CN106568966A - 柠檬黄胶体金检测卡及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种柠檬黄胶体金检测卡，主要用于快速检测食品中是否非法及超量添加柠檬黄成分，该检测卡包括试剂条及包被有单抗的金标微孔，所述试剂条包括衬底、滤样纸、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸；滤样纸、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上；所述金标微孔中包被有胶体金标记的第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体，所述免疫硝酸纤维素膜上设有包被有柠檬黄‑牛血清白蛋白复合物的检测线和包被有抗第二种属动物蛋白的IgG作为质控线。本发明具有特异性强、灵敏性高、操作简单方便等有益效果，使用环境温度为4‑35℃，适合于个人及工厂、食品卫生质检部门、海关等进行食品中柠檬黄成分的快速检测。

Description

柠檬黄胶体金检测卡及其制备方法
技术领域
属于食品安全检测领域，具体涉及食品添加剂违规或超量添加的检测方法，特别是柠檬黄试纸检测方法。
背景技术
随着社会的进步，生活水平的提高，人民对食品色、香、味的要求也在不断提高，而各类色素等食品添加剂则能给食品“化妆”，使其迎合消费者的要求。
柠檬黄属水溶性合成色素，鲜艳的嫩黄色，单色品种。适量的柠檬黄可安全地用于食品、饮料、药品、化妆品、饲料、烟草、玩具、食品包装材料等的着色。中国允许使用的合成色素有苋菜红、胭脂红、柠檬黄、日落黄和靛蓝。它们分别用于果味水、果味粉、果子露、汽水、配制酒、红绿丝、罐头，以及糕点表面上彩等。这些合成色素的确把食品表面装扮的格外惹人喜爱，但是，它们禁止用于下列食品：肉类及其加工品(包括内脏加工品)、鱼类及其加工品、水果及其部分制品(包括果汁、果脯、果子冻和酿造果酒、调味品、婴幼儿食品、饼干等)。
按照中国的《食品添加剂使用卫生标准》规定，柠檬黄可用于果汁饮料、碳酸饮料、糖果、果冻等食物，但用量有严格限制。卫生执法人员介绍，人如果长期或一次性大量食用柠檬黄、日落黄等色素含量超标的食品，可能会引起过敏、腹泻等症状，当摄入量过大，超过肝脏负荷时，会在体内蓄积，对肾脏、肝脏产生一定伤害。常用的食品添加剂及着色剂酒石黄偶可引起多动。所以，GB 2760《食品添加剂使用卫生标准》对柠檬黄及其铝色淀在几类食品中的最大使用量均作出了明确的规定。
但是，仍有部分商家在利益的驱使下，非法添加、超量添加柠檬黄在食品中，甚至在馒头、肉制品及中药饮片中，因此，对市场上的部分食品进行柠檬黄检测，对协助政府监管，对保障人民食品安全都具有重要的意义。目前柠檬黄常见的测定方法主要是薄层层析法和液相色谱法等，但检验方法繁琐，检测时间长，只适用于专业技术人员在实验室操作，对于现场监管、执法，必须建立一种科学、准确、快速、简单的检测方法。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术的不足，提供一种柠檬黄胶体金检测卡，主要用于快速检测食品中是否超量或非法添加柠檬黄成分。
本发明采用的技术方案如下：一种柠檬黄胶体金检测卡，包括试剂条及包被有单抗的金标微孔，所述试剂条包括衬底、滤样纸、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸；所述滤样纸、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上；所述金标微孔中包被有胶体金标记的第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体，所述免疫硝酸纤维素膜上设有包被有柠檬黄-牛血清白蛋白复合物的检测线和包被有抗第二种属动物蛋白的IgG作为质控线，所述胶体金的颗粒大小为30nm，形状为圆形，均匀一致，颗粒清亮透明，无凝集。
所述抗第二种属动物蛋白的IgG，本专利具体为羊抗兔IgG。
所述的第二种属动物蛋白为非抗体来源动物的蛋白质，如牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白或人血清白蛋白的一种，本专利具体为牛血清白蛋白。
较优的，所述胶体金是由柠檬酸三钠还原法制备获得。
所述柠檬酸三钠还原法的步骤为：
制备浓度为0.01％的HAuCl4水溶液100ml，水浴或油浴至95-100℃，控制温度恒定，之后边搅拌边加入1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液1.80ml，继续搅拌加热20分钟左右，超声振荡(频率在20-30kHz)2-3分钟后冷却至4.0℃水浴中保持温度恒定，即制得30nm左右粒径的胶体金溶液；
其中，配置各种水溶液均采用双蒸或三蒸去离子水。
最优的，水浴或油浴温度为100℃。
最优的，1％柠檬酸三钠水溶液滴加速度为1-2滴/秒。
采用上述方法制得的胶体金清亮透明，粒径尺寸均一，无凝集颗粒，未发现非球形粒子。
所述第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体标记的方法为：用0.1mol/L的K2CO3水溶液调胶体金溶液的pH至8.0±0.05；将8-15μl 2mg/mL的特异性抗体溶液加入1ml步骤1)得到的胶体金溶液中并搅拌30分钟，然后加入10-20μl 10g/100ml的BSA水溶液并搅拌15min，然后加入10-30μl 10g/100ml的聚乙二醇20000水溶液并搅拌15分钟，然后4℃、4000r/min离心15min取上清液，然后4℃、10000r/min离心20分钟取沉淀，其中，所述特异性抗体为抗柠檬黄单克隆抗体。
所述金标微孔的制备为：用PBS缓冲液(pH7.2、2mM)溶解步骤2)得到的沉淀，4℃、10000r/min离心20分钟取沉淀，然后用200μl含1g/100ml BSA的PBS缓冲液(pH7.2、2mM)重悬沉淀，得到特异性抗体的胶体金标记物。
取微孔反应板，向每个孔中加入第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体的胶体金标记物20-30μl，然后将样品板放入冷冻干燥机中，预冻4h后冻干14h，得到微孔底部附着有第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体的胶体金标记物的金标微孔。其中，所述微孔反应板为类似ELISA微孔反应板。
本发明的另一目的是提供一种柠檬黄胶体金检测卡的制备方法，包括以下步骤：
1)柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
2)用步骤1)制备的胶体金，标记第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体，获得胶体金标记的第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体；
3)金标微孔的制备：稀释步骤2)获得的胶体金标记的第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体，得到免疫胶体金溶液，将所述免疫胶体金溶液加入到金标微孔中冻干，获得所需金标微孔；
4)将柠檬黄-牛血清白蛋白复合物和羊抗兔IgG分别喷在硝酸纤维素膜检测线(T线)和质控线(C线)的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；
5)将滤样纸、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得试剂条；
6)最后将试剂条装入塑料盒，即获得柠檬黄胶体金检测卡。
较优的，步骤4)中，喷在硝酸纤维素膜质控线(C线)上的羊抗兔IgG的浓度为0.3～0.5mg/ml，喷在硝酸纤维素膜检测线(T线)上的柠檬黄-牛血清白蛋白复合物浓度为0.3～0.5mg/ml。其中喷在硝酸纤维素膜质控线(C线)上的羊抗兔IgG的浓度≥喷在硝酸纤维素膜检测线(T线)上的柠檬黄-牛血清白蛋白复合物浓度。
较优的，每1m长硝酸纤维素膜分别包被有1ml的羊抗兔IgG和柠檬黄-牛血清白蛋白复合物溶液，检测线和质控线的间距为5.0mm。
本发明柠檬黄胶体金检测卡的工作原理为：利用高度特异的抗体-抗原特异性结合反应及免疫膜层析技术，通过免疫竞争抑制法来定性检测食品中出现的柠檬黄成分。
检测卡内的检测试剂条是实现柠檬黄检测的关键，在试剂条检测线(T线)包被了柠檬黄-牛血清白蛋白复合物；在试剂条的免疫胶体金纸片上固定有胶体金标记的抗柠檬黄单克隆抗体。当样品提取液从加样孔加入，渗透到试剂条的加样垫上，被检样本首先与玻璃纤维膜上的胶体金标记的柠檬黄单克隆抗体结合，并通过毛细作用继续层析至免疫硝酸纤维素膜，顺序通过免疫硝酸纤维素膜上喷点了柠檬黄-牛血清白蛋白复合物的检测线和喷点了羊抗兔IgG的质控线。如果样品提取液中含有柠檬黄，它们将与柠檬黄-牛血清白蛋白复合物竞争胶体金-抗柠檬黄抗体上有限的抗原结合位点，当柠檬黄浓度达到产品设计的阈值浓度以上时，它们将占据抗柠檬黄单克隆抗体上全部的抗原结合位点，这样就阻止了胶体金标记的抗柠檬黄单克隆抗体和检测线的柠檬黄-牛血清白蛋白复合物结合，检测线不能捕获到胶体金颗粒而无红色色带出现，检测结果呈阳性。如果样品提取液中没有柠檬黄或柠檬黄的浓度低于阈值浓度，则抗柠檬黄单克隆抗体-胶体金随同样品提取液运行至检测线，检测线捕获到胶体金颗粒而呈现红色色带，检测结果呈阴性。
在试剂条上的质控线(C线)包被有羊抗兔IgG，以指示检测卡反应系统工作是否正常。质控线的出现与柠檬黄的存在无关。质控线色带的出现表明：①样品加入量充足②样品在纸条上运行正常。
本发明检测卡样品处理方法是：取适量待测样品表皮或样本液体于容器中，加入适量纯净水，充分震荡混匀3min，待检；所述纯净水的体积可优选所取样品量的15～25倍，这样可以将样品中的柠檬黄充分提取或稀释至合适倍数。
胶体金试纸条的使用方法：
1.将检测卡放置在水平台面上。
2.用滴管吸取样品提取液，垂直滴加6滴(约150μl)于金标微孔中，2分钟后用滴管将微孔中的金和待检液体充分混匀，将金标微孔中的待检测液体全部转移到检测卡的加样孔中。
3.观察结果：在滴加样品后5-8分钟判读结果。
检测结果的判断方法：
阴性：在结果观察窗口内出现两条色带，即检测线(T线)和质控线(C线)位置各出现一条红色线条，表示样品中无柠檬黄存在。
阳性：只在结果观察窗口的质控线(C线)位置出现一条红色线条，检测线(T线)未出现任何线条，表示样品中有柠檬黄存在。
无效：质控线(C线)不出现。任何情况下，C线均应形成，表示加样和操作正确。C线未出现表明测试结果是不确定的，应重做。
本发明提供的柠檬黄胶体金检测卡具有特异性强、灵敏性高、操作简单方便等有益效果，使用环境温度为4-35℃，适合于个人及工厂、食品卫生质检部门、海关等进行食品中柠檬黄成分的快速检测。
附图说明
图1为本发明所述柠檬黄胶体金检测卡的结构示意图；
图中，1-试剂条1；2-金标微孔；11-滤样纸；12-检测线；13-质控线；14-免疫硝酸纤维素膜；15-吸水纸。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。
如图1所示，一种柠檬黄胶体金检测卡，包括试剂条1及包被有单抗的金标微孔2，所述试剂条包括衬底16、滤样纸11、免疫硝酸纤维素膜14和吸水纸15；所述滤样纸11、免疫硝酸纤维素膜14和吸水纸15依次首尾衔接并固定于所述衬底16上；所述金标微孔中包被有胶体金标记的第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体，所述免疫硝酸纤维素膜上设有包被有柠檬黄-牛血清白蛋白复合物的检测线12和包被有抗第二种属动物蛋白的IgG作为质控线13，所述胶体金的颗粒大小为30nm，形状为圆形，均匀一致，颗粒清亮透明，无凝集。
所述抗第二种属动物蛋白的IgG，本专利具体为羊抗兔IgG。
所述的第二种属动物蛋白为非抗体来源动物的蛋白质，如牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白或人血清白蛋白的一种，本专利具体为牛血清白蛋白。
较优的，所述胶体金是由柠檬酸三钠还原法制备获得。
实施例1：柠檬黄胶体金检测卡的制备；
1.胶体金的制备：柠檬酸三钠还原法：
制备浓度为0.01％的HAuCl4水溶液100ml，水浴或油浴至100℃，控制温度恒定，之后边搅拌边加入1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液1.80ml，继续搅拌加热20分钟左右，超声振荡(频率在25kHz)3分钟后冷却至4.0℃水浴中保持温度恒定，即制得30nm左右粒径的胶体金溶液；
其中，配置各种水溶液均采用双蒸或三蒸去离子水。
2.标记第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体的方法：
用0.1mol/L的K2CO3水溶液调胶体金溶液的pH至8.0；将10μl 2mg/mL的特异性抗体溶液(抗柠檬黄单克隆抗体)加入1ml第1步得到的胶体金溶液中并搅拌30分钟，然后加入10μl 10g/100ml的BSA水溶液并搅拌15min，然后加入10μl 10g/100ml的聚乙二醇20000水溶液并搅拌15分钟，然后4℃、4000r/min离心15min取上清液，然后4℃、10000r/min离心20分钟取沉淀。
3.金标微孔的制备方法：
用PBS缓冲液(pH7.2、2mM)溶解第2步得到的沉淀，4℃、10000r/min离心20分钟取沉淀，然后用200μl含1g/100ml BSA的PBS缓冲液(pH7.2、2mM)重悬沉淀，得到特异性抗体的胶体金标记物。
取微孔反应板(类似ELISA微孔反应板)，向每个孔中加入第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体的胶体金标记物30μl，然后将样品板放入冷冻干燥机中，预冻4h后冻干14h，得到微孔底部附着有第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体的胶体金标记物的金标微孔。
4.免疫硝酸纤维素膜的制备
4.1将羊抗兔IgG用磷酸盐缓冲液稀释成0.4mg/ml，制得质控线(C线)溶液。
4.2将柠檬黄-牛血清白蛋白复合物用磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为0.4mg/ml，制得检测线(T线)溶液。
4.3用点膜机喷点C、T线溶液，制得免疫硝酸纤维素膜。每1m长硝酸纤维素膜分别包被有1ml的C线和T线溶液，检测线和质控线的间距为5.0mm。
5.将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为4mm的试剂条(如图1所示)。
6.将检测试剂条装入塑料盒内即得检测检测卡。
本发明设计的柠檬黄胶体金检测卡的阈值为100μg/L。
实施例2：柠檬黄胶体金检测卡的灵敏度实验；
1.检测方法：
(1)取实施例1制备的柠檬黄胶体金检测卡，将检测卡放置在水平台面上。
(2)用加样吸管吸取样品，然后滴6滴(约150ul)样品到检测卡的加样孔中。每检测一份不同的样品使用不同的吸管。
(3)观察结果：在滴加样品后5-8分钟判读结果。
2.检测样品：
配置柠檬黄浓度为0μg/L，50μg/L，100μg/L，150μg/L，200μg/L的质控参考品作为样品，每个浓度重复3次。
3.检测结果：
浓度为0μg/L，50μg/L的样本均显示阴性，100μg/L，150μg/L，200μg/L的样本均显示阳性。本发明检测卡的检测灵敏度为100μg/L，该柠檬黄胶体金检测卡灵敏度符合检测要求。
实施例3：柠檬黄胶体金检测卡的特异性实验；
1.检测方法：
(1)取实施例1制得的柠檬黄胶体金检测卡，将检测卡放置在水平台面上。
(2)用加样吸管吸取用于检测交叉反应实验的检测样品，然后滴6滴(约150ul)样品到检测卡的加样孔中。每检测一份不同的样品使用不同的吸管。
(3)观察结果：在滴加样品后5-8分钟判读结果。
2.检测样品：
用不同浓度的碱性橙、碱性橙II、酸性橙I、酸性橙II、日落黄等对本发明的检测卡进行检测，观察是否发生交叉反应。
3.检测结果：
结果证实，本发明的检测卡对柠檬黄的检测不会受到碱性橙、碱性橙II、酸性橙I、酸性橙II、日落黄等类似色素的干扰，即本发明的柠檬黄胶体金检测卡在一定浓度下，不会与类似效果的染料产生交叉反应，特异性良好。
实施例4柠檬黄胶体金检测卡的重复性和稳定性实验
一、检测卡的批内和批间重复性实验
1.实验方法：
将同批和不同批次的柠檬黄胶体金检测卡分别检测0、50、100、150、200μg/L标准品，每个浓度重复3次，观察检测卡的重复性。
2.实验结果：经验证，柠檬黄胶体金检测卡的批内和批间重复性为100％，假阳性率和假阴性率均为0。
二、检测卡的稳定性实验
1.实验目的：
将柠檬黄胶体金检测卡密封保存，并存放于4℃及室温(25℃左右)下，观察不同存放温度对检测卡稳定性的影响。
2.实验方法：
保存于4℃的检测卡每10天取出4份次，分别检测0、50、100、150、200μg/L浓度的标准品；保存于室温(25℃)的检测卡每周取出4份次，分别检测0、50、100、150、200μg/L浓度的标准品。
3.实验结果：
经验证，试剂条在4℃下可保存18个月，在室温下可保存12个月，在可保存的期限内，检测卡均可达到100μg/L的检测灵敏度。

Claims (10)

1.柠檬黄胶体金检测卡，其特征在于：包括试剂条及包被有单抗的金标微孔，所述试剂条包括衬底、滤样纸、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸；所述滤样纸、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上；所述免疫硝酸纤维素膜上设有包被有柠檬黄-牛血清白蛋白复合物的检测线和包被有抗第二种属动物蛋白的IgG作为质控线，所述金标微孔中包被有胶体金标记的第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体，所述胶体金颗粒大小为30nm，形状为圆形，均匀一致，颗粒清亮透明，无凝集。
2.根据权利要求1所述的柠檬黄胶体金检测卡，其特征在于：所述每1m长硝酸纤维素膜分别包被有1ml的羊抗兔IgG和柠檬黄-牛血清白蛋白复合物溶液，检测线和质控线的间距为5.0mm。
3.根据权利要求1所述的柠檬黄胶体金检测卡，其特征在于：所述的抗第二种属动物蛋白的IgG为羊抗兔IgG。
4.根据权利要求1所述的柠檬黄胶体金检测卡，其特征在于：所述的第二种属动物蛋白为非抗体来源动物的蛋白质，包括牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白或人血清白蛋白中的一种，本专利具体为牛血清白蛋白。
5.一种如权利要求1-4任意一项所述的柠檬黄胶体金检测卡的制备方法，包括以下步骤：
1)利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
2)用步骤1)制备的胶体金标记第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体，获得胶体金标记的第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体；
3)制备金标微孔：稀释步骤2)获得的胶体金标记的第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体，得到免疫胶体金溶液，将免疫胶体金溶液加入到金标微孔中冻干，获得所需金标微孔；
4)将柠檬黄-牛血清白蛋白复合物和抗第二种属动物蛋白的IgG分别喷在硝酸纤维素膜检测线和质控线的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；
5)将滤样纸、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得试剂条；
6)将试剂条装入塑料盒，即获得柠檬黄胶体金检测卡。
6.如权利要求5所述的柠檬黄胶体金检测卡的制备方法，其特征在于：所述柠檬酸三钠还原法为：
首先制备浓度为0.01％的HAuCl4水溶液100ml，水浴或油浴至95-100℃，控制温度恒定，之后边搅拌边加入1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液1.80ml，继续搅拌加热20分钟左右，利用频率在20-30kHz超声振荡2-3分钟后冷却至4.0℃水浴中保持温度恒定，即制得30nm左右粒径的胶体金溶液；
其中，配置各种水溶液均采用双蒸或三蒸去离子水。
7.如权利要求6所述的柠檬黄胶体金检测卡的制备方法，其特征在于：所述1％柠檬酸三钠水溶液滴加速度为1-2滴/秒。
8.如权利要求5所述的柠檬黄胶体金检测卡的制备方法，其特征在于：所述步骤2)标记第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体的方法为：
用0.1mol/L的K2CO3水溶液调胶体金溶液的pH至8.0±0.05；将8-15μl 2mg/mL的特异性抗体溶液加入1ml步骤1)得到的胶体金溶液中并搅拌30分钟，然后加入10-20μl 10g/100ml的BSA水溶液并搅拌15min，然后加入10-30μl 10g/100ml的聚乙二醇20000水溶液并搅拌15分钟，然后4℃、4000r/min离心15min取上清液，然后在4℃、10000r/min条件下离心20分钟取沉淀，其中，所述特异性抗体为抗柠檬黄单克隆抗体。
9.如权利要求5所述的柠檬黄胶体金检测卡的制备方法，其特征在于：所述步骤3)金标微孔的制备为：
用pH7.2、2mM的PBS缓冲液溶解步骤2)得到的沉淀，在4℃、10000r/min的条件下离心20分钟取沉淀，然后用200μl含1g/100ml BSA的pH7.2、2mM的PBS缓冲液重悬沉淀，得到特异性抗体的胶体金标记物；
取微孔反应板，向每个孔中加入第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体的胶体金标记物20-30μl，然后将样品板放入冷冻干燥机中，预冻4h后冻干14h，得到微孔底部附着有第二种属动物蛋白和抗柠檬黄单克隆抗体的胶体金标记物的金标微孔，其中，所述微孔反应板为类似ELISA微孔反应板。
10.如权利要求5所述的柠檬黄胶体金检测卡的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，喷在硝酸纤维素膜质控线上的羊抗兔IgG的浓度为0.3～0.5mg/ml，喷在硝酸纤维素膜检测线上的柠檬黄-牛血清白蛋白复合物浓度为0.3～0.5mg/ml，其中喷在硝酸纤维素膜质控线上的羊抗兔IgG的浓度≥喷在硝酸纤维素膜检测线上的柠檬黄-牛血清白蛋白复合物浓度。
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