CN103172941A - 聚苯乙烯荧光纳米颗粒及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚苯乙烯荧光纳米颗粒及其制备和应用，该颗粒是带有荧光物质的聚苯乙烯荧光纳米颗粒，其中，荧光物质，是通过稀土元素与β-二酮类物质以及三正辛基氧化磷反应，形成的鳌合物；其制法，包括：1)通过乳液聚合法、种子乳液聚合法或无皂乳液聚合法，合成聚苯乙烯纳米颗粒；2)在溶解有荧光物质的有机溶剂中，加入经有机溶剂溶胀的聚苯乙烯纳米颗粒，荧光物质通过扩散进入聚苯乙烯纳米颗粒内部后，去除有机溶剂。本发明的荧光纳米颗粒具有良好的单分散性和悬浮稳定性，非常适合应用于免疫层析检测。

Description

聚苯乙烯荧光纳米颗粒及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种聚苯乙烯纳米荧光颗粒及其制备和应用，特别是涉及一种长寿命的聚苯乙烯荧光纳米颗粒及其制备和在免疫层析中的应用。

背景技术

如何在不依赖大型仪器设备的条件下通过简单的操作实现快速、准确地定量分析，一直是免疫诊断领域研究的课题，这种需求促使各种能在患者身边进行的医学检验(POCT)产品不断推出。

目前，常规的免疫检测主要包括各种发光免疫分析(LIA)、放射免疫分析(RIA)和酶标免疫分析(EIA)。RIA和EIA均为成熟、稳定的免疫检测方法，直到现在，RIA和EIA仍在免疫诊断领域占有重要位置。但RIA所用标记物(常用¹²⁵I)的可检测性有限，很难实现超灵敏分析；其基于衰变的放射性行为也使其难以建立均相免疫分析方法；更主要的是，其较短的半衰期使RIA试剂难以长时间保存，加上其涉及放射性废物处理、不易实现自动化等缺点，RIA正逐渐被非放射免疫分析取代；EIA作为一种重要的非放射性免疫分析方法目前仍在广泛使用；基于OD值检测的EIA具有测量范围窄、分析灵敏度较低的缺点；而以酶为初始标记物、以化学发光或荧光物质为底物的酶放大发光免疫分析克服了以上缺点，但该方式需要一酶促反应；以化学发光物质为标记、以闪烁光检测为特点的LIA，由于其对光信号的引发和收集有严格的要求，对检测仪器的要求很高，目前还国产的这类发光测定仪市场上还没有；由于上述原因，近年来时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)发展迅速；TRFIA具有很高的分析灵敏度、宽阔的测量范围、优良的分析精密性和对多个待测物同时检测的能力，成为方法学上颇具优势的非放射免疫分析技术之一。尽管如此，所有上述常规免疫检测体系均要求使用大型的仪器设备，操作步骤比较复杂，检测成本较高，不适合在家庭、社区、急诊实验室和其它现场使用。

随着生活水平的提高，人们越来越关注自身的健康状况，许多适合于自测的待测物指标具有很大的市场需求，如排卵监测、糖化血红蛋白的测定，此外，一些适合于急诊的项目，如心脏标志物产品，传染病系列产品，毒品系列产品，也需要采用定量、快速、随机、操作简单的免疫检测模式；此类检测同样也适合于探矿、军事、食品以及社区和小型医院使用，这类检测通常称之为Point Of Care测试。

采用胶体金为标记的免疫层析是Point of Care测试的常用模式，目前此类产品多为定性检测，但越来越多的检测需要准确测定样本中的待测物浓度，如心肌梗塞标志物CTn-I(心肌肌钙蛋白I)、心脏功能评估标志物BNP(脑钠肽)等。福州大学的杜民、杨富文等通过分析影响金标记免疫层析定量的各种因素，如生化噪声、光噪声、电噪声等，建立了光谱峰曲线的数学表达模式，利用光电检测系统将纳米金免疫层析试条的色谱信号转换为光谱信号，实现了金标记免疫层析的定量检测(杜民，杨富文；基于光电检测与信息处理技术的纳米金免疫层析试条定量测试的研究，福州大学博士学位论文，2005/05)，但该方法检测的是纳米金产生的色谱信号，存在分析灵敏度较低、测量范围窄的缺点，该方法的测量范围一般小于二个数量级，而临床上有意义的待测物浓度范围往往在二个数量级以上，因此对于高浓度样本，使用该定量分析体系需要稀释样本，这不仅增加的操作步骤，还可能引入实验误差。此外，对于以纳米金为标记的定量/半定量免疫层析，已经报道的还有张慧、唐江萍等人发明的色带递减法免疫层析(中国专利公开号：CN 1381729A)，李文平、何湘蓉发明的半定量免疫层析(中国专利公开号：CN 1403818A)，和美国拜尔公司R.G索马发明的定量免疫层析检测方法(中国专利公开号：CN 1146557A)。

灵敏度低、测量范围窄是以纳米金为标记的定量/半定量免疫层析难以避免的弊端。以荧光纳米微粒为标记，通过检测荧光信号尤其是稀土离子鳌合物的长寿命荧光信号，将大大改善免疫层析检测的分析灵敏度和测量范围，该方法测量范围可达到三个以上数量级，可建立综合性能更优越的快速、定量Point of Care检测体系。

应用于生物分析领域的荧光纳米微粒包括无机高分子荧光纳米微粒和有机高分子荧光纳米微粒二类；其中，无机高分子荧光纳米微粒多以二氧化硅为载体，通过微乳液法或溶胶/凝胶法制备；基于此法制备的荧光纳米微粒已经用于临床检测、细胞或组织化学、显微成像等多个领域。公开号为CN1566954A、CN1493647A、CN1707246A、CN1645146A、CN1400467A、CN1707244A、CN101225306A以及公告号为CN1186634C的中国专利均涉及到此类无机高分子荧光纳米微粒的制备与应用；公开号为CN1566954A、CN1645146A的中国专利还叙述了这种无机二氧化硅荧光纳米微粒在免疫层析中的应用。

另一类荧光纳米微粒是以有机基质为骨架的有机高分子荧光纳米微粒(Harma H，Soukka Tand Lovgren T，Clinical Chemistry，2001，47，561-568；T.Soukka，J.Paukkunen，H.Harma，et al.Clinical Chemistry，2001；47，1269-1278)。有机高分子荧光纳米微粒一般通过乳液聚合、种子乳液聚合、无皂聚合等方式制备。同无机高分子荧光纳米微粒相比，有机高分子荧光纳米微粒在体外免疫诊断(如：免疫层析)上具有多方面的优点：

①可通过共聚合方式(如：苯乙烯与丙烯酸的共聚合)使乳胶微粒表面带有数量可调节的羧基。这些羧基不仅可以用于标记，而且对纳米乳胶微粒体系有很强的稳定作用，使纳米微粒能稳定地贮存于多种介质当中。而二氧化硅纳米微粒表面一般只带有少量-NH₂、-OH或-SH，其较弱的离子化作用或较弱的极性对纳米微粒的稳定作用比较有限。

②聚苯乙烯荧光纳米颗粒有很好的透光性，对紫外激发光无明显吸收和屏蔽效应，有利于纳米微粒荧光的有效激发。而对于二氧化硅纳米微粒，硅胶基质对紫外激发光有明显吸收，使微粒内包裹的荧光物质的激发减弱，降低了纳米微粒的荧光量子产率(袁景利，叶志强，谭明乾，王桂兰。一种功能性纳米试荧光探针及其应用，中国专利，公开日：2005年12月14日；公开号：CN 1707246A)。

③聚苯乙烯荧光纳米颗粒的内部为疏水性环境，对荧光物质，尤其是荧光易被水分子淬灭的稀土离子鳌合物，有显著的荧光保护作用，从而使处于微粒内部的荧光分子的荧光得以增强(Ullman EF，Kirakossian H，Singh S，et al.Proc.Nad.Acad.Sci.USA.1994，91，5426-5430)。而对于二氧化硅纳米微粒，硅胶基质与鳌合物之间存在相互作用，这种相互作用可进一步降低纳米微粒的荧光量子产率，使荧光强度减弱(袁景利，叶志强，谭明乾，王桂兰。一种功能性纳米试荧光探针及其应用，中国专利，公开日：2005年12月14日；公开号：CN 1707246A)。

④由于性状相似，聚苯乙烯荧光纳米颗粒与有机鳌合物荧光分子之间具有良好的相容性，通过有机溶剂做介质，有机鳌合物荧光分子就可以扩散到聚苯乙烯纳米微粒内部，制备稳定、强荧光的聚苯乙烯荧光纳米微粒。而对于二氧化硅纳介质包裹的荧光物质，在某些情况下易出现泄漏现象(段著华，王柯敏，谭蔚汉，等。高等学校化学学报，2003，24，255-259)。

⑤应用于免疫层析的聚苯乙烯荧光纳米颗粒(乳胶粒)，其在免疫层析试条上的迁移能力更强，层析带前端平整，层析行为优于无机高分子荧光纳米微粒，如二氧化硅纳米微粒。HarmaH、Ullman EF等报道了有机高分子荧光纳米微粒在常规非均相免疫分析和均相免疫分析中的应用(Ullman EF，Kirakossian H，Singh S，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1994，91，5426-5430；Harma H，Soukka T and Lovgren T，Clinical Chemistry，2001，47，561-568)，但目前尚未见该类荧光纳米微粒应用于免疫层析的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种长寿命的聚苯乙烯荧光纳米颗粒及其制备和在免疫层析中的应用。该荧光纳米颗粒具有良好的单分散性和悬浮稳定性，因此，非常适合应用于免疫层析上。本发明通过高分子乳胶颗粒合成、配基装填到乳胶颗粒内部、荧光纳米颗粒与生物蛋白(抗原或抗体)化学键结合，形成能应用于非均相时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)和时间分辨定量免疫层析检测。

为解决上述技术问题，本发明的长寿命的聚苯乙烯荧光纳米颗粒，是带有荧光物质的聚苯乙烯纳米颗粒，其中，荧光物质，是通过稀土元素与β-二酮类物质以及三正辛基氧化磷(TOPO)反应，形成的鳌合物。

所述聚苯乙烯纳米颗粒的粒径为10～500nm，该聚苯乙烯纳米颗粒的制备，是使用苯乙烯，与丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯或丙烯酰胺中的一种以上，通过乳液聚合、种子乳液聚合或无皂乳液聚合中的一种聚合方式，制备而成。

所述稀土元素，包括：Eu³⁺、Sm³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺。

所述β-二酮类物质，包括：1-萘-3-噻吩-1，3-丙二酮(简称NTPD)，1-苯-3-萘-1，3-丙二酮(简称PNPD)，1-苯-3-噻吩-1，3-丙二酮(简称PTPD)，1，3-二萘-1，3-丙二酮(简称NNPD)。

其中，NTPD结构式为：

其制备反应式如下：

上述NTPD的制备方法，是以2-乙酰噻吩和2-萘甲酸甲酯为母体，无水乙醚为溶剂，在氨基钠的作用下制得，包括步骤：

(1)在N₂保护下，混匀NaNH₂和甲苯，其中，NaNH₂在甲苯中的质量分数为40～55％；

(2)加入2-乙酰噻吩、2-萘甲酸甲酯，以无水乙醚为溶剂，经45～60℃加热回流，反应3～5h，其中，NaNH₂∶2-乙酰噻吩∶2-萘甲酸甲酯的摩尔比控制在1∶1∶1～4∶1∶1之间；无水乙醚的用量为：使得2-萘甲酸甲酯的浓度保持在5～15mg/mL之间；

(3)冷却至室温后，倒入冰碴，混匀，用浓盐酸调节pH＝7～8，收集乙醚层，并将水层用无水乙醚提取至无色，合并乙醚后，脱水，过滤乙醚，浓缩，结晶，即得；

另外，还可包括步骤：(4)经硅胶层析柱提纯后，再次结晶，得纯产物，纯度可在95％以上；其中，经硅胶层析柱提纯中，洗脱液为乙酸乙酯和石油醚，其体积比1∶30～1∶50。

PNPD结构式：

其制备反应式如下：

PNPD的制备方法如同NTPD的制法，但使用的原料改为NaNH₂∶2-乙酰萘∶苯甲酸甲酯的摩尔比控制在1∶1∶1～4∶1∶1之间，无水乙醚的用量为：使得苯甲酸甲酯的浓度保持在5～15mg/mL之间。

PTPD结构式：

其制备反应式如下：

PTPD的制备方法如同NTPD的制法，但使用的原料改为NaNH₂∶2-乙酰噻吩∶苯甲酸甲酯的摩尔比控制在1∶1∶1～4∶1∶1之间，无水乙醚的用量为：使得苯甲酸甲酯的浓度保持在5～15mg/mL之间。

NNPD结构式：

其制备反应式如下：

NNPD的制备方法如同NTPD的制法，但使用的原料改为NaNH₂∶2-乙酰萘∶2-萘甲酸甲酯的摩尔比控制在1∶1∶1～4∶1∶1之间，无水乙醚的用量为：使得2-萘甲酸甲酯的浓度保持在5～15mg/mL之间。

所述荧光物质，是由以下方法制备得到：

(1)将摩尔比3∶1.5～3∶2.5的β-二酮类物质和三正辛基氧膦，用丙酮溶解；其中，丙酮的用量为：使得β-二酮类物质的浓度保持在0.02～0.15g/mL之间；

(2)滴加稀土元素溶液到上述溶液中，其中，稀土元素与β-二酮类物质的摩尔比为1∶2.5～1∶3.5，调节溶液pH至6～7，室温下搅拌2～3小时，过滤，室温下静置待其析出后，洗涤，干燥，得产物。

另外，本发明还公开了一种长寿命的聚苯乙烯荧光纳米颗粒的制备方法，包括步骤：

(1)通过乳液聚合法、种子乳液聚合法或无皂乳液聚合法，合成聚苯乙烯纳米颗粒(纳米乳胶颗粒)，其中，

a)乳液聚合法，包括步骤：

除去阻聚剂的有机单体苯乙烯，与丙烯酸、甲基丙烯酸或丙烯酰胺中的一种，通过乳液聚合反应，其中，原料苯乙烯∶丙烯酸或甲基丙烯酸或丙烯酰胺∶SDS∶过硫酸钾的摩尔比为7∶0.3～1∶0.04∶0.5，在65～70℃，反应6～10小时，制备成粒径为10～100nm纳米的聚苯乙烯纳米颗粒；

b)种子乳液聚合法，包括步骤：

以a)制备的聚苯乙烯纳米颗粒为种子液，用除去阻聚剂的有机单体苯乙烯和甲基丙烯酸甲酯，与丙烯酸、甲基丙烯酸或丙烯酰胺中的一种，通过种子乳液聚合反应反应，其中，种子液的以克为单位的重量∶苯乙烯的摩尔数(mol)∶甲基丙烯酸甲酯的摩尔数∶丙烯酸或甲基丙烯酸或丙烯酰胺的摩尔数∶过硫酸钾的摩尔数为1～5∶0.07∶0～0.05∶0.005～0.02∶0.005，在65～70℃，反应15～25小时，制备成的粒径为50～250nm的聚苯乙烯纳米颗粒；

c)或无皂乳液聚合法，包括步骤：

除去阻聚剂的有机单体苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯，与丙烯酸、甲基丙烯酸或丙烯酰胺中的一种，通过无皂乳液聚合反应，其中，苯乙烯∶甲基丙烯酸甲酯∶丙烯酸或甲基丙烯酸或丙烯酰胺∶过硫酸氨的摩尔比为7～2∶2～5∶0.5～2∶0.5，在65～70℃，反应6～10小时，制备成粒径为200～500nm的聚苯乙烯纳米颗粒；

(2)在溶解有上述荧光物质的有机溶剂中，加入经有机溶剂溶胀的聚苯乙烯纳米颗粒，荧光物质通过扩散进入聚苯乙烯纳米颗粒内部，最后通过通氮气或旋转蒸发仪除去除有机溶剂，形成聚苯乙烯荧光纳米颗粒，其中，聚苯乙烯纳米颗粒∶荧光物质∶溶解荧光物质的有机溶剂的质量比1∶0.2～1∶200～600。

所述步骤(2)中，有机溶剂，包括：甲醇、丙酮、四氢呋喃。

再者，本发明还公开了一种长寿命的聚苯乙烯荧光纳米颗粒在免疫层析中的应用，包括步骤：

(a)用聚苯乙烯荧光纳米颗粒标记抗体、抗原或半抗原；

(b)把步骤(a)制备的标记有抗体、抗原或半抗原的聚苯乙烯荧光纳米颗粒制成用于免疫层析的检测卡；

(c)在检测卡加样孔内加样品，经免疫层析后，在时间分辨荧光扫描检测仪上检测层析结果(包括：内标控制线和检测线荧光信号)；

(d)根据时间分辨荧光扫描仪内IC卡信息，计算出样品中待测物浓度。

所述步骤(a)中，标记方法，包括步骤：

对于表面带羧基的聚苯乙烯荧光纳米颗粒，在MES缓冲液(pH6.8～7.2)中经碳二亚胺(EDC)活化，活化基团被N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(N-hydroxysulfosuccinimide Sodiumsalt)稳定，碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐的使用浓度为1～10mg/ml，室温活化20～40分钟后，离心除去没有反应的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，最后再与抗体、抗原或半抗原的氨基偶联反应；

对于表面带氨基的聚苯乙烯荧光纳米颗粒，使用体积浓度0.5～2％戊二醛，室温活化时间20～40分钟，再与抗体、抗原或半抗原的氨基偶联反应；

其中，聚苯乙烯荧光纳米颗粒∶抗体(或抗原或半抗原)的使用质量比为1～10∶1，室温偶联反应20～28小时。

本步骤中，荧光纳米颗粒与生物蛋白(抗体、抗原或半抗原)是采用化学键方式结合的，荧光纳米颗粒的羧基与生物蛋白的氨基通过肽键连接，在其形成肽键过程，需用碳二亚胺作为羧基活化剂，同时加入N-hydroxysulfosuccinimide Sodium salt稳定被碳二亚胺活化的羧基基团。活化的羧基基团被N-hydroxysulfosuccinimide Sodium salt稳定后，此基团仍不稳定，需迅速与生物蛋白偶联，因为活化有一定的寿命，其半衰期只有两到三小时。

所述步骤(b)中，检测卡的制备，包括步骤：

①把标记有抗体、抗原或半抗原的聚苯乙烯荧光纳米颗粒，用Bio-Dot机喷在处理过的聚酯膜(或玻纤、无纺布)上，制成标记物垫；

②把硝酸纤维素膜(NC膜)粘贴在PVC(聚氯乙烯)底板上，用Bio-Dot机把包被抗体(或抗原)喷或接触画线画到NC膜上，根据检测需要可在NC膜上设立多个检测带或检测区，实现多个待测物的同时检测；

③按层析方向，把样品垫(滤血垫)、标记垫、吸收垫(吸水纸)依次贴在粘过NC膜的PVC底板上，组装成大卡，用切割机切成试纸条，再把试纸条装在检测卡外壳内，组装成检测卡；

④通过复合多个检测单元，实现多个待测物的同时检测。

所述步骤①中，标记有抗体、抗原或半抗原的聚苯乙烯荧光纳米颗粒还可引入呈色物质使荧光纳米颗粒带有颜色，用于免疫层析检测卡时，既可用于定量分析，也能用于目测的定性检测。

所述步骤(c)中，免疫层析，包括步骤：

①在检测卡的加样孔内滴加样品，样品包括：全血、血清、血浆、尿液或其他体液，或经稀释的上述样品；

②样品溶解用的标记垫上标记有抗体、抗原或半抗原的聚苯乙烯荧光纳米颗粒，通过毛细作用在NC膜上进行层析，同时样品中待测物质与标记有抗体、抗原或半抗原的聚苯乙烯荧光纳米颗粒发生特异免疫反应；

③样品中待测物质与标记有抗体、抗原或半抗原的聚苯乙烯荧光纳米颗粒免疫反应形成复合物后，继续在NC膜上进行层析，经过检测线(或检测区)时，待测物与检测线处包被的抗体(或抗原)免疫反应，形成夹心反应；荧光纳米颗粒富积在该检测线(或检测区)上；

④检测卡试纸条上方的吸收垫提供层析动力使层析持续进行，直到层析结束。

所述步骤(d)中，时间分辨荧光扫描仪内IC卡信息是随产品检测卡出厂的产品信息，包括：此批产品的产品信息、内标质控线和检测线间距、检测物浓度与荧光信号的层析标准曲线、对照品荧光信号范围和浓度、时间分辨荧光扫描仪计算检测卡内检测线和内标控制线的荧光信号的方法信息。

所述步骤(d)中，计算出样品中待测物浓度的方法，包括步骤：

①对于检测卡在时间分辨扫描仪上检测得到的二维曲线图，根据IC卡信息做如下处理：

先对图形各点计算斜率，根据斜率变化找出内标质控峰，并计算出内标质控峰荧光信号，再根据目标峰和内标质控峰间距计算出目标峰荧光信号；

②根据IC卡提供的标准曲线方程，由内标质控峰荧光信号和目标峰荧光信号算出待测物浓度。

因此，本发明的长寿命的聚苯乙烯荧光纳米颗粒在免疫层析中的应用，包括：应用于时间分辨定量免疫层析检测和非均相时间分辨免疫检测。

其中，时间分辨定量免疫层析检测试剂盒主要用于心肌系列产品，如：FABP(心型脂肪酸结合蛋白)、CRP(C-反应蛋白)、cTnI(心肌肌钙蛋白I)、NT-proBNP(N端脑钠肽前体)和CK-MB(肌酸激酶)，此外还应用传染病系列产品，如乙肝五项检测、HIV抗体/P24抗原检测、丙肝、甲胎蛋白。

非均相时间分辨免疫检测产品，如：TSH(促甲状腺激素)、乙肝五项检测、HIV抗体/P24抗原检测、丙肝、甲胎蛋白。

由此，本发明还公开了一种聚苯乙烯荧光纳米颗粒的免疫层析检测试剂盒，包括：时间分辨定量免疫层析检测试剂盒、非均相时间分辨免疫检测试剂盒；

其中，时间分辨定量免疫层析检测试剂盒，包括：由标记有抗体、抗原或半抗原的聚苯乙烯荧光纳米颗粒制成的检测卡【检测卡的制备，可依照如上“所述的步骤(b)中，检测卡的制备”】，其中，抗体、抗原或半抗原，包括：

1)针对心肌系列的抗体、抗原或半抗原，其中，心肌系列，包括：心型脂肪酸结合蛋白、C-反应蛋白、心肌肌钙蛋白I、N端脑钠肽前体、肌酸激酶；

2)针对传染病系列的抗体、抗原或半抗原，其中，传染病系列，包括：乙肝、HIV、丙肝、甲胎蛋白；

非均相时间分辨免疫检测试剂盒，包括：由标记有抗体、抗原或半抗原的聚苯乙烯荧光纳米颗粒制成的检测卡，其中，抗体、抗原或半抗原，包括：

针对促甲状腺激素、乙肝、HIV、丙肝、甲胎蛋白的抗体、抗原或半抗原。

本发明根据合成的一组配基：1-苯-3-萘-1，3-丙二酮，1-苯-3-噻吩-1，3-丙二酮，1-萘-3-噻吩-1，3-丙二酮，1，3-二萘-1，3-丙二酮。这四种配基与三正辛基氧化磷和Eu³⁺利用配位键形成螯合物，这种螯合物就是一种在紫外光激发下，发射长寿命荧光的物质。四种配基形成的螯合物激发光峰值波长分别是368.5nm、370nm、385nm和379nm，发射光波长均是615nm±5nm。荧光寿命长分别是693us，691us，641us，661us。本发明通过把这几种配基与三正辛基氧化磷和Eu³⁺形成螯合物装填入聚苯乙烯纳米颗粒内部，形成一种长寿命、高亮度的聚苯乙烯荧光纳米颗粒。

把高亮度的荧光物质装填入聚苯乙烯纳米乳胶颗粒内，制成示踪检测探针，由于装填荧光物质(螯合物)是亲油性，需用有机溶剂来溶解荧光物质，装填后的纳米颗粒又需要保持其亲水性，保证荧光纳米颗粒在水溶液中的单分散性，因此装填过程中需要调整聚苯乙烯乳胶颗粒内外亲水和亲油结构，通过改变缓冲体系pH、温度和有机溶剂量，提高纳米颗粒内部亲油性和外部亲水性。

对于不同粒径的荧光纳米颗粒，由于其粒径大小不一样，其表面特性不一同，其装填配基的方式也不尽相同，这主要是由于荧光纳米颗粒的稳定性不同造成的。乳胶颗粒(聚苯乙烯纳米颗粒)表面(带羧基)是以离子形式存在的基团，在乳胶颗粒表面形成一层电荷。该电荷层的周围会吸附一层反电荷，从而在乳胶颗粒周围形成双电层结构，使乳胶粒之间由于静电斥力而难以接近并聚结，从而保持了乳胶颗粒的单分散性。

乳胶颗粒表面电荷密度(zeta)越大，稳定性越好；也就zeta电位越高，稳定性越好。当体系中离子强度增大时，粒子周围的zeta电位会下降，使体系趋于不稳定。正是如上原因，要求装填螯合物时，要考虑溶胀乳胶颗粒和溶解配基的有机溶液的极性和缓冲液离子强度。对不同粒径的乳胶颗粒其装填配基时一定控制好各自工艺条件。

同样对使用有机溶剂时，也应考虑溶剂极性对装填好的荧光纳米颗粒单分散性影响。因为极性强的有机溶剂也影响体系离子强度，从而影响荧光纳米颗粒表面的zeta电位，使荧光纳米颗粒的稳定性降低。一般情况下如能保持荧光纳米颗粒表面zeta绝对值不小于30mV时。荧光纳米颗粒就是稳定的。

本发明具有如下优点：

(1)本发明制备的长寿命、聚苯乙烯荧光纳米颗粒是使用稀土荧光材料，应用时间分辨荧光测定法，可消除各种散乱光和短寿命荧光对测定的影响，从而极大地提高测定灵敏度；

(2)使用聚苯乙烯乳胶微粒材料，由于内部是疏水性环境，保护聚苯乙烯荧光纳米颗粒内部疏水荧光物质(易被水分子淬灭的稀土离子鳌合物)，其外表有可控的羧基不仅可以用于标记，而且对荧光纳米乳胶颗粒体系具有良好的单分散性和悬浮稳定性；

(3)本发明使用的荧光材料是新的β-二酮类物质，包括：1-苯-3-萘-1，3-丙二酮(简称PNPD)，1-苯-3-噻吩-1，3-丙二酮(简称PTPD)，1-萘-3-噻吩-1，3-丙二酮(简称NTPD)，1，3-二萘-1，3-丙二酮(简称NNPD)；这些β-二酮类物质最适激发光波段在360到400纳米之间，荧光寿命长在650us左右，这种荧光纳米颗粒非常适合定量免疫层析，它所使用光源也是非常便宜的LED灯而不是氙灯；

(4)本发明以一种长寿命、聚苯乙烯荧光纳米微粒为检测探针，应用于定量免疫层析上，具有很高检测灵敏性和很高的检测范围，测量范围可达到三个以上数量级，所使用时间分辨扫描检测仪可参见CN100494988C，具有很好配套效果。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是实施例7的聚苯乙烯纳米颗粒的粒径分布图(美国Microtrac公司Nanotrac 150型)；

图2是NTPD配体的紫外-可见吸收光谱图(Unico UV-4802型，测试溶剂为无水甲醇)；

图3是NTPD配体的¹H-NMR测试谱图(Bruker AV500MHz型，测试溶剂为CDCl₃)；

图4是Eu[(NTPD)₃(TOPO)₂]在固体状态下的激发光谱和发射光谱(英国EdinburghInstruments公司FLS920型，激发和发射狭缝均为1.0nm)；

图5是Eu[(NTPD)₃(TOPO)₂]在固体状态下的荧光寿命谱图(英国Edinburgh Instruments公司FLS920型，以激发波长为385nm，发射波长为617nm测得)；

图6是Eu[(NTPD)₃(TOPO)₂]浸染的聚苯乙烯纳米颗粒的粒径分布图(美国Microtrac公司Nanotrac 150型)；

图7是本发明的检测卡试剂条示意图；

图8是实施例21中的检测结果线性回归直线图，其中，横坐标为浓度对数值，纵坐标为荧光面积对数值。

具体实施方式

实施例1：通过乳液聚合反应制备聚苯乙烯-丙烯酸纳米颗粒

步骤如下：

(1)在加有一粒搅拌子的圆底烧瓶内加入含0.4mmol SDS(十二烷基磺酸钠)10ml去离子水，通氮气保护；

(2)搅拌下加入70mmol苯乙烯(去除阻聚剂)和10mmol丙烯酸单体(去除阻聚剂)；

(3)逐渐升高反应温度至70℃，加入过硫酸钾(经过重结晶)5mmol，搅拌反应10小时；

(4)将反应体系冷却至室温；

(5)将产物置于0.45微米针头过滤器中过滤，超速离心机离心，转速60000rpm，离心50分钟，沉淀用100mM的碳酸氢钠缓冲液(pH9.0)溶解，贮存于4℃环境。

本实施例中合成的聚苯乙烯-丙烯酸纳米颗粒，其粒径在10～100nm。

实施例2：通过乳液聚合反应制备聚苯乙烯-甲基丙烯酸纳米颗粒

按照实施例1的方法进行，但将其中的丙烯酸单体(去除阻聚剂)改成3mmol甲基丙烯酸(去除阻聚剂)单体，反应温度改为68℃，搅拌反应改为6小时，其余不变，得到聚苯乙烯-甲基丙烯酸纳米颗粒。

实施例3：通过乳液聚合反应制备聚苯乙烯-丙烯酰胺纳米颗粒

按照实施例1的方法进行，但将其中的丙烯酸单体(去除阻聚剂)改成6mmol丙烯酰胺，反应温度改为65℃，搅拌反应改为8小时，其余不变，得到聚苯乙烯-丙烯酰胺纳米颗粒。

实施例4：通过无皂乳液聚合反应制备聚苯乙烯-丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯纳米颗粒

步骤如下：

(1)在加有一粒搅拌子的圆底烧瓶内加入10ml去离子水，通氮气保护；

(2)搅拌下加入70mmol苯乙烯(去除阻聚剂)、30mmol甲基丙烯酸甲酯(去除阻聚剂)和10mmol丙烯酸单体(去除阻聚剂)；

(3)逐渐升高反应温度至65℃，加入过硫酸铵(经过重结晶)5mmol，搅拌反应10小时；

(4)将反应体系冷却至室温；

(5)采用0.45微米针头过滤器过滤后，用高速离心机离心，15000rpm，离心40分钟，沉淀用100mM的碳酸氢钠缓冲液(pH9.0)溶解，并存放于4℃环境。

本实施例中合成的聚苯乙烯-丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯纳米颗粒，其粒径在200～500nm。

实施例5：通过无皂乳液聚合反应制备聚苯乙烯-甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯纳米颗粒

按照实施例4的方法进行，但将其中的苯乙烯(去除阻聚剂)改成20mmol，甲基丙烯酸甲酯(去除阻聚剂)改成50mmol，并将丙烯酸单体(去除阻聚剂)改成5mmol甲基丙烯酸(去除阻聚剂)单体，反应温度改为70℃，搅拌反应改为6小时，其余不变，得到聚苯乙烯-甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯纳米颗粒。

实施例6：通过无皂乳液聚合反应制备聚苯乙烯-丙烯酰胺-甲基丙烯酸甲酯纳米颗粒

按照实施例4的方法进行，但将其中的苯乙烯(去除阻聚剂)改成50mmol，甲基丙烯酸甲酯改成20mmol，并将丙烯酸单体(去除阻聚剂)改成20mmol丙烯酰胺，反应温度改为68℃，搅拌反应改为8小时，其余不变，得到聚苯乙烯-丙烯酰胺-甲基丙烯酸甲酯纳米颗粒。

实施例7：通过种子乳液聚合反应制备聚苯乙烯-丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯纳米颗粒

步骤如下：

(1)按实施例1的方法，取1g实施例1制备得到的聚苯乙烯-丙烯酸纳米颗粒产物，加入90ml去离子水，通氮气保护，同时搅拌下，加入70mmol苯乙烯(去除阻聚剂)、50mmol甲基丙烯酸甲酯(去除阻聚剂)、5mmol丙烯酸单体(去除阻聚剂)，溶胀一个晚上；

(2)逐渐升高反应温度至70℃，加入过硫酸钾(经过重结晶)5mmol，搅拌反应15小时；

(3)采用0.45微米过滤器过滤后，过滤后检测所制得的聚苯乙烯纳米颗粒，其粒径为102.4nm(见图1)，用高速离心机离心，15000rpm，离心50分钟，用100mM的碳酸氢钠缓冲液(pH9.0)溶解，并存放于4℃环境。

实施例8：通过种子乳液聚合反应制备聚苯乙烯-丙烯酸-甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯纳米颗粒

按照实施例7的方法进行，但将其中的聚苯乙烯-丙烯酸纳米颗粒产物改成5g，甲基丙烯酸甲酯(去除阻聚剂)改成20mmol，丙烯酸单体(去除阻聚剂)改成20mmol甲基丙烯酸(去除阻聚剂)，反应温度改为65℃，搅拌反应改为25小时，其余不变，得到聚苯乙烯-丙烯酸-甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯纳米颗粒。

本实施例中合成的纳米颗粒，其粒径在50～250nm。

实施例9：通过种子乳液聚合反应制备聚苯乙烯-丙烯酰胺纳米颗粒

按照实施例7的方法进行，但将其中的聚苯乙烯-丙烯酰胺纳米颗粒产物改成3g，甲基丙烯酸甲酯＝0，丙烯酸单体(去除阻聚剂)改成10mmol丙烯酰胺，反应温度改为70℃，搅拌反应改为20小时，其余不变，得到聚苯乙烯-丙烯酰胺纳米颗粒。

本实施例中合成的纳米颗粒，其粒径在50～250nm。

实施例10：NTPD的制备

具体制备方法如下：

1)在50mL的三口烧瓶中加入0.702g的NaNH₂，并加入0.81ml的甲苯(NaNH₂在甲苯中的质量分数为50％)，在N₂保护下捣碎片状的NaNH₂，使其成糊状。

2)然后，加入80mL的无水乙醚，搅拌分散，接着加入0.49mL 2-乙酰噻吩，继续搅拌分散，再加入0.838g 2-萘甲酸甲酯，装上冷凝管，45～60℃开始油浴加热回流，反应3h，停止反应，待反应液变凉后(冷却至室温后)，倒入20g冰碴中混匀，立即在搅拌下用浓盐酸调节pH＝7，用分液漏斗分离，收集乙醚层，下面水层用无水乙醚提取至无色，合并乙醚，用少量无水硫酸钙脱水，过滤乙醚，用旋转蒸发仪浓缩，结晶得粗产品。

3)经硅胶层析柱提纯后(洗脱液为乙酸乙酯和石油醚，体积比1∶35配制)，再次结晶，得纯产物1-萘-3-噻吩-1，3-丙二酮(NTPD)。该产物为黄色粉末，易溶于丙酮等有机溶剂。

对于上述制备的NTPD，采用Unico UV-4802型紫外分光检测仪，以无水甲醇为测试溶剂，得到NTPD配体的紫外-可见吸收光谱图，从该图中可看出，目标产物NTPD在368nm处出现了强吸收峰，说明该物质具有较大的共轭结构(见图2)。

经¹H-NMR测试谱图验证，该制备工艺可得到了纯的目标产物NTPD；经计算，产物主要以烯醇式结构为主，约占98％左右，而酮式结构约占2％左右(见图3)。

实施例11：PNPD的制备

按照实施例10的方法进行操作，但将其中的部分反应原料和反应条件，改成如下要求，其余按照实施例10进行，得到产物PNPD，纯度在95％以上：

1)NaNH₂在甲苯中的质量分数改为40％；

2)50℃开始油浴加热回流，反应5h，其中，乙醚的用量改为：使得苯甲酸甲酯的浓度保持在5mg/mL；将2-乙酰噻吩改成2-乙酰萘，2-萘甲酸甲酯改成苯甲酸甲酯，且NaNH₂∶2-乙酰萘∶苯甲酸甲酯的摩尔比为1∶1∶1；

3)用浓盐酸调节pH＝8；

4)经硅胶层析柱提纯中，洗脱液为乙酸乙酯和石油醚，体积比1∶30。

实施例12：PTPD的制备

按照实施例10的方法进行操作，但将其中的部分反应原料和反应条件，改成如下要求，其余按照实施例10进行，得到产物PTPD，纯度在95％以上：

1)NaNH₂在甲苯中的质量分数改为55％；

2)60℃开始油浴加热回流，反应4h，其中，乙醚的用量改为：使得苯甲酸甲酯的浓度保持在15mg/mL；将2-萘甲酸甲酯改成苯甲酸甲酯，且NaNH₂∶2-乙酰噻吩∶苯甲酸甲酯的摩尔比为2∶1∶1；

3)用浓盐酸调节pH＝7.5；

4)经硅胶层析柱提纯中，洗脱液为乙酸乙酯和石油醚，体积比1∶50。

实施例13：NNPD的制备

按照实施例10的方法进行操作，但将其中的部分反应原料和反应条件，改成如下要求，其余按照实施例10进行，得到产物NNPD，纯度在95％以上：

1)NaNH₂在甲苯中的质量分数改为45％；

2)55℃开始油浴加热回流，反应3.5h，其中，乙醚的用量改为：使得2-萘甲酸甲酯的浓度保持在10mg/mL；将2-乙酰噻吩改成2-乙酰萘，且NaNH₂∶2-乙酰萘∶2-萘甲酸甲酯的摩尔比为3∶1∶1；

3)用浓盐酸调节pH＝7.8；

4)经硅胶层析柱提纯中，洗脱液为乙酸乙酯和石油醚，体积比1∶40。

实施例14：Eu[(NTPD)₃(TOPO)₂]的制备

三(1-萘-3-噻吩-1，3-丙二酮)二(三正辛基氧膦)合铕(III)三元配合物，即Eu[(NTPD)₃(TOPO)₂]，结构式为

其具体制备方法如下：

称取440mg NTPD(实施例10制备)和420mg TOPO，称好后加入到4mL丙酮中搅拌溶解；待固体全部溶解后，保持搅拌，缓慢滴加1mL 0.5M的EuCl₃水溶液到上述溶液中；调节溶液pH至6～7，室温下搅拌2小时，过滤，室温下静置；待其析出后，丙酮洗涤，真空干燥，得黄色产物Eu[(NTPD)₃(TOPO)₂]。

图4为Eu[(NTPD)₃(TOPO)₂]在固体状态下的激发光谱和发射光谱，从谱图中可知Eu[(NTPD)₃(TOPO)₂]激发波长为383nm，发射波长为617nm，且该物质具有很强的荧光强度。

图5为Eu[(NTPD)₃(TOPO)₂]在固体状态下的荧光寿命谱图，经计算得知Eu[(NTPD)₃(TOPO)₂]的荧光寿命长为0.6410ms±0.0017，能够应用于时间分辨荧光分析领域。

实施例15：Sm[(PNPD)₃(TOPO)₂]的制备

按照实施例14的方法进行操作，但将其中的部分反应原料和反应条件，改成如下要求，其余按照实施例14进行，得到产物Sm[(PNPD)₃(TOPO)₂]：

1)将NTPD改成PNPD，且PNPD和TOPO的摩尔比为3∶1.5，丙酮的用量改为：使得PNPD的浓度保持在0.02g/mL；

2)EuCl₃改成SmCl₃，且SmCl₃与PNPD的摩尔比为1∶2.5；

3)调节溶液pH至6.5，室温下搅拌3小时。

实施例16：Tb[(PTPD)₃(TOPO)₂]的制备

按照实施例14的方法进行操作，但将其中的部分反应原料和反应条件，改成如下要求，其余按照实施例14进行，得到产物Tb[(PTPD)₃(TOPO)₂]：

1)将NTPD改成PTPD，且PTPD和TOPO的摩尔比为3∶2.5，丙酮的用量改为：使得PTPD的浓度保持在0.15g/mL；

2)EuCl₃改成Tb Cl₃，且Tb Cl₃与PTPD的摩尔比为1∶3.5；

3)调节溶液pH至7，室温下搅拌2.5小时。

实施例17：装填荧光物质到聚苯乙烯纳米颗粒内部

步骤如下：

将390微升实施例7制备的羧基功能化的聚苯乙烯纳米颗粒乳液(纳米颗粒干重30mg)(也可用实施例1-9的所有纳米颗粒)，加入到2毫升50mM pH8.2的硼酸缓冲溶液中，搅拌均匀后，加入5毫升丙酮，调节pH值约7，颗粒溶胀1小时后，加3毫升50mM pH8.2的硼酸缓冲溶液；将4～12毫升1.0mM Eu[(NTPD)₃(TOPO)₂](实施例14制备)丙酮溶液，分批加入到颗粒溶液中，控制体系pH值7～8，Eu[(NTPD)₃(TOPO)₂]丙酮溶液完全加完后搅拌过夜；反应结束后，溶液转移到圆底烧瓶中，旋转蒸发仪蒸除丙酮；除去丙酮的溶液15000rpm离心50分钟，去掉上清液，用MES缓冲液(pH6.8～7.2)稀释为2.5毫升，加入500微升浓度为1mg/mLSDS水溶液，超声粉碎6次，得到Eu[(NTPD)₃(TOPO)₂]浸染的纳米级羧基功能化聚苯乙烯颗粒——荧光颗粒，该荧光颗粒粒径经纳米粒度仪检测得知为145.9nm(见图6)，该荧光颗粒乳液浓度为15mg/mL。

制备好的荧光颗粒，采用ANYTEST-2000型时间分辨荧光检测仪(上海新波生物技术有限公司生产)检测时间分辨荧光强度(具体数值见表1)，测定条件为：激发波长385nm；接收波长615nm；迟延时间0.4ms；窗口时间0.4ms；循环时间1.0ms。由表1可知，该荧光颗粒具有很强的荧光强度。

表1时间分辨荧光强度的测定

实施例18对聚苯乙烯荧光纳米颗粒标记兔IgG(EDC法)

步骤如下：

(1)搅拌下，将1mL按照实施例17方法制备得到的荧光纳米颗粒(20mg)，在pH6.8～7.2的MES(0.1M)缓冲液稀释到5ml；

(2)加入10mg碳二亚胺(EDC)，10mg N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(N-hydroxysulfosuccinimide Sodium salt)搅拌溶解，室温反应30分钟；离心除去多余的EDC和N-hydroxysulfosuccinimide Sodium salt。用50mM硼酸缓冲液(pH8.2～9)洗三遍；

(3)加入2mg用50mM硼酸缓冲液(pH8.2～9)透析过的兔IgG(辛酸硫酸铵法纯化，自制)，搅拌均匀，室温反应24小时；

(4)反应结束后，封闭液((5g/L的BSA(牛血清白蛋白)、pH8.5的50mM的Tris缓冲液)封闭8～16小时，把没有反应的荧光纳米颗粒活化羧基用BSA封闭。然后用高速离心机离心，15000g，离心30分钟，用稀释液(含有5g/L的酪蛋白、5g/L的PVP、质量浓度0.2％叠氮钠的pH8.0的50mM的Tris缓冲液)溶解沉淀，4℃冷藏保存。

实施例19对聚苯乙烯荧光纳米颗粒标记兔IgG

1、EDC法

按照实施例18的方法进行，但采用碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐使用浓度为1或10mg/ml，进行活化20分钟后，与兔IgG的室温偶联反应改成20小时，且聚苯乙烯荧光纳米颗粒与兔IgG的质量比为1∶1，其他条件不变，最终得到聚苯乙烯荧光纳米颗粒标记的兔IgG。

2、戊二醛法

对于表面带氨基的聚苯乙烯荧光纳米颗粒，按照实施例19的方法进行，但使用体积浓度0.5～2％戊二醛，室温活化时间40分钟后，再与兔IgG室温偶联反应28小时，其中，聚苯乙烯荧光纳米颗粒∶兔IgG的使用质量比为10∶1，其他条件不变，最终得到聚苯乙烯荧光纳米颗粒标记的兔IgG。

实施例20采用非均相时间分辨免疫分析法检测HBsAg(乙肝表面抗原)

步骤如下：

①把包被HBsAg单克隆抗体三株(使用量1∶3∶2)(HBsAg单克隆抗体三株，苏州新波生物技术有限公司自制)，按抗体总的终浓度约2.5μg/ml加至0.1M pH9.5碳酸缓冲液中，形成包被液；

取微孔反应板，每孔加入上述包被液100μl，室温过夜，以包被机或洗板机吸干包被液，注入洗涤液(50mM的Tris，9g/L NaCl，质量浓度0.2％叠氮钠，质量浓度0.25％Tween-20)350μl/孔，立即吸干，重复2次；注入封闭液(50mM Tris缓冲液，5g/L的BSA，40g/L的蔗糖)200μl/孔，放37℃2小时；吸干封闭液，将板子放入甩干机甩干5分钟；放入37℃恒温箱1小时，取出；将干燥后反应板装入锡铂袋并热封，置于2-8℃保存备用。

②按实施例18的方法，标记羊抗HBsAg抗体(辛酸硫酸铵法纯化，自制)，标记结束后，稀释标记好抗体的荧光纳米颗粒，浓度至3μg/ml单抗量。

③配制校准液(含灭活HBsAg抗原)，浓度分别是0、0.2、1、5、25、150ng/ml。

④在包被微孔内，加入50μl步骤②制备的己稀释标记好的荧光纳米颗粒；分别吸取50μl校准液和待测血清样品，按顺序加入相应微孔，在室温(20～25℃)下，于慢档振摇30分钟。

⑤以洗涤液(50mM的Tris，9g/L NaCl，0.2％叠氮钠，0.25％Tween-20)洗涤各板条6次。洗涤后甩净液体，将板条在干净无尘的吸水纸上拍干。

⑥最后在时间分辨荧光检测仪(苏州新波公司生产AnyTest200)上检测结果。时间分辨荧光检测仪根据校准品浓度和检测荧光信号线性回归标准曲线，再根据标准曲线计算出待测样品浓度。

实施例21时间分辨定量免疫层析检测FABP(心型脂肪酸结合蛋白)

①把NC膜粘贴在PVC底板上，用Bio-Dot机器在NC膜上，喷己稀释至0.5mg/ml内标质控品线羊抗兔IgG(辛酸硫酸铵法纯化，自制)和己稀释至1.0mg/ml检测线FABP单克隆抗体(HyTest公司)，喷量1μl/cm，37℃烘制20小时；然后用封闭液(5g/L的BSA、质量浓度0.2～2％的聚乙烯醇PVA，pH7.5的10mM的磷酸盐缓冲液)封闭NC膜10～30分钟，用10mM磷酸缓冲液清洗NC膜10～30分钟，真空干燥2小时后备用。

②采用实施例18的标记方法，标记兔IgG(辛酸硫酸铵法纯化，自制)和标记FABP单克隆抗体(HyTest公司)，并分别稀释浓度0.1μg/ml和3μg/ml，用Bio-Dot机器在标记垫上喷标记物，喷量2.5μl/cm，37℃烘8小时；

③把吸水纸(吸收垫)、标记物垫、样品垫(滤血膜)依次(按图7检测卡试纸条示意图)粘在粘有NC膜的PVC底板上，组装成大卡，再用剪切机切割成5mm的试纸条，装配在塑料外壳内。

④配制校准液(含灭活FABP抗原)，浓度分别是0、4、10、25、100、300ng/ml。

⑤在装配好的检测卡加样孔内，加入100微升上述校准液，层析20分钟。再用时间分辨扫描检测仪(CN100494988C)检测，得到的检测结果线性回归直线如图8所示。

⑥根据步骤⑤得到的回归直线方程，检测样品(血清、血浆和全血)层析荧光信号，算出待测样品浓度。

实施例22时间分辨定量免疫层析检测HIV抗体/P24抗原检测

本实施例中的检测卡是二合一产品，对P24抗原检测是定量检测，对HIV抗体检测是定性检测。

检测步骤如下：

①把NC膜粘贴在PVC底板上，用Bio-Dot机器在NC膜上喷己稀释至0.5mg/ml内标质控品线羊抗兔lgG(辛酸硫酸铵法纯化，自制)、己稀释至0.25mg/ml第一检测线P24单克隆抗体(Wallic公司)和0.4mg/ml第二检测线HIV重组抗原(GP41和GP36重组抗原，上海宏炬生物有限公司)(如图7上NC膜上2条检测线，1条内标质控线)，喷量1μl/cm，37℃烘20小时；然后用封闭液(5g/L的BSA、0.2～2％的PVA，pH7.5的10mM的磷酸盐缓冲液)封闭NC膜10～30分钟，用10mM磷酸缓冲液清洗NC膜10～30分钟，真空干燥2小时后备用。

②采用实施例6的标记方法，标记兔IgG(辛酸硫酸铵法纯化，自制)、标记P24单克隆抗体(Wallic公司)和HIV重组融合抗原(上海宏炬生物有限公司)，并分别稀释浓度0.1μg/ml、3μg/ml和3μg/ml，用Bio-Dot机器在标记垫上喷标记物，喷量2.5μl/cm，37℃烘8小时；

③把吸水纸、标记垫、样品垫(滤血膜)依次(按图7检测卡试纸条示意图)粘在粘有NC膜的PVC底板上，组装成大卡，再用剪切机切割成5mm的试纸条，装配在塑料外壳内。

④配制校准液，P24抗原(含灭活P24抗原)浓度分别是0、5、15、40、100、300U/ml；HIV抗体(含灭活HIV抗体)配制接近检测线cut off值的弱阳性血清和中强阳性血清。

⑤在装配好的检测卡加样孔内，加入100微升校准液，层析20分钟。再用时间分辨扫描检测仪(CN100494988C)检测；P24抗原定量检测检测数据处理方式根据实施例21中的⑤和⑥方式处量。

HIV抗体定性检测，首先根据HIV抗体接近cut off值的弱阳性血清检测荧光信号，为判断阴性和阳性的分界点，大于为阳性，小于为阴性。

Claims (14)

1.一种聚苯乙烯荧光纳米颗粒，其特征在于：所述颗粒是带有荧光物质的聚苯乙烯纳米颗粒，其中，荧光物质，是通过稀土元素与β-二酮类物质以及三正辛基氧化磷反应，形成的鳌合物。

2.如权利要求1所述的颗粒，其特征在于：所述聚苯乙烯纳米颗粒的粒径为10～500nm；

聚苯乙烯纳米颗粒的制备，是使用苯乙烯，与丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯或丙烯酰胺中的一种以上，通过乳液聚合、种子乳液聚合或无皂乳液聚合中的一种聚合方式，制备而成。

3.如权利要求1所述的颗粒，其特征在于：所述稀土元素，包括：Eu³⁺、Sm³⁺、Tb³⁺、Dy³⁺；

所述β-二酮类物质，包括：1-萘-3-噻吩-1，3-丙二酮，1-苯-3-萘-1，3-丙二酮，1-苯-3-噻吩-1，3-丙二酮，1，3-二萘-1，3-丙二酮；

其中，1-萘-3-噻吩-1，3-丙二酮的结构式为：

其制备方法，包括步骤：

(1)在N₂保护下，混匀NaNH₂和甲苯，其中，NaNH₂在甲苯中的质量分数为40～55％；

(2)加入2-乙酰噻吩、2-萘甲酸甲酯，以无水乙醚为溶剂，经45～60℃加热回流，反应3～5h，其中，NaNH₂∶2-乙酰噻吩∶2-萘甲酸甲酯的摩尔比控制在1∶1∶1～4∶1∶1之间；无水乙醚的用量为：使得2-萘甲酸甲酯的浓度保持在5～15mg/mL之间；

(3)冷却至室温后，倒入冰碴，混匀，用浓盐酸调节pH＝7～8，收集乙醚层，并将水层用无水乙醚提取至无色，合并乙醚后，脱水，过滤乙醚，浓缩，结晶，即得；

1-苯-3-萘-1，3-丙二酮的结构式：其制备方法如同1-萘-3-噻吩-1，3-丙二酮的制法，但使用的原料改为NaNH₂∶2-乙酰萘∶苯甲酸甲酯的摩尔比控制在1∶1∶1～4∶1∶1之间，无水乙醚的用量为：使得苯甲酸甲酯的浓度保持在5～15mg/mL之间；

1-苯-3-噻吩-1，3-丙二酮的结构式：

其制备方法如同1-萘-3-噻吩-1，3-丙二酮的制法，但使用的原料改为NaNH₂∶2-乙酰噻吩∶苯甲酸甲酯的摩尔比控制在1∶1∶1～4∶1∶1之间，无水乙醚的用量为：使得苯甲酸甲酯的浓度保持在5～15mg/mL之间；

1，3-二萘-1，3-丙二酮的结构式：

其制备方法如同1-萘-3-噻吩-1，3-丙二酮的制法，但使用的原料改为NaNH₂∶2-乙酰萘∶2-萘甲酸甲酯的摩尔比控制在1∶1∶1～4∶1∶1之间，无水乙醚的用量为：使得2-萘甲酸甲酯的浓度保持在5～15mg/mL之间。

4.如权利要求1所述的颗粒，其特征在于：所述1-萘-3-噻吩-1，3-丙二酮的制备方法，还包括步骤：(4)经硅胶层析柱提纯后，再次结晶，得纯产物；

其中，经硅胶层析柱提纯中，洗脱液为乙酸乙酯和石油醚，其体积比1∶30～1∶50。

5.如权利要求1所述的颗粒，其特征在于：所述荧光物质，是由以下方法制备得到：

(1)将摩尔比3∶1.5～3∶2.5的β-二酮类物质和三正辛基氧膦，用丙酮溶解；其中，丙酮的用量为：使得β-二酮类物质的浓度保持在0.02～0.15g/mL之间；

(2)滴加稀土元素溶液到上述溶液中，其中，稀土元素与β-二酮类物质的摩尔比为1∶2.5～1∶3.5，调节溶液pH至6～7，室温下搅拌2～3小时，过滤，室温下静置待其析出后，洗涤，干燥，得产物。

6.如权利要求1所述的聚苯乙烯荧光纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(1)通过乳液聚合法、种子乳液聚合法或无皂乳液聚合法，合成聚苯乙烯纳米颗粒，其中，

a)乳液聚合法，包括步骤：

除去阻聚剂的有机单体苯乙烯，与丙烯酸、甲基丙烯酸或丙烯酰胺中的一种，通过乳液聚合反应，其中，原料苯乙烯∶丙烯酸或甲基丙烯酸或丙烯酰胺∶SDS∶过硫酸钾的摩尔比为7∶0.3～1∶0.04∶0.5，在65～70℃，反应6～10小时，制备成粒径为10～100nm纳米的聚苯乙烯纳米颗粒；

b)种子乳液聚合法，包括步骤：

以a)制备的聚苯乙烯纳米颗粒为种子液，用除去阻聚剂的有机单体苯乙烯和甲基丙烯酸甲酯，与丙烯酸、甲基丙烯酸或丙烯酰胺中的一种，通过种子乳液聚合反应反应，其中，种子液的以克为单位的重量∶苯乙烯的摩尔数∶甲基丙烯酸甲酯的摩尔数∶丙烯酸或甲基丙烯酸或丙烯酰胺的摩尔数∶过硫酸钾的摩尔数为1～5∶0.07∶0～0.05∶0.005～0.02∶0.005，在65～70℃，反应15～25小时，制备成的粒径为50～250nm的聚苯乙烯纳米颗粒；

c)或无皂乳液聚合法，包括步骤：

除去阻聚剂的有机单体苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯，与丙烯酸、甲基丙烯酸或丙烯酰胺中的一种，通过无皂乳液聚合反应，其中，苯乙烯∶甲基丙烯酸甲酯∶丙烯酸或甲基丙烯酸或丙烯酰胺∶过硫酸氨的摩尔比为7～2∶2～5∶0.5～2∶0.5，在65～70℃，反应6～10小时，制备成粒径为200～500nm的聚苯乙烯纳米颗粒；

(2)在溶解有权利要求1所述荧光物质的有机溶剂中，加入经有机溶剂溶胀的聚苯乙烯纳米颗粒，荧光物质通过扩散进入聚苯乙烯纳米颗粒内部后，去除有机溶剂，形成聚苯乙烯荧光纳米颗粒。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，有机溶剂，包括：甲醇、丙酮、四氢呋喃；

所述聚苯乙烯纳米颗粒∶荧光物质∶溶解荧光物质的有机溶剂的质量比1∶0.2～1∶200～600。

8.如权利要求1所述的聚苯乙烯荧光纳米颗粒在免疫层析中的应用，其特征在于，包括步骤：

(a)用聚苯乙烯荧光纳米颗粒标记抗体、抗原或半抗原；

(b)把步骤(a)制备的标记有抗体、抗原或半抗原的聚苯乙烯荧光纳米颗粒制成用于免疫层析的检测卡；

(c)在检测卡加样孔内加样品，经免疫层析后，在时间分辨荧光扫描检测仪上检测层析结果；

(d)根据时间分辨荧光扫描仪内IC卡信息，计算出样品中待测物浓度。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述步骤(a)中，标记方法，包括步骤：

对于表面带羧基的聚苯乙烯荧光纳米颗粒，在pH6.8～7.2MES缓冲液中，经碳二亚胺活化，活化基团被N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐稳定，碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐使用浓度为1～10mg/ml，活化20～40分钟后，离心除去没有反应的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，最后再与抗体、抗原或半抗原的氨基偶联反应；

对于表面带氨基的聚苯乙烯荧光纳米颗粒，使用体积浓度0.5～2％戊二醛，室温活化时间20～40分钟，再与抗体、抗原或半抗原的氨基偶联反应；

其中，聚苯乙烯荧光纳米颗粒∶抗体、抗原或半抗原的使用质量比为1～10∶1，室温偶联反应20～28小时。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述步骤(b)中，检测卡的制备，包括步骤：

①把标记有抗体、抗原或半抗原的聚苯乙烯荧光纳米颗粒，喷在聚酯膜、玻纤或无纺布上，制成标记物垫；

②把硝酸纤维素膜粘贴在聚氯乙烯底板上，把包被抗体或抗原喷至或接触画线画到硝酸纤维素膜上，并能根据检测需要，在硝酸纤维素膜上设立多个检测带或检测区，实现多个待测物的同时检测；

③按层析方向，把样品垫、标记垫、吸收垫依次贴在粘过硝酸纤维素膜的聚氯乙烯底板上，组装成大卡，用切割机切成试纸条，再把试纸条装在检测卡外壳内，组装成检测卡。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于：所述步骤①中，标记有抗体、抗原或半抗原的聚苯乙烯荧光纳米颗粒还能引入呈色物质，使荧光纳米颗粒带有颜色。

12.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述步骤(c)中，免疫层析，包括步骤：

①在检测卡的加样孔内滴加样品，样品包括：全血、血清、血浆、尿液或经稀释的上述样品；

②样品溶解用的标记垫上标记有抗体、抗原或半抗原的聚苯乙烯荧光纳米颗粒中，通过毛细作用在硝酸纤维素膜上进行层析，同时样品中待测物质与标记有抗体、抗原或半抗原的聚苯乙烯荧光纳米颗粒发生特异免疫反应；

③样品中待测物质与标记有抗体、抗原或半抗原的聚苯乙烯荧光纳米颗粒免疫反应形成复合物后，继续在硝酸纤维素膜上进行层析，经过检测线或检测区时，待测物与检测线处包被的抗体或抗原免疫反应，形成夹心反应；荧光纳米颗粒富积在该检测线或检测区上；

④检测卡试纸条上方的吸收垫提供层析动力使层析持续进行，直到层析结束。

13.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述步骤(d)中，时间分辨荧光扫描仪内IC卡信息，包括：产品信息、内标质控线和检测线间距、检测物浓度与荧光信号的层析标准曲线、对照品荧光信号范围和浓度、时间分辨荧光扫描仪计算检测卡内检测线和内标控制线的荧光信号的方法信息；

步骤(d)中，计算出样品中待测物浓度的方法，包括步骤：

①对于检测卡在时间分辨扫描仪上检测得到的二维曲线图，根据IC卡信息做如下处理：

先对图形各点计算斜率，根据斜率变化找出内标质控峰，并计算出内标质控峰荧光信号，再根据目标峰和内标质控峰间距计算出目标峰荧光信号；

②根据IC卡提供的标准曲线方程，由内标质控峰荧光信号和目标峰荧光信号算出待测物浓度。

14.如权利要求8所述的聚苯乙烯荧光纳米颗粒的免疫层析检测试剂盒，其特征在于：包括：时间分辨定量免疫层析检测试剂盒、非均相时间分辨免疫检测试剂盒；

其中，时间分辨定量免疫层析检测试剂盒，包括：由标记有抗体、抗原或半抗原的聚苯乙烯荧光纳米颗粒制成的检测卡，其中，抗体、抗原或半抗原，包括：

1)针对心肌系列的抗体、抗原或半抗原，其中，心肌系列，包括：心型脂肪酸结合蛋白、C-反应蛋白、心肌肌钙蛋白I、N端脑钠肽前体、肌酸激酶；

2)针对传染病系列的抗体、抗原或半抗原，其中，传染病系列，包括：乙肝、HIV、丙肝、甲胎蛋白；

非均相时间分辨免疫检测试剂盒，包括：由标记有抗体、抗原或半抗原的聚苯乙烯荧光纳米颗粒制成的检测卡，其中，抗体、抗原或半抗原，包括：

针对促甲状腺激素、乙肝、HIV、丙肝、甲胎蛋白的抗体、抗原或半抗原。

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