CN101261271A - 苏丹红i免疫层析试纸检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苏丹红I免疫层析试纸检测方法。在检测试纸的被衬上依次粘贴有样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分及吸水部分。检测反应部分上面包被有苏丹红I多克隆抗体1～2条或检测用抗原1－2条作为检测线，同时还包被有抗第二种属动物蛋白的IgG 1条作为参考线。组合方式为1条检测线加1条参考线或2条检测线加1条参考线二种形式。该快速检测试纸在环境温度为4～40℃都可使用，适合于卫生、质监、海关、超市等单位对肉类等可能污染苏丹红I的食品进行快速检测。本发明具有特异性强、灵敏度高、能够实现半定量检测，且操作简单方便等有益效果。

Description

苏丹红I免疫层析试纸检测方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及食品中有害残留物的检测方法，特别是一种苏丹红I试纸检测方法。

背景技术

苏丹红为亲脂性偶氮化合物，主要包括I、II、III和IV四种类型。苏丹红由于具有鲜亮的红色而常被不法商家添加到食品中，以增加食品的外观新鲜度，吸引消费者，其中以苏丹红I(Sudan I)最为常见。苏丹红I的化学名称为1-苯基偶氮-2-萘酚(1-phenylazo-2-naphthalenol)，分子结构式为C₆H₅＝NC₁₀H₆OH，分子量248.28。苏丹红I在代谢过程中降解产生的中等毒性致癌物苯胺，引起中毒性肝病，长期摄入苯胺也可造成人体神经系统损害。我国《食品添加剂使用卫生标准》禁止在食品中使用苏丹红。

目前国内外对苏丹红I检测大多采用高效液相色谱法(HPLC)或液相色谱-质谱联用方法(LC-MS)。然而，应用HPLC或LC-MS时样品前处理烦琐，测定方法复杂，需受过专门训练的人员才能操作，而且存在着适用范围窄、设备昂贵、成本高等问题。目前本技术领域还没有一种特异性强、灵敏度高、能够实现半定量检测，且操作简单方便的检测方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种特异性强、灵敏度高、能够实现半定量检测，且操作简单方便，对样品经过简单处理即可检测的苏丹红I快速半定量试纸检测方法。

本发明的目的可通过以下技术方案来实现。

苏丹红I免疫层析试纸检测方法，其技术要点是：在试纸的被衬上依次贴有样液吸收部分和胶体金标记部分和检测反应部分和吸水部分，胶体金标记部分被标记的物质为第二种属动物蛋白与苏丹红I检测用抗原的混合物或第二种属动物蛋白与苏丹红I抗体的混合物；检测反应部分上面包被有苏丹红I抗体1-2条作为检测线，同时还包被有抗第二种属动物蛋白的IgG 1条作为参考线或包被有苏丹红I检测用抗原1-2条作为检测线，同时还包被有抗第二种属动物蛋白的IgG 1条作为参考线。

所述的苏丹红I检测用抗原为苏丹红I与载体物质形成的偶合物。

所述的载体物质，为蛋白质或蛋白质片段或合成多肽或半合成多肽或多糖。

所述的第二种属动物蛋白为非抗体来源动物的蛋白质。

所述的苏丹红I免疫层析试纸组合方式为1条检测线加1条参考线或2条检测线加1条参考线二种形式。各种组合形式的试纸，在试纸制备时通过调节检测线和参考线包被物的浓度，控制检测时检测线和参考线的显色深浅，并将其显色深浅或显色条数与标准物质浓度对应起来，达到半定量检测。

本发明中检测用抗原是指苏丹红I与载体物质明胶形成的偶合物，免疫用抗原是指苏丹红I与载体物质牛血清白蛋白(BSA)形成的偶合物。其中载体物质也可以选用其他大分子物质，如：血清白蛋白、球蛋白、脂蛋白、多聚氨基酸、葡聚糖、卵清白蛋白、匙孔血蓝蛋白等，但要求检测用抗原与免疫用抗原的载体无交叉免疫反应。第二种属动物蛋白指非抗体来源属动物的蛋白，例如，抗体为兔源性，则第二种属动物蛋白可以是卵清白蛋白、猪血清白蛋白等鸡、猪或其他非兔源性动物蛋白。

本发明所描述的试纸的各部分处理与功能如下：

被衬：为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。

样液吸收部分制备：将滤纸或玻璃纤维纸浸入pH7.0-8.4的PBS中2min，取出，80℃烘干或其他方式干燥，即作为样液吸收部分，检测时起吸收样品溶液的作用，便于样品溶液向上移动。

胶体金标记部分的制备：该部分起固定胶体金标记的抗原或抗体的作用。制备步骤包括胶体金溶液的制备、胶体金标记苏丹红I抗原或苏丹红I抗体、胶体金标记部分处理。

(1)胶体金溶液的制备：将氯金酸(HauCl₄)用超纯水配制成1％的母液，取1mL的母液，用超纯水定容至100mL，配成0.01％的溶液，加热至沸腾，加入1-5mL 1％的柠檬酸三钠水溶液，继续加热至出现透明的橙红色为止，即为胶体金溶液。

(2)胶体金标记苏丹红I抗原：将苏丹红I检测用抗原和第二种属动物蛋白分别用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)溶解稀释至2-4mg/mL，每100mL胶体金溶液加入1-3mL 2-4mg/mL的检测用抗原和1-1.5mL 2-4mg/mL第二种属动物蛋白震荡2min，用0.2mol/L的K₂CO₃调节pH至8.4，震荡5min，加入11％PEG-100002mL，震荡5min，8000-15000r/min离心15min，除去上清，将沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)复溶，以6000-13000r/min离心15min，除去上清，将沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)稀释500-2000倍，产物作为金标记苏丹红I抗原(GAg)。

(3)胶体金标记苏丹红I抗体：将苏丹红I单克隆抗体或多克隆抗体和第二种属蛋白分别用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)溶解稀释至2-4mg/mL，每100mL胶体金溶液加入1-3mL 2-4mg/mL的苏丹红I抗体和1-1.5mL 2-4mg/mL第二种属动物蛋白，震荡2min，用0.2mol/L的K₂CO₃调节pH至8.4，震荡5min，加入11％PEG-100002mL，震荡5min，8000-15000r/min离心15min，除去上清，将沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)复溶，以6000-13000r/min离心15min，除去上清，将沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)稀释500-2000倍，产物作为金标苏丹红I抗体(GAb)。

(4)胶体金标记部分处理：将GAg或GAb倒入一槽中，将玻璃纤维或滤纸浸入1min，取出，室温干燥后，即作为胶体金标记部分。

检测反应部分制备：用0.8％的戊二醛溶液或0.2％的碳二亚胺溶液浸泡硝酸纤维膜或醋酸纤维膜或尼龙膜30min，取出，37℃烘干，上边包被1-2条不同浓度的苏丹红I检测用抗原线或苏丹红I抗体线作为检测线，同时包被1条抗第二种属动物蛋白的IgG线作为参考线。当胶体金标记部分标记对象为苏丹红I抗体和第二种属动物蛋白时，检测线则包被苏丹红I检测用抗原；当胶体金标记部分标记对象为苏丹红I检测用抗原和第二种属蛋白时，检测线则包被苏丹红I抗体。检测线和参考线不能同时多于1条，组合线数2-4条。此即为检测反应部分，该部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。

吸水部分制备：将玻璃纤维纸或滤纸或吸水纸室温干燥后，即作为吸水部分。该部分主要作用在于将移动上来的多余的样品溶液吸收。

试纸组装：在背衬上依次粘贴样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分和吸水部分，即成苏丹红I检测试纸。

检测原理：检测原理因胶体金标记的对象不同，而稍有差异。

当胶体金标记部分标记对象为苏丹红I检测用抗原和第二种属动物蛋白时，如果样品中含有苏丹红I，样品溶液被试纸的样液吸收部分吸收并通过毛细作用上移，样品中的游离苏丹红I分子量小移动速度快，先到达检测线，先与检测线上包被的苏丹红I抗体结合，因检测线上包被的苏丹红I抗体只有特定的结合位点，而且样品中游离的苏丹红I结合能力比偶合态的苏丹红I检测用抗原强，于是胶体金标记的检测用抗原不能再被检测线上的苏丹红I抗体捕获，于是检测线无色，此即为阳性；如果样品中无苏丹红I，则胶体金标记的苏丹红I检测用抗原到达检测线后就被检测线上包被的苏丹红I抗体捕获，形成肉眼可见的红色，此即为阴性。无论样品中是否含有苏丹红I，胶体金标记的第二种属动物蛋白上移到达参考线时都可被参考线上包被的抗第二种属动物蛋白的IgG捕获形成肉眼可见的红色，此即为参考线。

当胶体金标记部分标记对象为苏丹红I抗体和第二种属动物蛋白时，如果样品中含有苏丹红I，样品溶液被试纸的样液吸收部分吸收并通过毛细作用上移到达胶体金标记部分，样品溶液中的苏丹红I与胶体金标记的苏丹红I抗体反应形成结合物，结合物继续上移倒检测线，因胶体金标记的苏丹红I抗体只有特定的结合位点，样品溶液中的苏丹红I与之结合后，检测线上的检测用抗原就不能再与胶体金标记的苏丹红I抗体结合，于是检测线无色，此即为阳性；当样品中没有苏丹红I时，胶体金标记的苏丹红I抗体到达检测线时被检测用抗原捕获，则形成肉眼可见的红色。无论样品中是否含有苏丹红I，胶体金标记的第二种属蛋白上移到达参考线时都可被参考线上包被的抗第二种属动物蛋白的IgG捕获形成肉眼可见的红色，此即为参考线。

以上两种方式的试纸，在试纸制备时通过调节检测线和参考线包被物浓度，控制检测时检测线和参考线的显色深浅，并将其显色深浅或显色条数与标准物质浓度对应起来，即可达到半定量检测目的。

本发明所具有的有益效果

(1)特异性强。该试纸特异性强，与苏丹红II、苏丹红III、苏丹红IV无交叉反应，也不识别其他植物色素。

(2)灵敏度高。本试纸条的最低检测下限为5μg/kg，低于我国国家质量监督检验检疫总局提出的苏丹红I的检测标准为10μg/kg。

(3)能够实现半定量检测。本试纸可根据检测线颜色与参考线颜色对比或根据检测线呈色条数达到半定量检测目的。

(4)操作简单方便。对肉类、辣椒粉等食品样品经过简单处理即可检测。本试纸不需专业培训，不需要任何复杂仪器设备，普通非专业人员即可检测。

附图说明

附图为本发明试纸的形状结构示意图。

附图中1为样液吸收部分、2为胶体金标记部分、3为检测反应部分、4为检测线、5为参考线、6为吸水部分。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步解释说明：

(1)1条检测线加1条参考线形式的试纸

检测线包被有浓度为0.1-30μg/mL的苏丹红I多克隆抗体或苏丹红I检测用抗原1条，宽1mm；参考线包被有浓度为0.1-30μg/mL的抗第二种属动物蛋白的IgG 1条，宽1mm；两条线之间间隔2-6mm。当检测线颜色与参考线颜色相同时，则样品为阴性；当检测线比参考线颜色浅时，则样品为阳性，浓度大于Aμg/kg，A为设定的检测线，可以是大于或等于10μg/kg的某一浓度。参考线始终显色，若参考线不显色，表明试纸失效。

(2)2条检测线加1条参考线形式的试纸

2条检测线包被有浓度为0.1～30μg/mL的苏丹红I多克隆抗体或苏丹红I检测用抗原，第2条检测线上包被物的浓度小于第1条检测线参考线包被物浓度；参考线包被有浓度为0.1～30μg/mL的抗第二种属动物蛋白的IgG，宽1mm；各条线之间间隔2-6mm。当两条检测线都呈现颜色时，则样品为阴性；当检测线第1条检测线呈色，第2条检测线不呈色时，则样品中苏丹红I浓度大于Aμg/kg，小于Bμg/kg；当两条检测线都不呈色时，样品中苏丹红I浓度大于Bμg/kg。A、B为设定的检测限，可以是大于或等于10μg/kg的某一浓度。参考线始终显色，若参考线不显色，表明试纸失效。

下面以2条检测线加1条参考线结合方式为例进一步说明：

苏丹红I偶合抗原合成

苏丹红I偶合抗原分为免疫用抗原和检测用抗原，前者用于免疫动物，后者用于抗体制备中抗体的检测和试纸制备中的胶体金标记或检测线包被。

免疫用抗原制备：苏丹红I的分子结构不具有和蛋白偶联的活性基团，所以合成带有羧基的苏丹红I是与载体蛋白偶联的基础，采用重氮法合成苏丹红I的衍生物，合成方法如下：称取20mg对氨基苯甲酸溶于10mL 2mmol/L的HCl，加入预冷1mol/L的NaNO₂ 200μL，冰上静置20min，溶液变为黄色，此溶液为A液。称取40mg 2-萘酚溶于8mL无水乙醇中，用1mol/L的NaOH调节pH至9.0，此溶液为B液。将冰上预冷的B液缓慢加到A液中，冰上反应30min以上，溶液转变为红色。红外扫描和薄层层析鉴定合成产物。冻干，获得苏丹红I衍生物。用混合酸酐法合成免疫抗原苏丹红I-BSA，具体步骤如下：称取10mg苏丹红I衍生物溶于0.2mol二氧六环，加入氯甲酸异丁酯7μL，18℃120r/min振摇40min，此为C溶液。另称取BSA40mg，溶于1.1mL硼酸缓冲液(pH9.0)-二氧六环(10∶1，v/v)混合液中，此为D溶液。将D溶液置磁力搅拌器上，于4℃下，将C溶液滴加入D溶液中，继续搅拌过夜，此反应液用蒸馏水透析3d。冻干后即可获得苏丹红I-BSA全抗原。

检测用抗原：用明胶代替BSA，采用与苏丹红I-BSA合成相同的步骤，将苏丹红I的衍生物与明胶偶联合成检测用抗原苏丹红I-明胶。

苏丹红I多克隆抗体的制备

选择体重2kg左右的雄性新西兰兔4只，应用免疫抗原苏丹红I-BSA，采用常规免疫程序免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体。具体步骤为：将制备的免疫抗原用1％盐水溶解，与等体积的完全弗氏佐剂充分乳化，使免疫抗原终浓度为2mg/mL。于兔子背部皮下注射，每只注射1mL。两周后，用不完全弗氏佐剂取代完全弗氏佐剂按上述同样方法乳化免疫抗原，乳化后于兔足掌皮下注射，每只注射1mL。以后每7天进行一次强化免疫，每次强化免疫采用不加任何佐剂的免疫抗原，所用免疫抗原的浓度为2mg/mL，用量为1mL，于兔足掌皮下注射。每次强化免疫前采用免疫沉淀实验检测抗体效价，至抗体效价不再继续升高时停止强化免疫，通常共进行5-7次强化免疫。最后一次强化免疫后第3天即可采用颈动脉取血法收集抗血清，辛酸-硫酸铵法纯化抗体，0.01mol/L PBS(pH7.2)透析直至透析外液与氯化钡反应无沉淀为止，加入终浓度为0.01％的叠氮钠，分装后于-70℃低温保存。

样液吸收部分处理

将滤纸或玻璃纤维纸等浸入0.1mol/L pH7.4的PBS中2min，取出80℃烘干或其他方式干燥，即成样液吸收部分。

胶体金标记部分的制备和处理

胶体金标记部分的制备和处理包括胶体金溶液制备、胶体金标苏丹红I抗体、胶体金标记部分处理。

胶体金溶液制备：将氯金酸(HAuCl₄)用超纯水配制成1％的母液，取1mL的母液，用超纯水定容至100mL，配成0.01％的溶液，加热至沸腾，加入一定量的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热到出现透明的橙红色为止，即为胶体金溶液。

胶体金标记苏丹红I多克隆抗体制备：取10mL胶体金溶液，加入10％的K₂CO₃溶液至pH7.4，然后加入120μL 3mg/mL的苏丹红I多克隆抗体，室温下磁力搅拌15min，加入终浓度为0.2％的聚乙二醇20000，继续搅拌直至溶解，然后置4℃冰箱2h，于4℃，15000r/min离心15min，在管底可以看见流动的金标抗体沉淀，弃上清，然后用稀释液(含8％蔗糖，0.05％Tween20，0.5％牛血清白蛋白的pH7.4的0.01mol/LPBS)将沉淀恢复到原体积，于4℃，15000rpm再次离心15min，弃上清，沉淀用上述稀释液1mL混匀，加入叠氮钠使终浓度为0.01％，放置在4℃冰箱备用。

胶体金标记部分处理：将金标苏丹红I多克隆抗体倒入一槽中，将玻璃纤维纸或滤纸浸入1min，取出，室温干燥，即成为胶体金标记部分。

2条检测线加1条参考线组合形式的试纸检测反应部分的处理

用0.8％的戊二醛溶液或0.2％的碳二亚胺溶液浸泡硝酸纤维膜30min，取出，37℃烘干，上边用喷涂机喷涂包被2条苏丹红I检测用抗原线作为检测线，靠近下端的浓度为2μg/mL，靠近上端的浓度为1μg/mL。包被1条羊抗兔免疫球蛋白的IgG线作为参考线，浓度为1μg/mL。即为检测反应部分，检测线和参考线组合形式为2条检测线+1条参考线。

吸水部分处理及试纸组装

将吸水纸室温干燥后，即作为吸水部分。

在被衬上依次粘贴样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分和吸水部分，即成组合形式为1条检测线加2条参考线的苏丹红I的快速检测试纸。

检测

肉制品：移去脂肪的20.00g肉制品样品捣碎，加入100mL乙腈，超声波处理(功率200W，频率20000Hz)15min。双层滤纸过滤，滤液用旋转蒸发器40℃旋转蒸干，用甲醇-PBS溶液(体积比为8∶2，PBS溶液浓度为1mol/L)2mL溶解残渣，所得溶液作为检测液。将试纸检测部分浸入检测液2min后取出，观察颜色。若2条检测线都呈现颜色，表明样品为阴性；若第1条检测线呈色，第2条不呈色，则表明样品中苏丹红I含量为5μg/kg以上；若第1条检测线与第2条检测线都不显色，则表明样品中苏丹红I含量为10μg/kg以上。无论样品中苏丹红I含量如何，参考线应该显色，若参考线不显色，表明试纸失效。

Claims (5)

1.苏丹红I免疫层析试纸检测方法，其特征在于：在试纸的被衬上依次贴有样液吸收部分和胶体金标记部分和检测反应部分和吸水部分，胶体金标记部分被标记的物质为第二种属动物蛋白与苏丹红I检测用抗原的混合物或第二种属动物蛋白与苏丹红I抗体的混合物；检测反应部分上面包被有苏丹红I抗体1～2条作为检测线，同时还包被有抗第二种属动物蛋白的IgG 1条作为参考线或包被有苏丹红I检测用抗原1-2条作为检测线，同时还包被有抗第二种属动物蛋白的IgG 1条作为参考线。

2.根据权利要求1所说的苏丹红I免疫层析试纸检测方法，其特征在于：苏丹红I检测用抗原为苏丹红I与载体物质形成的偶合物。

3.根据权利要求2所说的苏丹红I免疫层析试纸检测方法，其特征在于：所述的载体物质，为蛋白质或蛋白质片段或合成多肽或半合成多肽或多糖。

4.根据权利要求1所说的苏丹红I免疫层析试纸检测方法，其特征在于：所述的第二种属动物蛋白为非抗体来源动物的蛋白质。

5.根据权利要求1或5所述的苏丹红I免疫层析试纸检测方法，其特征在于：组合方式为1条检测线加1条参考线或2条检测线加1条参考线二种形式。各种组合形式的试纸，在试纸制备时通过调节检测线和参考线包被物的浓度，控制检测时检测线和参考线的显色深浅，并将其显色深浅或显色条数与标准物质浓度对应起来，达到半定量检测。

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