抗莱克多巴胺单克隆抗体溶液，用1 M NaOH溶液调整溶液pH至8.5后，室温反应3小时；最后向溶液中加入终浓度为3%氨基葡萄糖，进一步用1 M HCl溶液调pH至4.5。18，000 rpm（约29，000 g）4℃离心30 min，弃上清夜，沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0～7.5）溶解即获得了不含游离抗莱克多巴胺单克隆抗体的水溶性羧基纳米银颗粒抗莱克多巴胺单克隆抗体偶联物。实验结果，本发明技术方案合成的水溶性纳米银颗粒抗莱克多巴胺单克隆抗体偶联物经3%氨基葡萄糖处理后，偶联物离心纯化的回收率为91.9%。
实施例10 水溶性羧基纳米银颗粒抗沙门氏菌单克隆抗体偶联物及纯化工艺
取5 mL商业化羧基化水溶性纳米银颗粒（浓度为50 nmol/L）与等体积pH 6.0的0.05 mol/L 硼酸盐缓冲液混合；分别加入与纳米银颗粒摩尔比为150：1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时；加入与纳米银颗粒摩尔比为10：1的抗沙门氏菌单克隆抗体溶液，用1 M NaOH溶液调整溶液pH至8.0～9.0后，室温反应3小时；最后向溶液中加入终浓度为3%氨基葡萄糖，进一步用1 M HCl溶液调pH至4.5。18，000 rpm（约29，000 g）4℃离心30 min，弃上清夜，沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0～7.5）溶解即获得了不含游离抗沙门氏菌单克隆抗体的水溶性羧基纳米银颗粒抗沙门氏菌单克隆抗体偶联物。实验结果，本发明技术方案合成的水溶性纳米银颗粒抗沙门氏菌单克隆抗体偶联物经3%氨基葡萄糖处理后，水溶性纳米银颗粒抗沙门氏菌单克隆抗体偶联物离心纯化的回收率为92.1%。
实施例11 水溶性羧基纳米银颗粒抗志贺氏菌单克隆抗体偶联物及纯化工艺
取5 mL商业化羧基化水溶性纳米银颗粒（浓度为50 nmol/L）与等体积pH 6.0的0.05 mol/L 硼酸盐缓冲液混合；分别加入与纳米银颗粒摩尔比为150：1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时；加入与纳米银颗粒摩尔比为10：1的抗志贺氏菌单克隆抗体溶液，用1 M NaOH溶液调整溶液pH至8.0～9.0后，室温反应3小时；最后向溶液中加入终浓度为3%氨基葡萄糖，进一步用1 M HCl溶液调pH至4.5。18，000 rpm（约29，000 g）4℃离心30 min，弃上清夜，沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0～7.5）溶解即获得了不含游离抗志贺氏菌单克隆抗体的水溶性羧基纳米银颗粒抗志贺氏菌单克隆抗体偶联物。实验结果，本发明技术方案合成的水溶性纳米银颗粒抗志贺氏菌单克隆抗体偶联物经3%氨基葡萄糖处理后，水溶性纳米银颗粒抗志贺氏菌单克隆抗体偶联物离心纯化的回收率为91.5%。
实施例12 水溶性羧基纳米银颗粒抗空肠弯曲菌单克隆抗体偶联物及纯化工艺
取5 mL商业化羧基化水溶性纳米银颗粒（浓度为50 nmol/L）与等体积pH 6.0的0.05 mol/L 硼酸盐缓冲液混合；分别加入与纳米银颗粒摩尔比为150：1的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时；加入与纳米银颗粒摩尔比为10：1的抗空肠弯曲菌单克隆抗体溶液，用1 M NaOH溶液调整溶液pH至8.0～9.0后，室温反应3小时；最后向溶液中加入终浓度为3%氨基葡萄糖，进一步用1 M HCl溶液调pH至4.5。18，000 rpm（约29，000 g）4℃离心30 min，弃上清夜，沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0～7.5）溶解即获得了不含游离抗空肠弯曲菌单克隆抗体的水溶性羧基纳米银颗粒抗空肠弯曲菌单克隆抗体偶联物。实验结果，本发明技术方案合成的水溶性纳米银颗粒抗空肠弯曲菌单克隆抗体偶联物经3%氨基葡萄糖处理后，水溶性纳米银颗粒抗空肠弯曲菌单克隆抗体偶联物离心纯化的回收率为93.2%。
Claims (9)
1.一种纯化水溶性纳米银颗粒鼠源性IgG类单抗偶联物方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将水溶性羧基修饰的纳米银颗粒活化，加入鼠源性IgG类单克隆抗体溶液，调整溶液pH至7.0～9.0后，偶联反应；（2）偶联反应结束后，溶液中加入氨基葡萄糖封闭偶联产物中纳米银颗粒表面残留的羧基，将反应溶液pH值调整至弱酸性；（3）高速离心，弃上清液，取沉淀。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）后，还有将沉淀用含25%甘油，0.01% NaN3的0.05 mol/L pH 7.0～7.5磷酸盐缓冲液溶解步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于水溶性纳米银颗粒为核壳结构的纳米银颗粒，壳层由双亲聚合物组成，外部为大量亲水羧基表面，内层为长链疏水基团通过与三辛基氧化磷的疏水作用将油溶性纳米银颗粒包裹在壳层内部。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）中活化为将水溶性羧基修饰的纳米银颗粒溶解于pH 5.0～6.0，0.05 mol/L硼酸盐缓冲液中，分别加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺，37℃反应2小时，活化纳米银颗粒羧基。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及N-羟基硫代琥珀酰亚胺与纳米银颗粒的摩尔比均为100～200：1，优选为150:1；所述鼠源性IgG类单克隆抗体与纳米银颗粒的摩尔比为1～10：1。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于偶联反应结束后，溶液中加入氨基葡萄糖至氨基葡萄糖终浓度为1.5～3%，充分混匀15～30分钟。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中将反应溶液pH值调整至弱酸性为将pH值调整至4.5～5.0，优选为5.0。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）所述高速离心离心力为28，000～30，000g。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述鼠源性IgG类单克隆抗体为抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体、抗赭曲霉毒素单克隆抗体、抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体、抗恩诺沙星单克隆抗体、抗盐酸克伦特罗单克隆抗体、抗沙丁胺醇单克隆抗体、抗孔雀石绿单克隆抗体、抗莱克多巴胺单克隆抗体、抗沙门氏菌单克隆抗体、抗志贺氏菌单克隆抗体、或抗空肠弯曲菌单克隆抗体。
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