CN105628933A - 一种斑点荧光免疫渗滤测定古代羊毛织品的检测方法 - Google Patents

一种斑点荧光免疫渗滤测定古代羊毛织品的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及文物检测技术领域，公开了一种斑点荧光免疫渗滤测定古代羊毛织品的检测方法，包括：A)阳性对照I、阴性对照II和检测组III的制备；B)向I，II，III的硝酸纤维素膜（NC膜）滴加牛血清蛋白溶液；C)向I，III的NC膜滴加兔抗羊毛角蛋白抗体溶液；向II的NC膜滴加磷酸盐缓冲溶液；D)向I，III的NC膜滴加磷酸盐缓冲溶液进行洗涤；E)向I，II，III的NC膜滴加荧光标记山羊抗兔抗体溶液；F)向I，II，III的NC膜滴加磷酸盐缓冲溶液进行洗涤；G)紫外灯照射检测。本发明采用斑点荧光免疫渗滤的方法来检测古代羊毛织品，操作简单，成本低，灵敏度更高，反应时间短，检测精确性好。

Description

一种斑点荧光免疫渗滤测定古代羊毛织品的检测方法
技术领域
本发明涉及文物检测技术领域，尤其涉及一种斑点荧光免疫渗滤测定古代羊毛织品的检测方法。
背景技术
羊毛织品由羊毛编织而成，由于其优良的保暖性能，自古以来便广泛应用于北方地区。出土的羊毛织品是我国的宝贵遗产，但是羊毛作为一种蛋白质材料，在墓葬环境的酸、碱、盐、氧化剂、还原剂、卤素等条件下，具有一定的不稳定性而发生降解，以至于外观严重受到破坏而腐朽，肉眼根本无法识别。在检测文物样品时，文物样品是否完整以及成分是否复杂对常规检测方法的结果影响较大，给研究工作者带来了一定的困难。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种斑点荧光免疫渗滤测定古代羊毛织品的检测方法。本发明方法本采用斑点荧光免疫渗滤的方法来检测古代羊毛织品，操作简单，成本低，灵敏度更高，反应时间短，检测精确性好。
本发明的具体技术方案为：一种斑点荧光免疫渗滤测定古代羊毛织品的检测方法，步骤如下：
A)取三个塑料盒，分别在塑料盒盖子的中央打一个孔；在盖底填充两层吸水垫；在吸水垫上面放置一片硝酸纤维素膜；然后在其中两个塑料盒的硝酸纤维素膜上点加1-2mL浓度为0.5-3mg/L的羊毛角蛋白溶液，室温下晾干，将上述两个塑料盒标记为I和II，其中I为阳性对照，II为阴性对照；取文物样并将其在90-110倍质量的磷酸盐缓冲溶液中溶解1.5-2.5h，取80-100μL的上清液，将其点加在剩余的塑料盒的硝酸纤维素膜上，室温下晾干，标记为III。
B)向I，II，III的孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80-100μL浓度为0.5-1.5wt%的牛血清蛋白溶液。
C)向I，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80-100μL稀释后的兔抗羊毛角蛋白抗体溶液；向II孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80-100μL磷酸盐缓冲溶液。
D)向I，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80-100μL磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，共滴加三次。
E)向I，II，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80-100μL的已稀释100-400倍的荧光标记山羊抗兔抗体溶液。
F)向I，II，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80-100μL磷酸盐缓冲溶液进行洗涤；共滴加三次。
G)将I，II，III放置于波长为365nm的紫外灯下观察结果，I的硝酸纤维素膜上有荧光斑点出现，II的硝酸纤维素膜上没有荧光斑点出现；若III的硝酸纤维素膜上有荧光斑点出现，则说明检测的文物样是羊毛织品。
本发明可根据硝酸纤维素膜上是否出现荧光半点来对文物样是否含有羊毛角蛋白成分进行定性分析。本发明方法的检测步骤简单，检测时间短，检测结果快速，直观。
作为优选，所述塑料盒的规格为4×3×0.6cm，所述孔的直径为0.3-0.8cm。
作为优选，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.4。
作为优选，所述稀释后的兔抗羊毛角蛋白抗体溶液的浓度为0.01-0.02mg/mL。
作为优选，所述荧光标记山羊抗兔抗体溶液的制备方法如下：向每2.5-3.5mLpH为5.5的PBS缓冲液中依次加入0.14-0.16mg的荧光微球、2.6-2.8μL的现配的浓度为4-6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和8-12μL的浓度为1mg/mL的山羊抗兔抗体溶液，得到混合液，将所述混合液在室温下搅拌1.5-2.5h，用1wt%的牛血清蛋白溶液封闭25-35min后在8000-10000r/min、4℃条件下离心处理8-12min，移除上清液，将沉淀加入到体积为山羊抗兔抗体溶液1倍pH为5.5的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得荧光标记山羊抗兔抗体溶液。
上述方法制备的荧光标记山羊抗兔抗体溶液反应灵敏度高，反应时间短，检测精确性好。
作为优选，所述荧光微球为聚苯乙烯荧光微球，粒径为100-110nm，激发波长为365nm，发射波长为610nm。
作为优选，所述牛血清蛋白溶液的用量为混合液体积的1-1.2倍。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：采用斑点荧光免疫渗滤的方法来检测古代羊毛织品，操作简单，成本低，灵敏度更高，反应时间短，检测精确性好。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种斑点荧光免疫渗滤测定古代羊毛织品的检测方法，步骤如下：
A)取三个规格为4×3×0.6cm的塑料盒，分别在塑料盒盖子的中央打一个直径为0.55cm孔；在盖底填充两层吸水垫；在吸水垫上面放置一片硝酸纤维素膜；然后在其中两个塑料盒的硝酸纤维素膜上点加1.5mL浓度为1.75mg/L的羊毛角蛋白溶液，室温下晾干，将上述两个塑料盒标记为I和II，其中I为阳性对照，II为阴性对照；取文物样并将其在100倍质量的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中溶解2h，取90μL的上清液，将其点加在剩余的塑料盒的硝酸纤维素膜上，室温下晾干，标记为III。
B)向I，II，III的孔下面的硝酸纤维素膜上滴加90μL浓度为1wt%的牛血清蛋白溶液。
C)向I，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加90μL稀释后的浓度为0.015mg/mL的兔抗羊毛角蛋白抗体溶液；向II孔下面的硝酸纤维素膜上滴加90μLpH为7.4的磷酸盐缓冲溶液。
D)向I，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加90μLpH为7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，共滴加三次；
E)向I，II，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加90μL的已稀释250倍的荧光标记山羊抗兔抗体溶液。
上述荧光标记山羊抗兔抗体溶液的制备方法如下：向3mLpH为5.5的PBS缓冲液中依次加入0.15mg的聚苯乙烯荧光微球（粒径为105nm，激发波长为365nm，发射波长为610nm）、2.7μL的现配的浓度为5mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和10μL的浓度为1mg/mL的山羊抗兔抗体溶液，得到混合液，将所述混合液在室温下搅拌2h，用体积为混合液体积的1.1倍的1wt%的牛血清蛋白溶液封闭30min后在9000r/min、4℃条件下离心处理10min，移除上清液，将沉淀加入到体积为山羊抗兔抗体溶液1倍pH为5.5的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得荧光标记山羊抗兔抗体溶液。
F)向I，II，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加90μL的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤；共滴加三次。
G)将I，II，III放置于波长为365nm的紫外灯下观察结果，I的硝酸纤维素膜上有荧光斑点出现，II的硝酸纤维素膜上没有荧光斑点出现；检测结果为III的硝酸纤维素膜上有荧光斑点出现，则说明检测的文物样是羊毛织品。
实施例2
一种斑点荧光免疫渗滤测定古代羊毛织品的检测方法，步骤如下：
A)取三个规格为4×3×0.6cm的塑料盒，分别在塑料盒盖子的中央打一个直径为0.3cm孔；在盖底填充两层吸水垫；在吸水垫上面放置一片硝酸纤维素膜；然后在其中两个塑料盒的硝酸纤维素膜上点加1mL浓度为3mg/L的羊毛角蛋白溶液，室温下晾干，将上述两个塑料盒标记为I和II，其中I为阳性对照，II为阴性对照；取文物样并将其在90倍质量的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中溶解1.5h，取80μL的上清液，将其点加在剩余的塑料盒的硝酸纤维素膜上，室温下晾干，标记为III。
B)向I，II，III的孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80μL浓度为0.5wt%的牛血清蛋白溶液。
C)向I，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80μL稀释后的浓度为0.01mg/mL的兔抗羊毛角蛋白抗体溶液；向II孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80μLpH为7.4的磷酸盐缓冲溶液。
D)向I，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80μLpH为7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，共滴加三次；
E)向I，II，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80μL的已稀释400倍的荧光标记山羊抗兔抗体溶液。
上述荧光标记山羊抗兔抗体溶液的制备方法如下：向每2.5mLpH为5.5的PBS缓冲液中依次加入0.14mg的聚苯乙烯荧光微球（粒径为100nm，激发波长为365nm，发射波长为610nm）、2.6μL的现配的浓度为4mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和8μL的浓度为1mg/mL的山羊抗兔抗体溶液，得到混合液，将所述混合液在室温下搅拌1.5h，用体积为混合液体积的1倍的1wt%的牛血清蛋白溶液封闭25min后在8000r/min、4℃条件下离心处理8min，移除上清液，将沉淀加入到体积为山羊抗兔抗体溶液1倍pH为5.5的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得荧光标记山羊抗兔抗体溶液。
F)向I，II，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80μL的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤；共滴加三次。
G)将I，II，III放置于波长为365nm的紫外灯下观察结果，I的硝酸纤维素膜上有荧光斑点出现，II的硝酸纤维素膜上没有荧光斑点出现；检测结果为III的硝酸纤维素膜上没有荧光斑点出现，则说明检测的文物样不是羊毛织品或者羊毛含量低于所能检测的值。
实施例3
一种斑点荧光免疫渗滤测定古代羊毛织品的检测方法，步骤如下：
A)取三个规格为4×3×0.6cm的塑料盒，分别在塑料盒盖子的中央打一个直径为0.8cm孔；在盖底填充两层吸水垫；在吸水垫上面放置一片硝酸纤维素膜；然后在其中两个塑料盒的硝酸纤维素膜上点加2mL浓度为0.5mg/L的羊毛角蛋白溶液，室温下晾干，将上述两个塑料盒标记为I和II，其中I为阳性对照，II为阴性对照；取文物样并将其在110倍质量的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中溶解2.5h，取100μL的上清液，将其点加在剩余的塑料盒的硝酸纤维素膜上，室温下晾干，标记为III。
B)向I，II，III的孔下面的硝酸纤维素膜上滴加100μL浓度为1.5wt%的牛血清蛋白溶液。
C)向I，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加100μL稀释后的浓度为0.02mg/mL的兔抗羊毛角蛋白抗体溶液；向II孔下面的硝酸纤维素膜上滴加100μLpH为7.4的磷酸盐缓冲溶液。
D)向I，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加100μLpH为7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，共滴加三次；
E)向I，II，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加100μL的已稀释100倍的荧光标记山羊抗兔抗体溶液。
上述荧光标记山羊抗兔抗体溶液的制备方法如下：向每3.5mLpH为5.5的PBS缓冲液中依次加入0.16mg的聚苯乙烯荧光微球（粒径为110nm，激发波长为365nm，发射波长为610nm）、2.8μL的现配的浓度为6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和12μL的浓度为1mg/mL的山羊抗兔抗体溶液，得到混合液，将所述混合液在室温下搅拌2.5h，用体积为混合液体积的1.2倍的1wt%的牛血清蛋白溶液封闭35min后在10000r/min、4℃条件下离心处理12min，移除上清液，将沉淀加入到体积为山羊抗兔抗体溶液1倍pH为5.5的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得荧光标记山羊抗兔抗体溶液。
F)向I，II，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加100μL的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液进行洗涤；共滴加三次。
G)将I，II，III放置于波长为365nm的紫外灯下观察结果，I的硝酸纤维素膜上有荧光斑点出现，II的硝酸纤维素膜上没有荧光斑点出现；检测结果为III的硝酸纤维素膜上有荧光斑点出现，则说明检测的文物样是羊毛织品。
以上实施例中所述的羊毛角蛋白、山羊抗兔抗体溶液均为市售产品，所述的稀释前的兔抗羊毛角蛋白抗体溶液可以为市售产品，也可自制，方法如下：
A）配制6wt%的一硫酸氢钾水溶液，用饱和氢氧化钠溶液将一硫酸氢钾水溶液的pH调节为4.2。接着按1:50的浴比将羊毛添加到溶液中，在33℃下水浴震荡1h。然后取出羊毛并用蒸馏水水洗过滤直至水洗液pH值为7。将羊毛加入到其70倍质量的混合溶液B中，所述混合溶液B中亚硫酸氢钠的浓度为5wt%，尿素的浓度为6M，皂素的浓度为0.5wt%，十二烷基苯磺酸钠的浓度为0.8wt%。在100℃下反应4h后过滤，得到粗角蛋白溶液，将粗角蛋白溶液装入截留分子量为14000的透析袋中，将透析袋浸泡于50-100倍质量的去离子水中透析4.5天，每隔8h更换去离子水，得到纯净角蛋白溶液，冷冻干燥后制得羊角蛋白粉。
B）用生理盐水将上述制得的羊角蛋白粉配制成1mg/mL的角蛋白溶液，将角蛋白溶液与QuickAntibody-Rabbit5W佐剂按体积比1:1混合，得到免疫抗原液，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行初次免疫；在初次免疫后的第3、5周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫；在进行初次免疫后的第7、9周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行再加强免疫。在对兔子进行初次免疫、加强免疫以及再加强免疫过程中，每个注射点的注射量为100μL。当兔子血样中的抗体效价达到1:20000时，收集兔子血液。
C）将收集到的血液置于室温下凝固，然后将凝固血液置于37℃的温箱内放置30min，再置于4℃的冰箱中12h，使血块充分收缩并得到完全析出的粗抗血清；收集粗抗血清，在4℃环境中，在3000g条件下离心15min，取上清液即为抗血清，放置于-80℃储存备用。
D）将蛋白A填料与磷酸盐缓冲溶液按1.5g/6.5mL的配比混合，搅拌后抽真空23min，得到无气泡的蛋白A填料液；然后将6.5体积份的蛋白A填料液在无气泡条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱；用20体积份的浓度为0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60mL/h；用浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液将15体积份的抗血清稀释至20体积份，稀释后加入到蛋白柱中进行上样，重复上样一次；用30体积份的浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱再次清洗，清洗流速为60mL/h；用浓度为0.2mol/L、pH为3.0的甘氨酸溶液对抗体进行洗脱；洗脱后用0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗涤蛋白柱，制得兔抗羊毛角蛋白抗体。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (7)

1.一种斑点荧光免疫渗滤测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于步骤如下：
A)取三个塑料盒，分别在塑料盒盖子的中央打一个孔；在盖底填充两层吸水垫；在吸水垫上面放置一片硝酸纤维素膜；然后在其中两个塑料盒的硝酸纤维素膜上点加1-2mL浓度为0.5-3mg/L的羊毛角蛋白溶液，室温下晾干，将上述两个塑料盒标记为I和II，其中I为阳性对照，II为阴性对照；取文物样并将其在90-110倍质量的磷酸盐缓冲溶液中溶解1.5-2.5h，取80-100μL的上清液，将其点加在剩余的塑料盒的硝酸纤维素膜上，室温下晾干，标记为III；
B)向I，II，III的孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80-100μL浓度为0.5-1.5wt%的牛血清蛋白溶液；
C)向I，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80-100μL稀释后的兔抗羊毛角蛋白抗体溶液；向II孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80-100μL磷酸盐缓冲溶液；
D)向I，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80-100μL磷酸盐缓冲溶液进行洗涤，共滴加三次；
E)向I，II，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80-100μL的已稀释100-400倍的荧光标记山羊抗兔抗体溶液；
F)向I，II，III孔下面的硝酸纤维素膜上滴加80-100μL磷酸盐缓冲溶液进行洗涤；共滴加三次；
G)将I，II，III放置于波长为365nm的紫外灯下观察结果，I的硝酸纤维素膜上有荧光斑点出现，II的硝酸纤维素膜上没有荧光斑点出现；若III的硝酸纤维素膜上有荧光斑点出现，则说明检测的文物样是羊毛织品。
2.如权利要求1所述的一种斑点荧光免疫渗滤测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于，所述塑料盒的规格为4×3×0.6cm，所述孔的直径为0.3-0.8cm。
3.如权利要求1所述的一种斑点荧光免疫渗滤测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.4。
4.如权利要求1所述的一种斑点荧光免疫渗滤测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于，所述稀释后的兔抗羊毛角蛋白抗体溶液的浓度为0.01-0.02mg/mL。
5.如权利要求1或4所述的一种斑点荧光免疫渗滤测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于，所述荧光标记山羊抗兔抗体溶液的制备方法如下：向每2.5-3.5mLpH为5.5的PBS缓冲液中依次加入0.14-0.16mg的荧光微球、2.6-2.8μL的现配的浓度为4-6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和8-12μL的浓度为1mg/mL的山羊抗兔抗体溶液，得到混合液，将所述混合液在室温下搅拌1.5-2.5h，用1wt%的牛血清蛋白溶液封闭25-35min后在8000-10000r/min、4℃条件下离心处理8-12min，移除上清液，将沉淀加入到体积为山羊抗兔抗体溶液1倍pH为5.5的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得荧光标记山羊抗兔抗体溶液。
6.如权利要求5所述的一种斑点荧光免疫渗滤测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于，所述荧光微球为聚苯乙烯荧光微球，粒径为100-110nm，激发波长为365nm，发射波长为610nm。
7.如权利要求5所述的一种斑点荧光免疫渗滤测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于，所述牛血清蛋白溶液的用量为混合液体积的1-1.2倍。
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