CN102590520A - Eddp胶体金检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及胶体金免疫层析领域，具体公开了一种EDDP胶体金检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于衬底上；所述免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的抗EDDP单克隆抗体，所述免疫硝酸纤维素膜上设有包被有EDDP-牛血清白蛋白复合物的检测线和包被有羊抗鼠IgG的质控线。本发明的EDDP胶体金检测试剂盒，具有具有特异性强、灵敏度高、简单快速、易于操作、结果容易判读，无需附加仪器设备等优点。

Description

EDDP胶体金检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及胶体金检测领域，具体涉及一种EDDP胶体金检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

美沙酮(methadone)为阿片类药物，在第二次世界大战时期由德国科学家合成，一般作为吗啡的代替药物用于癌症晚期等病人的镇痛治疗，其药物作用持续时间长、镇痛效力强、口服有效，在使用充分剂量时可以减少或消除依赖者对阿片类药物的渴求；与同类药物间具有交叉耐受性，使得随后使用的阿片类药物的作用降低或不能发挥作用。

然而，据有关调查显示，90％以上的美沙酮服用者会出现不良反应，不良反应的临床表现和发生率具体如下：

因此在实施美沙酮替代治疗时应特别慎重。定时对患者的尿液进行毒品含量检测，是比较有效的监测服用剂量的方法。目前，根据胶体金法、酶联免疫法、化学发光法等制备的美沙酮检测试剂盒因操作简单、判读快速、携带方便等优势已有广泛的应用。

人体内的美沙酮在肝脏内经生物转化后，发生去甲基化，大量形成无药理活性的吡咯啶(pyrrolidine)衍生物，主要为2-亚乙基-1，5-二甲基-3，3-二苯基吡啶烷(EDDP)，美沙酮主要以该种形式经粪便和尿排出，各种结构的美沙酮以原形排出的量仅为2.5％-6.0％，单纯对美沙酮进行检测易造成对服用量的不完全或错误估计。因此，开发一种快速、灵敏、特异性高的EDDP检测试剂盒，能提高美沙酮检测的准确度，对临床医生以及公安机关开展美沙酮药物滥用的监督检测起到重要的作用。

胶体金免疫层析技术是近年来发展起来的一种独特的免疫诊断技术，由于其具有特异性强、灵敏度高、简单快速、易于操作、结果容易判读，无需附加仪器设备等优点而被广泛应用。

发明内容

本发明的目的是从提高检测灵敏度出发，提供一种既方便又快速的EDDP(2-亚乙基-1，5-二甲基-3，3-二苯基吡啶烷)胶体金快速检测试剂盒。

本发明一方面公开了一种EDDP胶体金检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸；所述滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上；所述免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的抗EDDP单克隆抗体，所述免疫硝酸纤维素膜上设有包被有EDDP-牛血清白蛋白复合物的检测线和包被有羊抗鼠IgG的质控线。

较优的，所述胶体金的颗粒大小为39～42nm。

较优的，所述胶体金是由两步还原法制备获得。

更优的，所述两步还原法的步骤为：

a)第一次还原氯金酸溶液：制备浓度为0.0004-0.0005mol/L的HAuCl₄水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl₄与柠檬酸三钠的摩尔比为1∶8～9，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，即制得14～16nm粒径的胶体金原溶液；

b)第二次还原氯金酸溶液：将第一步制得的胶体金原溶液放置4.0℃水浴中保持温度恒定，随后按胶体金原溶液与HAuCl₄水溶液体积比1∶1.9～2.0加入4.0℃的0.003-0.004mol/LHAuCl₄水溶液，随后立即边搅拌边滴加4.0℃的抗坏血酸与PVP的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl₄的摩尔比为25～26∶1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl₄的重量比为1∶2.0～2.1，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，制得39-42nm粒径的胶体金溶液；

两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。

最优的，步骤a)中，加入柠檬酸三钠水溶液的浓度为0.01-0.02mol/L。

最优的，步骤a)中，超声震荡的频率为20-30KHZ。

最优的，步骤b)中，抗坏血酸与PVP的混合水溶液的滴加速度为1-2滴/s。

最优的，步骤b)中，所述抗坏血酸与PVP的混合水溶液中，抗坏血酸的浓度为0.017-0.019mol/L，PVP的浓度为0.137-0.139g/L。

步骤b)中，搅拌反应约为50-70分钟。

采用上述方法制得的胶体金清亮透明，粒径尺寸均一，无凝集颗粒，基本未发现非球形粒子。

较优的，所述免疫胶体金纸片是经过预处理的玻璃纤维纸，所述预处理的预处理液包括0.5～0.8v％Tween-20，12～18w/v％蔗糖，溶剂为水。

更优的，所述免疫胶体金纸片是经过预处理的玻璃纤维纸，所述预处理的预处理液包括0.7v％Tween-20，16w/v％蔗糖，溶剂为水。

本发明的另一方面，提供了一种EDDP胶体金检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)两步还原法制备胶体金；

2)用步骤1)制备的胶体金标记抗EDDP单克隆抗体，获得胶体金标记的抗EDDP单克隆抗体(免疫胶体金)；

3)免疫胶体金纸片的制备：预处理玻璃纤维纸；稀释步骤2)获得的胶体金标记的抗EDDP单克隆抗体，得到免疫胶体金溶液；用所述免疫胶体金溶液包被预处理过的玻璃纤维纸，获得免疫胶体金纸片；

4)将EDDP-牛血清白蛋白复合物和羊抗鼠IgG分别喷在硝酸纤维素膜检测线(T线)和质控线(C线)的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；

5)将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得试剂条；

6)最后将试剂条装入塑料盒，即获得EDDP胶体金检测试剂盒。

较优的，所述胶体金的颗粒大小为39～42nm，所述胶体金是由两步还原法制备获得。

更优的，所述两步还原法的步骤为：

a)第一次还原氯金酸溶液：制备浓度为0.0004-0.0005mol/L的HAuCl₄水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl₄与柠檬酸三钠的摩尔比为1∶8～9，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，即制得14～16nm粒径的胶体金原溶液；

b)第二次还原氯金酸溶液：将第一步制得的胶体金原溶液放置4.0℃水浴中保持温度恒定，随后按胶体金原溶液与HAuCl₄水溶液体积比1∶1.9～2.0加入4.0℃的0.003-0.004mol/LHAuCl₄水溶液，随后立即边搅拌边滴加4.0℃的抗坏血酸与PVP的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl₄的摩尔比为25～26∶1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl₄的重量比为1∶2.0～2.1，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，制得39-42nm粒径的胶体金溶液；

两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。

最优的，步骤a)中，加入柠檬酸三钠水溶液的浓度为0.01-0.02mol/L。

最优的，步骤a)中，超声震荡的频率为20-30KHZ。

最优的，步骤b)中，抗坏血酸与PVP的混合水溶液的滴加速度为1-2滴/s。

最优的，步骤b)中，所述抗坏血酸与PVP的混合水溶液中，抗坏血酸的浓度为0.017-0.019mol/L，PVP的浓度为0.137-0.139g/L。

步骤b)中，搅拌反应约为50-70分钟。

较优的，步骤2)中，胶体金标记的抗EDDP单克隆抗体的比例为：向胶体金中按照20μg抗体/(ml胶体金)的比例加入抗EDDP单克隆抗体，制备得到免疫胶体金(抗EDDP单克隆抗体-胶体金)。

较优的，所述步骤3)免疫胶体金纸片的制备为：

A.用喷金缓冲液稀释胶体金标记的抗EDDP单克隆抗体，获得OD₅₄₀值为1.5的免疫胶体金溶液；

B.用预处理液浸泡玻璃纤维纸，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂预处理后的玻璃纤维纸，干燥，制得免疫胶体金纸片。

本发明中，v％指体积百分比；w/v％指重量体积百分比，如1w/v％即为100ml溶液中含1g。

更优的，所述步骤A中的喷金缓冲液配方如下：8～12v％1.0M Tris液，0.2～0.4w/v％聚乙二醇20000，0.15～0.25w/v％牛血清白蛋白，0.1～0.3w/v％脱脂牛奶，0.25～0.35w/v％酪蛋白，和0.02～0.08w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.5±0.05，余量为水。

最优的，所述步骤A中的喷金缓冲液配方如下：10v％1.0M Tris液、0.3w/v％聚乙二醇20000、0.2w/v％牛血清白蛋白，0.2w/v％脱脂牛奶、0.3w/v％酪蛋白，和0.05w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.5±0.05，余量为水。

更优的，所述步骤B中的预处理液包括0.5～0.8v％Tween-20，12～18w/v％蔗糖，溶剂为水。

最优的，所述步骤B中的预处理液包括0.7v％Tween-20，16w/v％蔗糖，溶剂为水。

更优的，步骤B中，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸261mm×220mm，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每261mm×220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。

较优的，步骤4)中，喷在硝酸纤维素膜质控线(C线)上的羊抗鼠IgG的浓度为0.2～0.6mg/ml，喷在硝酸纤维素膜检测线(T线)上的EDDP-牛血清白蛋白复合物浓度为0.2～0.5mg/ml。

较优的，每1m长硝酸纤维素膜分别包被有1ml的羊抗鼠IgG和EDDP-牛血清白蛋白复合物溶液，检测线和质控线的间距为4.0～6.0mm。

本发明的创新在于免疫胶体金纸片制备步骤的工艺改进以及两步还原法制备分子大小均一的胶体金颗粒，其余步骤均可采用常规制备胶体金检测试剂条的条件进行。免疫胶体金纸片制备步骤中，通过采用合理配方对玻璃纤维膜进行预处理并采用较好的喷金缓冲液，在保障胶体金释放完全的基础上可有效减慢检测时免疫胶体金的释放层析，有利于抗原抗体充分反应结合，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本；采用的两步还原法，使得到的胶体金分子呈大小均一的40nm球形颗粒，由于胶体金颗粒大小适中、整体均一，使其与单克隆抗体的结合效率更高、效果更稳定。

本发明EDDP胶体金检测试剂盒的工作原理为：利用高度特异的抗体-抗原特异性结合反应及免疫膜层析技术，通过免疫竞争抑制法来定性检测人尿液中出现的2-亚乙基-1，5-二甲基-3，3-二苯基吡啶烷(EDDP)，进而提高美沙酮检测的准确度。

试剂盒内的检测试剂条是实现EDDP检测的关键，在试剂条检测线(T线)包被了EDDP-牛血清白蛋白复合物；在试剂条的免疫胶体金纸片上固定有胶体金标记的抗EDDP单克隆抗体。当尿液从加样孔加入，渗透到试剂条的加样垫上，被检样本首先与玻璃纤维膜上的胶体金标记的EDDP单克隆抗体结合，并通过毛细作用继续层析至免疫硝酸纤维素膜，顺序通过免疫硝酸纤维素膜上喷点了EDDP-牛血清白蛋白复合物的检测线和喷点了羊抗鼠IgG的质控线。如果尿液中含有EDDP，它们将与EDDP-牛血清白蛋白复合物竞争胶体金-抗EDDP抗体上有限的抗原结合位点，当EDDP浓度达到产品设计的阈值浓度以上时，它们将占据抗EDDP单克隆抗体上全部的抗原结合位点，这样就阻止了胶体金标记的抗EDDP单克隆抗体和检测线的EDDP-牛血清白蛋白复合物结合，检测线不能捕获到胶体金颗粒而无红色色带出现，检测结果呈阳性。如果尿液中没有EDDP或EDDP的浓度低于阈值浓度，则抗EDDP单克隆抗体-胶体金随同尿液运行至检测线，检测线捕获到胶体金颗粒而呈现红色色带，检测结果呈阴性。

在试剂条上的质控线(C线)包被有羊抗鼠IgG，以指示试剂盒反应系统工作是否正常。质控线的出现与EDDP的存在无关。质控线色带的出现表明：①样品加入量充足②样品在纸条上运行正常。

本发明试剂盒的使用方法为：

1.将试剂盒放置在水平台面上。

2.用加样吸管吸取尿样，然后滴3滴(约120ul)尿样到试剂盒的加样孔中。每检测一份不同的样品注意要使用不同的吸管。

3.观察结果：在滴加样品后5-10分钟判读结果。

检测结果的判断方法：

阴性：在结果观察窗口内出现两条色带，即检测线(T线)和质控线(C线)位置各出现一条红色线条，表示样品中无EDDP存在。

阳性：只在结果观察窗口的质控线(C线)位置出现一条红色线条，检测线(T线)未出现任何线条，表示样品中有EDDP存在。

无效：质控线(C线)不出现。任何情况下，C线均应形成，表示加样和操作正确。C线未出现表明测试结果是不确定的，应重做。

本发明的有益效果：本发明的EDDP胶体金检测试剂盒灵敏度高，可检出尿液中300ng/ml的EDDP；操作简单，检测结果肉眼可见，无需特殊实验仪器和专业技术人员；检测快速，5-10分钟内可显示检测结果；而且检测结果费用低廉，储存和运输方便等优点。

附图说明

图1：EDDP胶体金检测试剂盒的试剂条示意图(1.滤样纸 2.免疫胶体金纸片 3.免疫硝酸纤维素膜 4.吸水纸 5.检测线 6.质控线)

图2：胶体金透射电镜图

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。

实施例1EDDP胶体金检测试剂盒的制备

一、试剂来源：

抗EDDP单克隆抗体、羊抗鼠IgG多克隆抗体、EDDP-牛血清白蛋白复合物(EDDP-BSA)：购自美国美迪生物技术有限公司(MAXMED LABORATORIES INC.)

硝酸纤维素薄膜、玻璃纤维纸：购自德国赛多利斯公司(SARTORIUS)

二、试剂盒的制备

方法1：

1.胶体金的制备：两步还原法制备胶体金

a)第一次还原氯金酸溶液：将6ml 0.0164mol/L的HAuCl₄水溶液加入200ml双蒸水中，加热煮沸30分钟，之后缓慢搅动并准确加入50ml 0.016mol/L柠檬酸三钠水溶液。超声振荡2分钟后冷却至室温，超声震荡的频率为25KHZ，即制得约15nm粒径的胶体金原溶液。

b)第二次还原氯金酸溶液：取第一步制得的胶体金原核溶液26ml，并放置于4℃水浴锅中稳定温度，随后加入50ml预冷为4.0℃的0.0035mol/L HAuCl₄水溶液并立即缓慢滴加250ml预冷为4.0℃的含0.018mol/L的抗坏血酸与0.138g/L PVP的混合水溶液，滴加速度为1-2滴/s，搅拌反应1小时，溶液呈透明的酒红色，即制得40nm粒径的胶体金溶液。

制备好的胶体金颗粒通过透射电镜观察，结果显示，所制备的胶体金颗粒分散性好，粒径大小均一，为40nm左右(说明书附图图2)。

2.免疫胶体金的制备

2.1将抗EDDP单克隆抗体用0.1M pH 7.8的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为1.0mg/ml的抗体溶液。

2.2取1000ml的胶体金溶液，往里加入1/10倍胶体金体积的0.1M pH 7.8磷酸盐缓冲液混合3分钟。在快速搅拌下，再缓缓将稀释的抗EDDP单克隆抗体溶液20ml加入其中。室温反应5分钟并不时缓缓搅拌。

2.3反应结束后，在上述反应液中快速加入20ml的10wt％的牛血清白蛋白(BSA)溶液，室温反应5分钟并不时缓缓搅拌。

2.4将制备好的免疫胶体金8000转/min离心20分钟，保留沉淀，并收集上清10000转/min离心30分钟，弃上清。收集两次离心沉淀用含有0.1wt％BSA的硼酸缓冲液复溶到OD₅₄₀在13。

3.免疫胶体金纸制备

3.1预处理液的制备：准确称取7ml Tween-20，160g蔗糖，加纯化水定容至1000ml。

3.2喷金缓冲液的制备：取800ml纯化水，往里加入100ml 1.0M Tris液，用盐酸调节pH至8.5。准确称取3.0g聚乙二醇20000、2.0g牛血清白蛋白，2.0g脱脂牛奶，3.0g酪蛋白溶液和0.5g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均匀，加纯化水至总体积1000ml。

3.3用喷金缓冲液稀释胶体金标记的抗EDDP单克隆抗体，至溶液OD₅₄₀值为1.5，获得免疫胶体金溶液。

3.4用预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸261mm×220mm，浸泡30min后，37℃下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每261mm×220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。

4.免疫硝酸纤维素膜的制备

4.1将羊抗鼠IgG用磷酸盐缓冲液稀释成0.4mg/ml，制得质控线(C线)溶液。

4.2将EDDP-牛血清白蛋白复合物用磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为0.35mg/ml，制得检测线(T线)溶液。

4.3用点膜机喷点C、T线溶液，制得免疫硝酸纤维素膜。每1m长硝酸纤维素膜分别包被有1ml的C线和T线溶液，检测线和质控线的间距为6.0mm。

5.将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为4mm的试剂条(如图1所示)。

6.将检测试剂条装入塑料盒内即得检测试剂盒。

本发明设计的EDDP胶体金检测试剂盒的阈值为300ng/ml。

方法2：

1.胶体金的制备：参考实施例1方法1的步骤。

2.免疫胶体金的制备：参考实施例1方法1的步骤。

3.免疫胶体金纸制备

3.1预处理液的制备：准确称取5ml Tween-20，120g蔗糖，加纯化水定容至1000ml。

3.2喷金缓冲液的制备：取800ml纯化水，往里加入120ml 1.0M Tris液，用盐酸调节pH至8.5。准确称取2.0g聚乙二醇20000、1.5g牛血清白蛋白，3.0g脱脂牛奶，

2.5g酪蛋白溶液和0.8g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均匀，加纯化水至总体积1000ml。

3.3用喷金缓冲液稀释胶体金标记的抗EDDP单克隆抗体，至溶液OD₅₄₀值为1.5，获得免疫胶体金溶液。

3.4用预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸261mm×220mm，浸泡25min后，37℃下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每261mm×220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。

4.免疫硝酸纤维素膜的制备：

4.1将羊抗鼠IgG用磷酸盐缓冲液稀释成0.2mg/ml，制得质控线(C线)溶液。

4.2将EDDP-牛血清白蛋白复合物用磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为0.5mg/ml制得检测线(T线)溶液。

4.3用点膜机喷点C、T线溶液，制得免疫硝酸纤维素膜。每1m长硝酸纤维素膜分别包被有1ml的C线和T线溶液，检测线和质控线的间距为4.0mm。

5.将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为5mm的试剂条。

6.将检测试剂条装入塑料盒内即得检测试剂盒。

本发明设计的EDDP胶体金检测试剂盒的阈值为300ng/ml。

方法3：

1.胶体金的制备：参考实施例1方法1的步骤。

2.免疫胶体金的制备：参考实施例1方法1的步骤。

3.免疫胶体金纸制备

3.1预处理液的制备：准确称取8ml Tween-20，180g蔗糖，加纯化水定容至1000ml。

3.2喷金缓冲液的制备：取800ml纯化水，往里加入80ml 1.0M Tris液，用盐酸调节pH至8.5。准确称取4.0g聚乙二醇20000、2.5g牛血清白蛋白，1.0g脱脂牛奶，3.5g酪蛋白溶液和0.2g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均匀，加纯化水至总体积1000ml。

3.3用喷金缓冲液稀释胶体金标记的抗EDDP单克隆抗体，至溶液OD₅₄₀值为1.5，获得免疫胶体金溶液。

3.4用预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸261mm×220mm，浸泡30min后，37℃下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每261mm×220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。

4.免疫硝酸纤维素膜的制备：

4.1将羊抗鼠IgG用磷酸盐缓冲液稀释成0.6mg/ml，制得质控线(C线)溶液。

4.2将EDDP-牛血清白蛋白复合物用磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为0.2mg/ml制得检测线(T线)溶液。

4.3用点膜机喷点C、T线溶液，制得免疫硝酸纤维素膜。每1m长硝酸纤维素膜分别包被有1ml的C线和T线溶液，检测线和质控线的间距为5.0mm。

5.将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为5mm的试剂条。

6.将检测试剂条装入塑料盒内即得检测试剂盒。

本发明设计的EDDP胶体金检测试剂盒的阈值为300ng/ml。

实施例2EDDP胶体金检测试剂盒的灵敏度实验

1.检测方法：

(1)取实施例1制备的EDDP胶体金检测试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上。

(2)用加样吸管吸取样品，然后滴3滴(约120ul)样品到试剂盒的加样孔中。每检测一份不同的样品使用不同的吸管。

(3)观察结果：在滴加样品后5-10分钟判读结果。

2.检测样品：

配置EDDP(2-亚乙基-1，5-二甲基-3，3-二苯基吡咯烷)浓度为150ng/ml，200ng/ml，250ng/ml，300ng/ml，350ng/ml，400ng/ml的质控参考品作为样品，每个浓度重复3次。

3.检测结果：

表1EDDP胶体金检测试剂盒的灵敏度实验结果

由表1可知，本发明试剂盒的检测灵敏度为300ng/ml，该EDDP胶体金检测试剂盒灵敏度符合检测要求。

实施例3EDDP胶体金检测试剂盒的特异性实验

1.检测方法：

(1)取实施例1制得的EDDP胶体金检测试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上。

(2)用加样吸管吸取用于检测交叉反应实验的检测样品，然后滴3滴(约120ul)样品到试剂盒的加样孔中。每检测一份不同的样品使用不同的吸管。

(3)观察结果：在滴加样品后5-10分钟判读结果。

2.检测样品：

用不同浓度的吗啡、摇头丸、安非他明、甲基安非他明、可卡因、巴比妥、苯二氮卓、三环抗抑郁药、氯胺酮、阿司匹林、氧可酮、去氧肾上腺素、奎尼丁对本发明的试剂盒进行检测，观察是否发生交叉反应。

表2用于交叉反应实验的药品

3.检测结果：

结果证实，本发明的试剂盒对EDDP的检测不会受到表2所示的药品，包括吗啡、摇头丸、安非他明、甲基安非他明、可卡因、巴比妥、苯二氮卓、三环抗抑郁药、氯胺酮、阿司匹林、氧可酮、去氧肾上腺素及奎尼丁在表2所示的浓度下的干扰，即本发明的EDDP胶体金试剂盒在一定浓度下，不会与表2所示的药品产生交叉反应，特异性良好。

实施例4EDDP胶体金检测试剂盒的重复性和稳定性实验

一、试剂盒的批内和批间重复性实验

1.实验方法：

将同批和不同批次的EDDP胶体金检测试剂盒分别检测250、300、350、400ng/ml标准品，每个浓度重复3次，观察试剂盒的重复性。

2.实验结果：经验证，EDDP胶体金检测试剂盒的批内和批间重复性为100％，假阳性率和假阴性率均为0。

二、试剂盒的稳定性实验

1.实验目的：

将EDDP胶体金检测试剂盒密封保存，并存放于4℃及室温(25℃左右)下，观察不同存放温度对试剂盒稳定性的影响。

2.实验方法：

保存于4℃的试剂盒每周取出4盒，分别检测250、300、350、400ng/ml浓度的标准品；保存于室温(25℃)的试剂盒每4天取出4盒，分别检测250、300、350、400ng/ml浓度的标准品。

3.实验结果：

经验证，试剂条在4℃下可保存18个月，在室温下可保存12个月，在可保存的期限内，试剂盒均可达到300ng/ml的检测灵敏度。

对比实验

一、试剂盒的制备：

1.免疫胶体金纸片的制备：取pH为8.5的0.1M Tris缓冲液稀释实施例1方法1制备的免疫胶体金至溶液OD₅₄₀值为1.5，获得免疫胶体金溶液，采用该免疫胶体金溶液直接喷涂未经预处理液浸泡的玻璃纤维纸，每261mm×220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。

2.将滤样纸、本实验制备的未预处理的免疫胶体金纸片、实施例1方法1制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为4mm的试剂条。

3.将检测试剂条装入塑料盒内获得检测试剂盒。

二、试剂盒灵敏度检测：

(1)分别取实施例1方法1和本实验制得的EDDP胶体金检测试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上。

(2)配置EDDP浓度为200、250、300、350、400、450ng/ml的质控参考品作为标准品。用加样吸管吸取样品，然后滴3滴(约120ul)标准品到试剂盒的加样孔中，每检测一份不同浓度的标准品使用不同的吸管。

(3)观察结果：在滴加样品后5-10分钟判读结果。

三.检测结果：

表3不同方法制备的EDDP胶体金检测试剂盒的灵敏度实验结果

由表3可知，本发明实施例1方法1制备的EDDP胶体金试剂盒的检测灵敏度为300ng/ml，而本次对比试验制备的EDDP胶体金检测试剂盒灵敏度为400ng/ml左右，低于含本发明方法制得的免疫胶体金纸片的试剂盒。

Claims (11)

1.一种EDDP胶体金检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸；所述滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上，其特征在于，所述免疫胶体金纸片上包被有胶体金标记的抗EDDP单克隆抗体，所述免疫硝酸纤维素膜上设有包被有EDDP-牛血清白蛋白复合物的检测线和包被有羊抗鼠IgG的质控线。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述胶体金的颗粒大小为39～42nm，所述胶体金是由两步还原法制备获得。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述免疫胶体金纸片是经过预处理的玻璃纤维纸，所述预处理的预处理液包括0.5～0.8v％Tween-20，12～18w/v％蔗糖，溶剂为水。

4.如权利要求1-3任一权利要求所述的EDDP胶体金检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)两步还原法制备胶体金；

2)用步骤1)制备的胶体金标记抗EDDP单克隆抗体，获得胶体金标记的抗EDDP单克隆抗体；

3)免疫胶体金纸片的制备：预处理玻璃纤维纸；稀释步骤2)获得的胶体金标记的抗EDDP单克隆抗体，得到免疫胶体金溶液；用所述免疫胶体金溶液包被预处理过的玻璃纤维纸，获得免疫胶体金纸片；

4)将EDDP-牛血清白蛋白复合物和羊抗鼠IgG分别喷在硝酸纤维素膜检测线和质控线的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；

5)将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得试剂条；

6)将试剂条装入塑料盒，即获得EDDP胶体金检测试剂盒。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述两步还原法为：

a.第一次还原氯金酸溶液：制备浓度为0.0004-0.0005mol/L的HAuCl₄水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl₄与柠檬酸三钠的摩尔比为1∶8～9，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，即制得14～16nm粒径的胶体金原溶液；

b.第二次还原氯金酸溶液：将第一步制得的胶体金原溶液放置于4.0℃水浴中保持温度恒定，随后按胶体金原溶液与HAuCl₄水溶液体积比1∶1.9～2.0加入4.0℃的0.003-0.004mol/L HAuCl₄水溶液，随后立即边搅拌边滴加4.0℃的抗坏血酸与PVP的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl₄的摩尔比为25～26∶1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl₄的重量比为1∶2.0～2.1，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，制得39-42nm粒径的胶体金溶液；

两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤a中，加入的柠檬酸三钠水溶液的浓度为0.01-0.02mol/L，超声震荡的频率为20-30KHZ。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤b中，所述抗坏血酸与PVP的混合水溶液中，抗坏血酸的浓度为0.017-0.019mol/L，PVP的浓度为0.137-0.139g/L。

8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)免疫胶体金纸片的制备为：

A.用喷金缓冲液稀释胶体金标记的抗EDDP单克隆抗体，获得OD₅₄₀值为1.5的免疫胶体金溶液；

B.用预处理液浸泡玻璃纤维纸，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂预处理后的玻璃纤维纸，干燥，制得免疫胶体金纸片。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A中的喷金缓冲液配方如下：8～12v％1.0M Tris液，0.2～0.4w/v％聚乙二醇20000，0.15～0.25w/v％牛血清白蛋白，0.1～0.3w/v％脱脂牛奶，0.25～0.35w/v％酪蛋白，和0.02～0.08w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.5±0.05，余量为水。

10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B中的预处理液包括0.5～0.8v％Tween-20，12～18w/v％蔗糖，溶剂为水。

11.权利要求1-3任一权利要求所述的试剂盒在制备EDDP检测试剂中的应用。

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