CN102253222A - 检测雌激素的方法及其专用试纸 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测雌激素的方法及其专用试纸。本发明所提供的检测雌激素的试纸，是如下1)或2)所述的试纸：1)包括样品吸收垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述反应膜上包括检测区和质控区，检测区包被有雌激素和载体蛋白的偶联物，质控区包被有质控抗原；2)包括样品吸收垫、标记物垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述标记物垫上包被有荧光素标记的雌激素抗体和荧光素标记的质控抗体；所述反应膜上包括检测区和质控区，检测区包被有雌激素和载体蛋白的偶联物，质控区包被有质控抗原。本发明的检测雌激素的试纸具有敏度高、精确定量、特异性强、简单方便和检测时间短的优点。

Description

检测雌激素的方法及其专用试纸

技术领域

本发明涉及检测雌激素的方法及其专用试纸。

背景技术

天然雌激素主要包括雌二醇、雌酮、雌三醇，而合成雌激素主要有己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚等，在农业中主要用作口服避孕药和家畜生长的同化激素，通过增强食欲、抑制发情、提高饲料转化率和控制性别等作用，能达到大幅度地提高动物养殖经济效益的目的，导致农产品中雌激素污染残留呈上升趋势。农产品中的雌激素可以通过扰乱内分泌、免疫、神经等系统的正常功能而对动物和人产生多种疾病，最主要表现在对生殖系统的影响：女性多出现子宫内膜异位、子宫肌瘤，卵巢癌、乳腺癌等疾病。男性多出现睾丸癌、前列腺癌、精子的数量与质量下降等症状。

外源雌激素在环境及农产品中含量很少(动物肌肉组织中类固醇激素以ng·kg^-1到μg·kg^-1数量级存在)，加上本身化学性质差异较大以及内源性雌激素的影响，因此对检测方法的灵敏度要求较高。目前用于农产品中性激素检测的方法主要包括仪器分析法、生物活性法和免疫分析法。

仪器分析法主要包括气相色谱法、高效液相色谱法以及色谱-质谱联用法，已被广泛用于雌激素类等的测定。仪器分析法灵敏度高，能较准确地定性定量，是实验室进行确证的标准方法。但该方法仪器成本较高，分析时间较长、操作较复杂，因此只适合实验室确证用，并不适合基层普查使用。

生物活性法测定是基于细胞或受体来测定具有雌激素活性样物质的。在外源细胞内表达雌激素受体，同时构建含有雌激素反应元件的荧光素报告基因系统，通过测定荧光酶的表达来测定样品中的雌激素活性物质。受体竞争法则是利用一定量的雌激素标准品与样品竞争结合一定量的受体，如果样品中的雌激素类物质多，则受体结合的雌激素标准品量就少，通过一系列酶显色反应，从而达到检测样品中雌激素类物质的目的。可以看出基于生物活性测定的方法操作仍较复杂，而且往往受到灵敏度不够的影响。

免疫分析法是利用抗原抗体特异识别的原理对目标物进行检测，因此具有灵敏度高、特异性强等优点，主要包括放射免疫分析法、酶联免疫分析法以及发光免疫分析法等。已有文献报道建立放射免疫和酶联免疫分析方法用于检测畜禽产品中雌二醇等。但免疫分析法仍然具有分析时间较长，步骤繁琐的不足，因此亟需开发一种更为快捷、灵敏、简单的性激素残留检测方法。

免疫层析技术是免疫分析与层流技术的结合，其装置包括四个基本材料成分和三个基本试剂成分：第一个材料是层析膜，膜上通常固定两种成分，一是待检物的捕获剂，二是参照剂，用来对测试进行质量控制。第二个材料通常是玻璃纤维，用来固定第三种试剂成分即标记物。将样品加到第三个材料即样品垫上面，然后发生层析作用，首先和标记物反应，然后二者沿着层析膜流动，分别与待检物和对照试剂反应，剩余的液体留到第四种材料即吸水纸上面。免疫层析技术兼具免疫分析和层流技术二者的优点，主要表现在：第一，特异性强，以抗原抗体反应为基础，保持了免疫分析的特异性；第二，快速，将原来需要几个小时的检测缩短为几分钟就可以出结果；第三，简便，不需要繁杂的操作，使用者无需培训即可使用；第四，价廉，研发、生产以及使用的成本都很低。由于免疫层析具有这些优点，目前已广泛应用于传染病诊断、生殖生育监测、药物滥用等领域。虽然免疫层析具有如此吸引人的优点，但其应用也受到了一定限制，主要是因为目前在免疫层析中应用的主要标记物是胶体金，一般通过肉眼观察进行判断结果，因此灵敏度不够高，也无法进行准确定量，只能是半定量测定。因此对环境和农产品中含量很低的雌激素测定来说，普通的胶体金免疫层析很难达到灵敏度及定量的要求。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测雌激素的试纸。

本发明所提供的检测雌激素的试纸，是如下1)或2)所述的试纸：

1)包括样品吸收垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述反应膜上包括检测区和质控区，检测区包被有雌激素和载体蛋白的偶联物，质控区包被有质控抗原；

2)包括样品吸收垫、标记物垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述标记物垫上包被有荧光素标记的雌激素抗体和荧光素标记的质控抗体；所述反应膜上包括检测区和质控区，检测区包被有雌激素和载体蛋白的偶联物，质控区包被有质控抗原；

所述荧光素标记的雌激素抗体与所述雌激素和载体蛋白的偶联物结合。

所述检测区位于近于所述样标记物垫的末端的一侧或所述检测区位于近于所述样品吸收垫的末端的一侧，所述质控区位于近于所述吸水垫的始端的一侧；所述检测区距所述标记物垫的末端或所述样品吸收垫的末端7mm-8mm或7mm或8mm，所述质控区距所述吸水垫的始端7mm-8mm或7mm或8mm。

所述质控抗原为非雌激素类物质；

所述雌激素为雌二醇或雌酮或己烯雌酚或双烯雌酚；

所述载体蛋白为卵清白蛋白或牛血清白蛋白；

所述雌激素抗体为抗雌二醇抗体或抗雌酮抗体或抗己烯雌酚抗体或抗双烯雌酚抗体；

所述质控抗体为羊抗兔抗体；

所述荧光素为Alexa Fluor647或Cy3或Rhodamine Red或Texas Red或Cy5或Cy5.5或Cy7或Alexa Fluor 555或Alexa Fluor 568或Alexa Fluor 594或Alexa Fluor 633或Alexa Fluor635或Alexa Fluor 680或Alexa Fluor 750。

所述质控抗原为兔IgG；

所述试纸中包括底板，所述样品吸收垫、反应膜和吸水垫固定在所述底板上或所述样品吸收垫、标记物垫、反应膜和吸水垫固定在所述底板上。

本发明的另一个目的是提供一种检测雌激素的方法。

本发明所提供的检测雌激素的方法，包括如下步骤：

(1)用所述试纸检测雌激素标准品，记录在所述试纸的检测区和质控区的荧光信号比值，制作雌激素标准品的浓度对应荧光信号比值的一元线性回归曲线，计算回归方程；

(2)将雌激素标准品替换为待测样品，用所述试纸检测待测样品，记录在所述试纸的检测区和质控区的荧光信号比值，根据所述步骤(1)的回归方程，得到所述待测样品中雌激素的浓度。

所述雌激素标准品为雌二醇、雌酮、己烯雌酚或双烯雌酚。

所述方法中，如果所述试纸不包括标记物垫，则在所述检测前包括将所述标准品或所述待测样品与荧光标记混合物按照体积比为1∶1的比例混合的步骤；所述荧光标记混合物为荧光素标记的雌激素抗体和荧光素标记的质控抗体按照体积比为1∶1的比例混合得到的混合物。

所述雌激素抗体为抗雌二醇抗体或抗雌酮抗体或抗己烯雌酚抗体或抗双烯雌酚抗体；

所述质控抗体为羊抗兔抗体；

所述荧光素为Alexa Fluor647或Cy3或Rhodamine Red或Texas Red或Cy5或Cy5.5或Cy7或Alexa Fluor 555或Alexa Fluor 568或Alexa Fluor 594或Alexa Fluor 633或Alexa Fluor635或Alexa Fluor 680或Alexa Fluor 750。

所述步骤(2)中所述检测待测样品之前，还包括将待测样品进行前处理步骤；当所述待测样品为牛奶时，所述待测样品前处理的方法为：取1ml待测样品，加入5ml甲基叔丁基醚，垂直振荡15min，于4℃、10000rpm离心15min，取上层转入另一管中，下层溶液用5ml甲基叔丁基醚重复提取1次，取上层溶液与第一次并，60℃氮气吹干，加0.5ml甲醇提取，转移甲醇到另一管中，氮气吹干，用0.1ml甲醇溶解，加入0.4ml磷酸盐缓冲液混匀，即得到处理后的待测样品。

所述试纸在检测雌激素中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明试纸的检测原理为：在样品吸收垫上滴加样品，如果样品中有雌激素类物质，则雌激素类物质经层析作用移动到标记物垫的时候就会和荧光素标记的抗雌激素抗体结合形成复合物，并带动荧光素标记的质控抗体一起在层析作用下上行。当移动到检测区时，未被样品中雌激素类物质结合的游离的荧光素标记的抗雌激素抗体就会和检测区上的偶联在载体蛋白上的雌激素类物质结合，而有荧光信号。荧光素标记的质控抗体则被检测区上的质控抗原捕获，而有荧光信号。而样品中雌激素类物质和荧光素标记的抗雌激素抗体形成的复合物则被层析到吸水纸上。样品中的雌激素类物质越多，则标记物中剩余游离的荧光素标记的抗雌激素抗体越少，结合到检测区上的荧光素标记的抗雌激素抗体越少，荧光信号也就越弱，依此来检测样品中的雌激素类物质的含量。

本发明的检测雌激素的试纸具有灵敏度高、精确定量、特异性强、简单方便和检测时间短的优点。由于以荧光素代替了胶体金作为标记物，很少的荧光信号既可以通过仪器检测出来，因此大大提高了检测的灵敏度，检测雌激素灵敏度可达0.1ng/ml。通过设置质控带(点)作为数据归一化方法，降低了不同纸条间不同操作人员乃至不同仪器扫描的实验误差，将不同纸条测得的样品值代入标准曲线，即可以达到精确定量的效果。由于采用了基于抗原抗体反应的原理，通过选择特异性强的抗体，与其他药物基本没有交叉，因此避免了其他药物的干扰。采用本方法，只需把试纸条插入样品，20分钟内即可获得实验结果，可以大大提高检测的效率。

附图说明

图1为不带标记物垫的试纸结构图。

图2为带标记物垫的试纸结构图。

图3为雌二醇检测标准曲线。

图4为雌酮检测标准曲线。

图5为己烯雌酚检测标准曲线。

图6为双烯雌酚检测标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、检测雌二醇的试纸

方法I

一、检测雌二醇的试纸的构成

不带标记物垫的试纸(图1)。

所述试纸由样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和底板4组成；

所述样品吸收垫、反应膜和吸水垫依次按顺序黏贴在所述底板上，样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；

所述反应膜上有检测区5和质控区6，检测区和质控区均为点状；所述检测区位于近于所述样品吸收垫的末端的一侧，所述质控区位于近于所述吸水垫的始端的一侧；所述检测区距所述样品吸收垫的末端7mm，所述质控区距所述吸水垫的始端7mm；检测区包被有雌激素7和载体蛋白8的偶联物(雌二醇与卵清白蛋白的偶联物)，质控区包被有质控抗原9(兔IgG)。

底板由PVC材料制成；样品吸收垫由玻璃纤维纸制成；反应膜由硝酸纤维素膜制成；吸水垫为3M滤纸。

所述试纸为4mm宽的矩形条状；所述反应膜垫为25mm×4mm的矩形条状；所述样品垫为25mm×4mm的矩形条状。

二、试纸的制备

不带标记物垫的试纸的制备方法主要包括如下步骤：

1)制备含有包被雌二醇与卵清白蛋白的偶联物的检测区和包被质控抗原(兔IgG)的质控区的反应膜；

2)荧光标记混合物的配制

将Alexa Fluor647标记的抗雌二醇抗体和Alexa Fluor647标记的羊抗兔抗体按照体积比1∶1混合，得到荧光标记混合物；

3)将样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板组装成试纸。

下面分步详细叙述：

(一)各部件的制备

1、雌二醇-载体蛋白偶联物的合成与鉴定

1)半抗原雌二醇-3-羧甲基醚的合成

300mg雌二醇溶于6ml干燥的二甲亚砜中，加入1g KOH粉末。搅拌5min后加入300mg溴乙酸。继续搅拌，反应2h后加入50ml冰水。乙酸乙脂萃取回收未反应的雌二醇。水相用2mol/L HCl酸化，出现白色沉淀。砂芯漏斗过滤，沉淀物用蒸馏水洗至中性，真空干燥。甲醇-氯仿重结晶，得到无色晶体，即为雌二醇半抗原雌二醇-3-羧甲基醚。

2)雌二醇-载体蛋白偶联物的合成

雌二醇-牛血清白蛋白偶联物的合成：称取6.6mg雌二醇-3-羧甲基醚，2.9mgN-羟基琥珀酰胺，5.2mg二环乙基碳二亚胺，加入1ml二甲基亚砜，搅拌2h，得到混合溶液。将42mg BSA溶于5ml NaHCO₃水溶液(0.13mol/L，pH7.0)，得到蛋白溶液。将上述混合溶液慢慢滴入上述蛋白溶液中，轻轻搅拌2h，维持pH7.0左右。反应完全后，将反应后的溶液用0.01mol/L PBS(磷酸缓冲液)溶液透析，葡聚糖凝胶G-25柱进一步纯化脱盐，即得到雌二醇-载体蛋白偶联物。

雌二醇-卵清白蛋白偶联物的合成：除用卵清白蛋白代替牛血清白蛋白以外，其余方法均与上述雌二醇-牛血清白蛋白偶联物的合成方法相同。

3)雌二醇-载体蛋白偶联物的鉴定

将雌二醇半抗原、载体蛋白以及合成的雌二醇-载体蛋白偶联物在紫外200nm-400nm波长下扫描，发现偶联物的紫外吸收光谱与半抗原和载体蛋白相比，最大吸收波长有明显偏移，摩尔吸光系数明显增加，具有载体蛋白和半抗原的特征。根据光的叠加原理大致可推知雌二醇与载体蛋白发生结合，判定偶联成功。根据紫外吸收的加和性原理，比较测定半抗原、载体蛋白及偶联物的吸光值并计算它们的蛋白浓度和结合比。

合成的雌二醇-牛血清白蛋白为免疫原，雌二醇-卵清白蛋白为包被原。

2、抗雌二醇抗体的制备

将免疫原雌二醇-牛血清白蛋白用无菌生理盐水溶解后，与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，使免疫原的最终含量为1mg/ml。在新西兰大白兔(购自北京大学医学部实验动物科学部)背部选取6-8个点，做皮下注射免疫，免疫剂量为1ml/只。以后每隔两周免疫一次，免疫途径及免疫剂量同第1次，佐剂为弗氏不完全佐剂。三免后第7天，兔耳缘静脉采血，取血清，用ELISA测定血清效价。效价达到10⁵后，进行加强免疫，加强免疫后第7天兔耳缘静脉采血，取血清，用ELISA测定血清效价。效价达到10⁶后即可颈动脉采血获取抗血清，若不到10⁶则继续免疫。对血清进行层析纯化获得抗雌二醇的多克隆抗体。

3、羊抗兔抗体的制备

羊抗兔抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，产品目录号为bs-0295G。

4、Alexa Fluor647标记的抗雌二醇抗体的制备

从Invitrogen购买Alexa Fluor647蛋白标记试剂盒(目录号：A20173)，按试剂盒说明书操作进行标记，简要步骤如下：取溶于PBS的纯化的抗雌二醇多抗0.5ml(浓度为2mg/ml)，加入1mol/L的碳酸氢钠溶液50μl混合，然后将混合溶液加入到染料Alexa Fluor647中室温搅拌一小时，然后通过柱分离收集标记好的抗体，并计算浓度和标记比。

5、Alexa Fluor647标记的羊抗兔抗体的制备

除用羊抗兔抗体代替抗雌二醇抗体以外，其余方法与上述步骤4相同。

6、Alexa Fluor647标记的抗雌二醇抗体和Alexa Fluor647标记的羊抗兔抗体的混合

将步骤4得到的Alexa Fluor647标记的抗雌二醇抗体和步骤5得到的Alexa Fluor647标记的羊抗兔抗体按体积比1∶1混合，得到荧光标记混合物。

7、反应膜的制备

选择美国PALL公司Vivid 170硝酸纤维素膜，按25mm×4mm的尺寸剪裁。将0.01mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液溶解的浓度为0.2mg/ml的雌二醇-卵清白蛋白偶联物水溶液点状喷样于膜上作为检测点，检测点的直径在150μm-180μm之间，检测点位置距离膜顶端7mm处；选择兔IgG(购自北京博奥森生物生物技术有限公司，目录号为bs-0295P)作为质控抗原，将磷酸盐缓冲液溶解的浓度为1mg/ml的兔IgG水溶液点状喷样于膜的另一端作为质控点，质控点的直径在150μm-180μm之间，质控点距离膜底边7mm处。制备好的硝酸纤维素膜于4℃冰箱过夜，于干燥处密封储藏。

(二)各部件的组装

所述样品吸收垫、反应膜和吸水垫依次按顺序黏贴在所述底板上，样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐。

三、试纸的敏感性和特异性检验

(一)敏感性试验

配制0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml系列浓度的雌二醇标准品(购自Sigma-Aldrich，产品目录号为E8875)，各取100μl，分别与100μl荧光标记混合物混合(含50μl Alexa Fluor647标记的抗雌二醇抗体和50μl AlexaFluor647标记的羊抗兔抗体)，滴加到试纸的样品吸收垫上，样品在层析的作用下上行，并与反应膜上的包被抗原和质控抗原发生反应，荧光扫描仪扫描荧光信号。结果显示该方法可以稳定的检出浓度为0.1ng/ml的雌二醇样品。

(二)特异性试验

配制1ng/ml的雌酮、雌三醇、己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚标准品，各取100μl，分别与100μl荧光标记混合物混合(含50μl Alexa Fluor647标记的抗雌二醇抗体和50μl AlexaFluor647标记的羊抗兔抗体)，滴加到试纸的样品吸收垫上，进行检测，通过荧光扫描仪扫描荧光信号。结果显示均没有检出，表明该方法具有很好的特异性。

方法II

一、检测雌二醇的试纸的构成

带标记物垫的试纸(图2)。

所述试纸由样品吸收垫1、标记物垫10、反应膜2、吸水垫3和底板4组成；

所述样品吸收垫、标记物垫、反应膜和吸水垫依次按顺序黏贴在所述底板上，样品吸收垫的末端与标记物垫的始端相连，标记物垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；

所述标记物垫上包被有荧光素11标记的雌激素抗体12和荧光素标记的质控抗体13；

所述反应膜上有检测区5和质控区6，检测区和质控区均为点状；所述检测区位于近于所述样标记物垫的末端的一侧，所述质控区位于近于所述吸水垫的始端的一侧；所述检测区距所述标记物垫的末端8mm，所述质控区距所述吸水垫的始端8mm；检测区包被有雌激素7和载体蛋白8的偶联物(雌二醇与卵清白蛋白的偶联物)，质控区包被有质控抗原9(兔IgG)。

底板由PVC材料制成；样品吸收垫由玻璃纤维纸制成；反应膜由硝酸纤维素膜制成；吸水垫为3M滤纸。

所述试纸为4mm宽的矩形条状；所述反应膜垫为25mm×4mm的矩形条状；所述样品垫为30mm×4mm的矩形条状。

二、试纸的制备

带标记物垫的试纸的制备方法主要包括如下步骤：

1)制备包被有荧光素标记的抗雌二醇抗体和羊抗兔抗体的质控抗体的标记物垫；

2)制备含有包被雌二醇与卵清白蛋白的偶联物的检测区和包被质控抗原(兔IgG)的质控区的反应膜；

3)将样品吸收垫、标记物垫、反应膜、吸水垫和底板组装成试纸。

下面分步详细叙述：

(一)带标记物垫的试纸的制备方法主要包括如下步骤：

各部件的制备：

1、雌二醇-卵清白蛋白偶联物的合成与鉴定

与方法I的步骤1相同。

2、抗雌二醇抗体的制备

与方法I的步骤2相同。

3、羊抗兔抗体的制备

与方法I的步骤3相同。

4、Alexa Fluor647标记的抗雌二醇抗体的制备

与方法I的步骤4相同。

5、Alexa Fluor647标记的羊抗兔抗体的制备

与方法I的步骤5相同。

6、标记物垫的制备

将步骤4得到的Alexa Fluor647标记的抗雌二醇抗体和步骤5得到的Alexa Fluor647标记的羊抗兔抗体按体积比1∶1的比例混合，得到荧光标记混合物，取20μl混合物滴加到玻璃纤维纸上，混合物的包被面大小为4mm×6mm，在-20℃下冷冻干燥，然后密封保存。

7、反应膜的制备

除检测点位置距离膜顶端8mm处，质控点距离膜底边8mm处以外，其余方法与方法I的步骤7相同。

三、试纸的敏感性和特异性检验

(一)敏感性试验

配制0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml系列浓度的雌二醇标准品，各取200μl，滴加到试纸的样品吸收垫上，样品在层析的作用下上行，并与反应膜上的包被抗原和质控抗原发生反应，荧光扫描仪扫描荧光信号。结果显示该方法可以稳定的检出浓度为0.1ng/ml的雌二醇样品。

(二)特异性试验

配制1ng/ml的雌酮、雌三醇、己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚标准品，各取200μl，滴加到试纸的样品吸收垫上，样品在层析的作用下上行，并与反应膜上的包被抗原和质控抗原发生反应，荧光扫描仪扫描荧光信号。结果显示均没有检出，表明该方法具有很好的特异性。

实施例2、检测雌酮的试纸

方法I

一、检测雌酮的试纸的构成

不带标记物垫的试纸(图1)。

除雌激素和载体蛋白的偶联物为雌酮与卵清白蛋白的偶联物以外，其余结构均与实施例1中方法I的步骤一相同。

二、试纸的制备

不带标记物垫的试纸的制备方法主要包括如下步骤：

1)制备含有包被雌酮与卵清白蛋白的偶联物的检测区和包被质控抗原(兔IgG)的质控区的反应膜；

2)荧光标记混合物的配制

将Cy3标记的抗雌酮抗体和Cy3标记的羊抗兔抗体按照体积比1∶1混合，得到荧光标记混合物；

3)将样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板组装成试纸。

下面分步详细叙述：

(一)各部件的制备

1、雌酮-载体蛋白偶联物的合成与鉴定

1)半抗原的合成

首先合成半抗原雌酮-3-羧甲醚：精密称定雌酮3.2mg溶于20mL干燥的二甲亚砜中，加入氢氧化钾粉末10.5mg，拌5分钟后加入溴乙酸4.5mg，置于通风橱中，继续搅拌反应72小时，搅拌过程中用薄层色谱法监测，反应温度为30℃。待反应完全后，将反应液移入冰纯水100ml中，用乙酸乙酯萃取3次，回收没有反应的雌酮。水相用2mol/L盐酸溶液酸化，出现白色沉淀，静置，抽滤析出沉淀，沉淀物用纯水洗至中性，真空干燥，得粗产品。甲醇-三氯甲烷重结晶，得无色片状晶体纯品。熔点：210～213℃。质谱鉴定为雌酮-3-羧甲醚。

2)雌酮-载体蛋白偶联物的合成

雌酮-牛血清白蛋白偶联物的合成：精密称取雌酮-3-羧甲醚6.6mg置反应瓶中，分别加入N-羟基琥珀酰亚胺2.9mg，二环己基碳二亚胺5.2mg，再加入干燥的N，N-二甲基亚酰胺1ml溶解反应物后，搅拌反应2h，作为溶液A。称取牛血清白蛋白42mg溶解于0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH值7.4)5ml，冷却至4℃，作为溶液B。将活化溶液A慢慢滴加入溶液B中，边加边轻轻搅拌，维持反应液的pH值＞7.0。将混合液置于4℃下轻微搅拌反应0.5h，反应完成后将反应液转移人透析袋。置于0.01mol/L的PBS(pH值7.4)中，4℃下充分透析，用葡聚糖凝胶G-25柱纯化脱盐。分装冷冻保存。

雌酮-卵清白蛋白偶联物的合成：除用卵清白蛋白代替牛血清白蛋白以外，其余方法均与上述雌酮-牛血清白蛋白偶联物的合成方法相同。

3)雌酮-载体蛋白偶联物的鉴定

将雌酮-3-羧甲醚半抗原、载体蛋白以及合成的雌酮半抗原-载体蛋白偶联物在紫外200nm-400nm波长下扫描，发现偶联物的紫外吸收光谱与半抗原和载体蛋白相比，最大吸收波长有明显偏移，摩尔吸光系数明显增加，具有载体蛋白和半抗原的特征。根据光的叠加原理大致可推知雌酮与载体蛋白发生结合，判定偶联成功。根据紫外吸收的加和性原理，比较测定半抗原、载体蛋白及偶联物的吸光值并计算它们的蛋白浓度和结合比。

合成的雌酮-牛血清白蛋白为免疫原，雌酮-卵清白蛋白为包被原。

2、抗雌酮抗体的制备

将免疫原雌酮-牛血清白蛋白用无菌生理盐水溶解后，与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，使免疫原的最终含量为1mg/ml。在新西兰大白兔背部选取6-8个点，做皮下注射免疫，免疫剂量为1ml/只。以后每隔两周免疫一次，免疫途径及免疫剂量同第1次，佐剂为弗氏不完全佐剂。三免后第7天，兔耳缘静脉采血，取血清，用ELISA测定血清效价。效价达到10⁵后，进行加强免疫，加强免疫后第7天兔耳缘静脉采血，取血清，用ELISA测定血清效价。效价达到10⁶后即可颈动脉采血获取抗血清，若不到10⁶则继续免疫。对血清进行层析纯化获得抗雌酮的多克隆抗体。

3、羊抗兔抗体的制备

羊抗兔抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，目录号为bs-0295G。

4、Cy3标记的抗雌酮抗体的制备

Cy3染料购自Amersham Bioscience UK Limited的名称为Cy3 Mono-Reactive Dye Pack的试剂盒，按试剂盒说明书进行标记，简要步骤如下：取1mg抗雌酮抗体溶于1ml 0.1mol/L的NaHCO₃中，然后加入20μl溶解在DMF中浓度为1mg/100μl的Cy3染料，然后室温搅拌反应1h，然后通过柱层析分离手机标记好的抗体，并计算浓度和标记比。

5、Cy3标记的羊抗兔抗体的制备

除用羊抗兔抗体代替抗雌酮抗体以外，其余方法与上述步骤4相同。

6、Cy3标记的抗雌酮抗体和Cy3标记的羊抗兔抗体的混合

将步骤4得到的Cy3标记的抗雌酮抗体和步骤5得到的Cy3标记的羊抗兔抗体按体积比1∶1混合，得到荧光标记混合物。

7、反应膜的制备

选择Millipore公司HF135型硝酸纤维素膜，按25mm×4mm的尺寸剪裁。将0.01mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液溶解的浓度为0.5mg/ml的雌酮-卵清白蛋白偶联物水溶液点状喷样于膜上作为检测点，检测点的直径在150μm-180μm之间，检测点位置距离膜顶端7mm处；选择兔IgG作为质控抗原，将磷酸盐缓冲液溶解的浓度为1mg/ml的兔IgG水溶液点状喷样于膜的另一端作为质控点，质控点的直径为在150μm-180μm之间，质控点距离膜底边7mm处。制备好的硝酸纤维素膜于4℃冰箱过夜，于干燥处密封储藏。

(二)各部件的组装

与实施例1中方法I的步骤(二)相同。

三、试纸的敏感性和特异性检验

(一)敏感性试验

配制0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml系列浓度的雌酮标准品(购自Sigma-Aldrich，产品目录号为E9750)，各取100μl，分别与100μl荧光标记混合物混合(含50μl Cy3标记的抗雌酮抗体和50μl Cy3标记的羊抗兔抗体)，滴加到试纸的样品吸收垫上，样品在层析的作用下上行，并与反应膜上的包被抗原和质控抗原发生反应，荧光扫描仪扫描荧光信号。结果显示该方法可以稳定的检出浓度为0.1ng/ml的雌酮样品。

(二)特异性试验

配制1ng/ml的雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚标准品，各取100μl，分别与100μl荧光标记混合物混合(含50μl Cy3标记的抗雌酮抗体和50μl Cy3标记的羊抗兔抗体)，滴加到试纸的样品吸收垫上，进行检测，通过荧光扫描仪扫描荧光信号。结果显示均没有检出，表明该方法具有很好的特异性。

方法II

一、检测雌酮的试纸的构成

带标记物垫的试纸(图2)。

除雌激素和载体蛋白的偶联物为雌酮与卵清白蛋白的偶联物以外，其余结构均与实施例1中方法II的步骤一相同。

二、试纸的制备

带标记物垫的试纸的制备方法主要包括如下步骤：

1)制备包被有荧光素标记的抗雌酮抗体和羊抗兔抗体的质控抗体的标记物垫；

2)制备含有包被雌酮与卵清白蛋白的偶联物的检测区和包被质控抗原(兔IgG)的质控区的反应膜；

3)将样品吸收垫、标记物垫、反应膜、吸水垫和底板组装成试纸。

下面分步详细叙述：

(一)带标记物垫的试纸的制备方法主要包括如下步骤：

各部件的制备：

1、雌酮-卵清白蛋白偶联物的合成与鉴定

与实施例2中方法I的步骤1相同。

2、抗雌酮抗体的制备

与实施例2中方法I的步骤2相同。

3、羊抗兔抗体的制备

与实施例2中方法I的步骤3相同。

4、Cy3标记的抗雌酮抗体的制备

与实施例2中方法I的步骤4相同。

5、Cy3标记的羊抗兔抗体的制备

与实施例2中方法I的步骤5相同。

6、标记物垫的制备

将步骤4得到的Cy3标记的抗雌酮抗体和步骤5得到的Cy3标记的羊抗兔抗体按体积比为1∶1的比例混合，得到荧光标记混合物，取20μl混合物滴加到玻璃纤维纸上，混合物的包被面大小为4mm×6mm，在-20℃下冷冻干燥，然后密封保存。

7、反应膜的制备

除检测点位置距离膜顶端8mm处，质控点距离膜底边8mm处以外，其余方法与实施例1中方法I的步骤7相同。

三、试纸的敏感性和特异性检验

(一)敏感性试验

配制0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml系列浓度的雌酮标准品，各取200μl，滴加到试纸的样品吸收垫上，样品在层析的作用下上行，并与反应膜上的包被抗原和质控抗原发生反应，荧光扫描仪扫描荧光信号。结果显示该方法可以稳定的检出浓度为0.1ng/ml的雌酮样品。

(二)特异性试验

配制1ng/ml的雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚样品，各取200μl，滴加到试纸的样品吸收垫上，样品在层析的作用下上行，并与反应膜上的包被抗原和质控抗原发生反应，荧光扫描仪扫描荧光信号。结果显示均没有检出，表明该方法具有很好的特异性。

实施例3、检测己烯雌酚的试纸

方法I

一、检测己烯雌酚的试纸的构成

不带标记物垫的试纸(图1)。

除雌激素和载体蛋白的偶联物为己烯雌酚与卵清白蛋白的偶联物以外，其余结构均与实施例1中方法I的步骤一相同。

二、试纸的制备

不带标记物垫的试纸的制备方法主要包括如下步骤：

1)制备含有包被己烯雌酚与卵清白蛋白的偶联物的检测区和包被质控抗原(兔IgG)的质控区的反应膜；

2)荧光标记混合物的配制

将Alexa Fluor647标记的抗己烯雌酚抗体和Alexa Fluor647标记的羊抗兔抗体按照一定比例混合，得到荧光标记混合物；

3)将样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板组装成试纸。

下面分步详细叙述：

(一)各部件的制备

1、己烯雌酚-载体蛋白偶联物的合成与鉴定

1)半抗原的合成

称取27mg DES溶于1ml二甲基亚砜(DMSO)，加入适量无水碳酸钾和30μl 4-溴丁酸乙酯，在60～70℃下搅拌反应，通过TLC板监控反应程度。待反应完全后将反应产物加入预冷水中，用乙酸乙酯萃取，经蒸馏水洗涤、无水NaSO₄干燥后在氮吹仪上吹干。然后将反应产物用甲醇溶解，滴加3mol/L NaOH溶液进行水解，待水解完全后滴加稀6mol/L HCl溶液，调pH至3左右，再用乙酸乙酯萃取，重复上述洗涤、干燥、氮吹步骤即得到目的产物。

2)己烯雌酚-载体蛋白偶联物的合成

己烯雌酚-牛血清白蛋白偶联物的合成：称取21mg DES-CP溶于1ml DMSO，加入7mgNHS，12mg EDC，反应3h，将上述溶液缓慢加入BSA溶液中(34mg BSA溶于2ml 0.05mol/LPB)，反应12h，产物经Sephadex G-25凝胶层析柱纯化，以紫外检测仪监测278nm处信号变化，首先出现的为大分子蛋白峰，收集，-20℃冻存。

己烯雌酚-卵清白蛋白偶联物的合成：除用卵清白蛋白代替牛血清白蛋白以外，其余方法均与上述己烯雌酚-牛血清白蛋白偶联物的合成方法相同。

3)己烯雌酚-载体蛋白偶联物的鉴定

合成的己烯雌酚-牛血清白蛋白为免疫原，己烯雌酚-卵清白蛋白为包被原。分别使用紫外可见分光光度计和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱对DES-CP-BSA和DES-HS-OVA完全抗原进行扫描、偶联比鉴定。由紫外扫描可知，DES在240nm、BSA在278nm处有最大吸收峰，DES-CP-BSA的紫外图谱兼具有DES及BSA的特征吸收峰，且由于偶联物中DES和BSA的波形叠加效应，从而使得在DES-CP-BSA浓度(0.5mg/ml)低于BSA浓度(1mg/ml)的条件下，DES-CP-BSA的波形较BSA波形在240nm～280nm处明显上移，从而初步判定DES与BSA偶联成功。

将BSA和DES-CP-BSA样品进行飞行时间质谱扫描，结果显示，与BSA相比，偶联物最大吸收峰发生右移，其分子量加大，说明偶联成功，其分子结合比为：(完全抗原分子量-载体蛋白分子量)/己烯雌酚分子量，经计算DES和BSA的结合比为12∶1。

2、抗己烯雌酚抗体的制备

将免疫原己烯雌酚-牛血清白蛋白用无菌生理盐水溶解后，与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，使免疫原的最终含量为1mg/ml。在新西兰大白兔背部选取6-8个点，做皮下注射免疫，免疫剂量为1ml/只。以后每隔两周免疫一次，免疫途径及免疫剂量同第1次，佐剂为弗氏不完全佐剂。三免后第7天，兔耳缘静脉采血，取血清，用ELISA测定血清效价。效价达到10⁵后，进行加强免疫，加强免疫后第7天兔耳缘静脉采血，取血清，用ELISA测定血清效价。效价达到10⁶后即可颈动脉采血获取抗血清，若不到10⁶则继续免疫。对血清进行层析纯化获得抗己烯雌酚的多克隆抗体。

3、羊抗兔抗体的制备

羊抗兔抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，目录号为bs-0295G。

4、Alexa Fluor647标记的抗己烯雌酚抗体的制备

从Invitrogen购买Alexa Fluor647蛋白标记试剂盒(目录号：A20173)，按试剂盒说明书操作进行标记，简要步骤如下：取溶于PBS的纯化的抗己烯雌酚多抗0.5ml(浓度为2mg/ml)，加入1mol/L的碳酸氢钠溶液50μl混合，然后将混合溶液加入到染料Alexa Fluor647中室温搅拌一小时，然后通过柱分离收集标记好的抗体，并计算浓度和标记比。

5、Alexa Fluor647标记的羊抗兔抗体的制备

除用羊抗兔抗体代替抗己烯雌酚抗体以外，其余方法与上述步骤4相同。

6、Alexa Fluor647标记的抗己烯雌酚抗体和Alexa Fluor647标记的羊抗兔抗体的混合

将步骤4得到的Alexa Fluor647标记的抗己烯雌酚抗体和步骤5得到的Alexa Fluor647标记的羊抗兔抗体按体积比为1∶1的比例混合，得到荧光标记混合物。

7、反应膜的制备

选择Millipore公司HF135型硝酸纤维素膜，按25mm×4mm的尺寸剪裁。将0.01mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液溶解的浓度为0.5mg/ml的己烯雌酚-卵清白蛋白偶联物水溶液点状喷样于膜上作为检测点，检测点的直径在150μm-180μm之间，检测点位置距离膜顶端7mm处；选择兔IgG作为质控抗原，将磷酸盐缓冲液溶解的浓度为1mg/ml的兔IgG水溶液点状喷样于膜的另一端作为质控点，质控点的直径在150μm-180μm之间，质控点距离膜底边7mm处。制备好的硝酸纤维素膜于4℃冰箱过夜，于干燥处密封储藏。

(二)各部件的组装

与实施例1中方法I的步骤(二)相同。

三、试纸的敏感性和特异性检验

(一)敏感性试验

配制0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml系列浓度的己烯雌酚标准品(购自Sigma-Aldrich，产品目录号为D4628)，各取100μl，分别与100μl荧光标记混合物混合(含50μl Alexa Fluor647标记的抗己烯雌酚抗体和50μlAlexa Fluor647标记的羊抗兔抗体)，滴加到试纸的样品吸收垫上，样品在层析的作用下上行，并与反应膜上的包被抗原和质控抗原发生反应，荧光扫描仪扫描荧光信号。结果显示该方法可以稳定的检出浓度为0.1ng/ml的己烯雌酚样品。

(二)特异性试验

配制1ng/ml的雌二醇、雌酮、雌三醇、双烯雌酚、己烷雌酚标准品，各取100μl，分别与100μl荧光标记混合物混合(含50μl Alexa Fluor647标记的抗己烯雌酚抗体和50μlAlexa Fluor647标记的羊抗兔抗体)，滴加到试纸的样品吸收垫上，进行检测，通过荧光扫描仪扫描荧光信号。结果显示均没有检出，表明该方法具有很好的特异性。

方法II

一、检测己烯雌酚的试纸的构成

带标记物垫的试纸(图2)。

除雌激素和载体蛋白的偶联物为己烯雌酚与卵清白蛋白的偶联物以外，其余结构均与实施例1中方法II的步骤一相同。

二、试纸的制备

带标记物垫的试纸的制备方法主要包括如下步骤：

1)制备包被有荧光素标记的抗己烯雌酚抗体和羊抗兔抗体的质控抗体的标记物垫；

2)制备含有包被己烯雌酚与卵清白蛋白的偶联物的检测区和包被质控抗原(兔IgG)的质控区的反应膜；

3)将样品吸收垫、标记物垫、反应膜、吸水垫和底板组装成试纸。

下面分步详细叙述：

(一)带标记物垫的试纸的制备方法主要包括如下步骤：

各部件的制备：

1、己烯雌酚-卵清白蛋白偶联物的合成与鉴定

与实施例3中方法I的步骤1相同。

2、抗己烯雌酚抗体的制备

与实施例3中方法I的步骤2相同。

3、羊抗兔抗体的制备

与实施例3中方法I的步骤3相同。

4、Alexa Fluor647标记的抗己烯雌酚抗体的制备

与实施例3中方法I的步骤4相同。

5、Alexa Fluor647标记的羊抗兔抗体的制备

与实施例3中方法I的步骤5相同。

6、标记物垫的制备

将步骤4得到的Alexa Fluor647标记的抗己烯雌酚抗体和步骤5得到的Alexa Fluor647标记的羊抗兔抗体按体积比1∶1的比例混合，得到荧光标记混合物，取20μl混合物滴加到玻璃纤维纸上，混合物的包被面大小为4mm×6mm，在-20℃下冷冻干燥，然后密封保存。

7、反应膜的制备

除检测点位置距离膜顶端8mm处，质控点距离膜底边8mm处以外，其余方法与实施例3中方法I的步骤7相同。

三、试纸的敏感性和特异性检验

(一)敏感性试验

配制0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml系列浓度的己烯雌酚标准品，各取200μl，滴加到试纸的样品吸收垫上，样品在层析的作用下上行，并与反应膜上的包被抗原和质控抗原发生反应，荧光扫描仪扫描荧光信号。结果显示该方法可以稳定的检出浓度为0.1ng/ml的己烯雌酚样品。

(二)特异性试验

配制1ng/ml的雌二醇、雌酮、雌三醇、双烯雌酚和己烷雌酚标准品，各取200μl，滴加到试纸的样品吸收垫上，样品在层析的作用下上行，并与反应膜上的包被抗原和质控抗原发生反应，荧光扫描仪扫描荧光信号。结果显示均没有检出，表明该方法具有很好的特异性。

实施例4、检测双烯雌酚的试纸

方法I

一、检测双烯雌酚的试纸的构成

不带标记物垫的试纸(图1)。

除雌激素和载体蛋白的偶联物为双烯雌酚与卵清白蛋白的偶联物以外，其余结构均与实施例1中方法I的步骤一相同。

二、试纸的制备

不带标记物垫的试纸的制备方法主要包括如下步骤：

1)制备含有包被双烯雌酚与卵清白蛋白的偶联物的检测区和包被质控抗原(兔IgG)的质控区的反应膜；

2)荧光标记混合物的配制

将Cy3标记的抗双烯雌酚抗体和Cy3标记的羊抗兔抗体按照体积比1∶1混合，得到荧光标记混合物；

3)将样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板组装成试纸。

下面分步详细叙述：

(一)各部件的制备

1、双烯雌酚-载体蛋白偶联物的合成与鉴定

1)半抗原的合成

称取14mg DIEN溶于1ml DMSO中，加入适量的无水碳酸钾和4-溴丁酸乙酯，于60℃下搅拌反应，通过TLC板监控反应程度，待反应产物反应完全后将反应产物加入预冷的蒸馏水中得乳浊液，用适量的乙酸乙酯进行萃取，蒸馏水洗涤后使用无水NaSO₄对萃取物进行干燥，在氮吹仪上进行吹干。将上述产物用甲醇进行溶解，加入适量3mol/LNaOH溶液进行水解，待水解完全后逐滴加6mol/L HCl溶液，使pH至3左右，此时溶液析出大量沉淀，再次使用乙酸乙酯进行萃取，然后重复上述洗涤、干燥、氮吹步骤即得到DIEN-CP。

2)双烯雌酚-载体蛋白偶联物的合成

双烯雌酚-牛血清白蛋白偶联物的合成：将合成的DIEN-CP半抗原采用活泼酯法与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备完全抗原。用DMSO溶解18mg DIEN-CP，分别加入的6mg NHS和10mg EDC，搅拌反应3h后，将上述溶液逐滴缓慢加入溶有34mg BSA的0.05M PB(pH7.4)溶液中，室温搅拌反应12h，将反应产物经Sephadex G-25凝胶层析柱纯化，以紫外检测仪监测278nm处信号变化，首先出现的为大分子蛋白峰，收集保存。

双烯雌酚-卵清白蛋白偶联物的合成：除用卵清白蛋白代替牛血清白蛋白以外，其余方法均与上述双烯雌酚-牛血清白蛋白偶联物的合成方法相同。

3)双烯雌酚-载体蛋白偶联物的鉴定

合成的双烯雌酚-牛血清白蛋白为免疫原，双烯雌酚-卵清白蛋白为包被原。通过紫外可见分光光度计、基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对全抗原进行鉴定、偶联比测定。由紫外扫描图可见，DIEN在波长227nm处、BSA在波长278nm处有最大吸收，而DIEN-CP-BSA紫外扫描图不同于DIEN和BSA，在最大吸收波长发生明显偏移。由于DIEN-CP-BSA偶联了一定数量的DIEN，尽管DIEN-CP-BSA(0.4mg/ml)的浓度低于BSA(1mg/ml)，但因波的叠加原理，使DIEN-CP-BSA吸光度值在278nm处高于BSA的吸光度值，从而初步判定偶联成功。

将BSA和DIEN-CP-BSA纯化冻干样品进行飞行时间质谱扫描，结果表明，与BSA相比，偶联物最大吸收峰发生右移，其分子量加大，说明偶联成功，其分子结合比为：(完全抗原分子量-载体蛋白分子量)/双烯雌酚分子量，经计算DIEN和BSA的结合比为11。

2、抗双烯雌酚抗体的制备

将免疫原双烯雌酚-牛血清白蛋白用无菌生理盐水溶解后，与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，使免疫原的最终含量为1mg/ml。在新西兰大白兔背部选取6-8个点，做皮下注射免疫，免疫剂量为1ml/只。以后每隔两周免疫一次，免疫途径及免疫剂量同第1次，佐剂为弗氏不完全佐剂。三免后第7天，兔耳缘静脉采血，取血清，用ELISA测定血清效价。效价达到10⁵后，进行加强免疫，加强免疫后第7天兔耳缘静脉采血，取血清，用ELISA测定血清效价。效价达到10⁶后即可颈动脉采血获取抗血清，若不到10⁶则继续免疫。对血清进行层析纯化获得抗双烯雌酚的多克隆抗体。

3、羊抗兔抗体的制备

羊抗兔抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，产品目录号为bs-0295G。

4、Cy3标记的抗双烯雌酚抗体的制备

Cy3染料购自Amersham Bioscience UK Limited的名称为Cy3 Mono-Reactive Dye Pack的试剂盒，按试剂盒说明书进行标记，简要步骤如下：取1mg抗双烯雌酚抗体溶于1ml 0.1mol/L的NaHCO₃中，然后加入20μl溶解在DMF中浓度为1mg/100μl的Cy3染料，然后室温搅拌反应1小时，然后通过柱层析分离手机标记好的抗体，并计算浓度和标记比。

5、Cy3标记的羊抗兔抗体的制备

除用羊抗兔抗体代替抗双烯雌酚抗体以外，其余方法与上述步骤4相同。

6、Cy3标记的抗双烯雌酚抗体和Cy3标记的羊抗兔抗体的混合

将步骤4得到的Cy3标记的抗双烯雌酚抗体和步骤5得到的Cy3标记的羊抗兔抗体按体积比1∶1混合，得到荧光标记混合物。

7、反应膜的制备

选择Millipore公司HF135型硝酸纤维素膜，按25mm×4mm的尺寸剪裁。将0.01M的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液溶解的浓度为0.5mg/ml的双烯雌酚-卵清白蛋白偶联物水溶液点状喷样于膜上作为检测点，检测点的直径在150μm-180μm之间，检测点位置距离膜顶端7mm处；选择兔IgG作为质控抗原，将磷酸盐缓冲液溶解的浓度为1mg/ml的兔IgG水溶液点状喷样于膜的另一端作为质控点，质控点的直径在150μm-180μm之间，质控点距离膜底边7mm处。制备好的硝酸纤维素膜于4℃冰箱过夜，于干燥处密封储藏。

(二)各部件的组装

与实施例1中方法I的步骤(二)相同。

三、试纸的敏感性和特异性检验

(一)敏感性试验

配制0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml系列浓度的双烯雌酚标准品(购自Sigma-Aldrich，产品目录号为46190)，各取100μl，分别与100μl荧光标记混合物混合(含50μl Cy3标记的抗双烯雌酚抗体和50μl Cy3标记的羊抗兔抗体)，滴加到试纸的样品吸收垫上，样品在层析的作用下上行，并与反应膜上的包被抗原和质控抗原发生反应，荧光扫描仪扫描荧光信号。结果显示该方法可以稳定的检出浓度为0.1ng/ml的双烯雌酚样品。

(二)特异性试验

配制1ng/ml的雌二醇、雌酮、雌三醇、己烯雌酚和己烷雌酚标准品，各取100μl，分别与100μl荧光标记混合物混合(含50μl Cy3标记的抗双烯雌酚抗体和50μl Cy3标记的羊抗兔抗体)，滴加到试纸的样品吸收垫上，进行检测，通过荧光扫描仪扫描荧光信号。结果显示均没有检出，表明该方法具有很好的特异性。

方法II

一、检测双烯雌酚的试纸的构成

带标记物垫的试纸(图2)。

除雌激素和载体蛋白的偶联物为双烯雌酚与卵清白蛋白的偶联物以外，其余结构均与实施例1中方法II的步骤一相同。

二、试纸的制备

带标记物垫的试纸的制备方法主要包括如下步骤：

1)制备包被有荧光素标记的抗双烯雌酚抗体和羊抗兔抗体的质控抗体的标记物垫；

2)制备含有包被双烯雌酚与卵清白蛋白的偶联物的检测区和包被质控抗原(兔IgG)的质控区的反应膜；

3)将样品吸收垫、标记物垫、反应膜、吸水垫和底板组装成试纸。

下面分步详细叙述：

(一)带标记物垫的试纸的制备方法主要包括如下步骤：

各部件的制备：

1、双烯雌酚-卵清白蛋白偶联物的合成与鉴定

与实施例4中方法I的步骤1相同。

2、抗双烯雌酚抗体的制备

与实施例4中方法I的步骤2相同。

3、羊抗兔抗体的制备

与实施例4中方法I的步骤3相同。

4、Cy3标记的抗双烯雌酚抗体的制备

与实施例4中方法I的步骤4相同。

5、Cy3标记的羊抗兔抗体的制备

与实施例4中方法I的步骤5相同。

6、标记物垫的制备

将步骤4得到的Cy3标记的抗双烯雌酚抗体和步骤5得到的Cy3标记的羊抗兔抗体按体积比1∶1的比例混合，得到荧光标记混合物，取20μl混合物滴加到玻璃纤维纸上，混合物的包被面大小为4mm×6mm，在-20℃下冷冻干燥，然后密封保存。

7、反应膜的制备

除检测点位置距离膜顶端8mm处，质控点距离膜底边8mm处以外，其余方法与实施例1中方法I的步骤7相同。

三、试纸的敏感性和特异性检验

(一)敏感性试验

配制0ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml和20ng/ml系列浓度的双烯雌酚标准品，各取200μl，滴加到试纸的样品吸收垫上，样品在层析的作用下上行，并与反应膜上的包被抗原和质控抗原发生反应，荧光扫描仪扫描荧光信号。结果显示该方法可以稳定的检出浓度为0.1ng/ml的双烯雌酚样品。

(二)特异性试验

配制1ng/ml的雌二醇、雌酮、雌三醇、己烯雌酚和己烷雌酚标准品，各取200μl，滴加到试纸的样品吸收垫上，样品在层析的作用下上行，并与反应膜上的包被抗原和质控抗原发生反应，荧光扫描仪扫描荧光信号。结果显示均没有检出，表明该方法具有很好的特异性。

实施例5、检测雌二醇的试纸的应用

方法I

用实施例1方法I中所述试纸检测雌二醇，方法如下：

1、标准曲线的制作：分别取100μl不同浓度的雌二醇标准品(购自Sigma-Aldrich，产品目录号为E8875)与100μl实施例1方法I中所述荧光素标记物混合物混匀，滴加到所述试纸的样品吸收垫上，观察样品层析沿着玻璃纤维纸向硝酸纤维素膜流动，直到被上面的吸水垫吸附；5分钟后，将试纸条放入到激光共聚焦扫描仪中，进行检测，分别测定检测区和质控区的荧光信号中位值；将检测区的荧光信号中位值(A)比上质控区的荧光信号中位值(B)，结果见表1，用所得的比值与雌二醇标准品浓度对数作标准曲线(图3)，计算回归方程为：y＝-0.1831x+0.7204，R²＝0.9725。

表1雌二醇标准品的检测结果

2、待测样品测定：

向空白牛奶中添加终浓度为1ng/ml的雌二醇，制备待测样品。将待测样品进行前处理，方法如下：取1ml待测样品，加入5ml甲基叔丁基醚，垂直振荡15min，于4℃、10000rpm离心15min，取上层转入另一管中，下层溶液用5ml甲基叔丁基醚重复提取1次，取上层溶液与第一次合并，60℃氮气吹干，加0.5ml甲醇提取，转移甲醇到另一管中，氮气吹干，用0.1ml甲醇溶解，加入0.4ml磷酸盐缓冲液混匀后(样品稀释倍数为0.5倍)，得到处理后的待测样品。取100μl处理后的待测样品与100μl实施例1方法I中所述荧光素标记物混合物混匀，滴加到所述试纸的样品吸收垫上，观察样品层析沿着玻璃纤维纸向硝酸纤维素膜流动，直到被上面的吸水垫吸附；5分钟后，将试纸条放入到激光共聚焦扫描仪中，进行检测，分别测定检测区和质控区的荧光信号中位值；将检测区的荧光信号中位值(A)比上质控区的荧光信号中位值(B)，将得到的计算值代入上述步骤1的回归方程，计算得到待测样品中雌二醇的浓度。

3、检测结果：

检测区的荧光信号中位值(A)为10814.15，质控区的荧光信号中位值(B)为14354.6，A/B为0.75，计算得到的待测样品中雌二醇的浓度为0.84ng/ml。

方法II

用实施例1方法II中所述试纸检测雌二醇，方法如下：

1、标准曲线的制作：

除取200μl不同浓度的雌二醇标准品滴加到所述试纸的样品吸收垫上，荧光素标记物混合物包被在标记物垫上以外，其余方法均与方法I中相同；测定结果与方法I无显著差异。

2、待测样品测定：

除取200μl待测样品滴加到所述试纸的样品吸收垫上，荧光素标记物混合物包被在标记物垫上以外，其余方法均与方法I中相同；

3、检测结果：

测定结果与方法I无显著差异。

实施例6、检测雌酮的试纸的应用

用实施例2方法I中所述试纸检测雌酮，方法如下：

1、标准曲线的制作：分别取100μl不同浓度的雌酮标准品(购自Sigma-Aldrich，产品目录号为E9750)与100μl实施例2方法I中所述荧光素标记物混合物混匀，滴加到所述试纸的样品吸收垫上，观察样品层析沿着玻璃纤维纸向硝酸纤维素膜流动，直到被上面的吸水垫吸附；5分钟后，将试纸条放入到激光共聚焦扫描仪中，进行检测，分别测定检测区和质控区的荧光信号中位值；将检测区的荧光信号中位值(A)比上质控区的荧光信号中位值(B)，结果见表2，用所得的计算值与雌酮标准品浓度对数作标准曲线(图4)，计算回归方程为：y＝-0.1611x+0.7764，R²＝0.9874。

表2雌酮标准品的检测结果

2、待测样品测定：

向空白牛奶中添加终浓度为1ng/ml的雌酮，制备待测样品。将待测样品进行前处理，方法如下：取1ml待测样品，加入5ml甲基叔丁基醚，垂直振荡15min，于4℃、10000rpm离心15min，取上层转入另一管中，下层溶液用5ml甲基叔丁基醚重复提取1次，取上层溶液与第一次合并，60℃氮气吹干，加0.5ml甲醇提取，转移甲醇到另一管中，氮气吹干，用0.1ml甲醇溶解，加入0.4ml磷酸盐缓冲液混匀后(样品稀释倍数为0.5倍)，得到处理后的待测样品。取100μl处理后的待测样品与100μl实施例2方法I中所述荧光素标记物混合物混匀，滴加到所述试纸的样品吸收垫上，观察样品层析沿着玻璃纤维纸向硝酸纤维素膜流动，直到被上面的吸水垫吸附；5分钟后，将试纸条放入到激光共聚焦扫描仪中，进行检测，分别测定检测区和质控区的荧光信号中位值；，将检测区的荧光信号中位值(A)比上质控区的荧光信号中位值(B)，将得到的计算值代入上述步骤1的回归方程，计算得到待测样品中雌酮的浓度。

3、检测结果：

检测区的荧光信号中位值(A)为12158.7，质控区的荧光信号中位值(B)为15036.3，A/B为0.76，计算得到的待测样品中雌酮的浓度为0.82ng/ml。

实施例7、检测己烯雌酚的试纸的应用

用实施例4方法I中所述试纸检测己烯雌酚，方法如下：

1、标准曲线的制作：分别取100μl不同浓度的己烯雌酚标准品(购自Sigma-Aldrich，产品目录号为D4628)与100μl实施例3方法I中所述荧光素标记物混合物混匀，滴加到所述试纸的样品吸收垫上，观察样品层析沿着玻璃纤维纸向硝酸纤维素膜流动，直到被上面的吸水垫吸附；5分钟后，将试纸条放入到激光共聚焦扫描仪中，进行检测，分别测定检测区和质控区的荧光信号中位值；将检测区的荧光信号中位值(A)比上质控区的荧光信号中位值(B)，结果见表4，用所得的计算值与己烯雌酚标准品浓度对数作标准曲线(图5)，计算回归方程为：y＝-0.15x+0.7976，R²＝0.9783。

表4己烯雌酚标准品的检测结果

2、待测样品测定：

向空白牛奶中添加终浓度为1ng/ml的己烯雌酚，制备待测样品。将待测样品进行前处理，方法如下：取1ml待测样品，加入5ml甲基叔丁基醚，垂直振荡15min，于4℃、10000rpm离心15min，取上层转入另一管中，下层溶液用5ml甲基叔丁基醚重复提取1次，取上层溶液与第一次合并，60℃氮气吹干，加0.5ml甲醇提取，转移甲醇到另一管中，氮气吹干，用0.1ml甲醇溶解，加入0.4ml磷酸盐缓冲液混匀后(样品稀释倍数为0.5倍)，得到处理后的待测样品。取100μl处理后的待测样品与100μl实施例3方法I中所述荧光素标记物混合物混匀，滴加到所述试纸的样品吸收垫上，观察样品层析沿着玻璃纤维纸向硝酸纤维素膜流动，直到被上面的吸水垫吸附；5分钟后，将试纸条放入到激光共聚焦扫描仪中，进行检测，分别测定检测区和质控区的荧光信号中位值；，将检测区的荧光信号中位值(A)比上质控区的荧光信号中位值(B)，将得到的计算值代入上述步骤1的回归方程，计算得到待测样品中己烯雌酚的浓度。

3、检测结果：

检测区的荧光信号中位值(A)为12558.12，质控区的荧光信号中位值(B)为15397.4，A/B为0.82，计算得到的待测样品中己烯雌酚的浓度为0.89ng/ml。

实施例8、检测双烯雌酚的试纸的应用

用实施例4方法I中所述试纸检测双烯雌酚，方法如下：

1、标准曲线的制作：分别取100μl不同浓度的双烯雌酚标准品(购自Sigma-Aldrich，产品目录号为46190)与100μl实施例4方法I中所述荧光素标记物混合物混匀，滴加到所述试纸的样品吸收垫上，观察样品层析沿着玻璃纤维纸向硝酸纤维素膜流动，直到被上面的吸水垫吸附；5分钟后，将试纸条放入到激光共聚焦扫描仪中，进行检测，分别测定检测区和质控区的荧光信号中位值；将检测区的荧光信号中位值(A)比上质控区的荧光信号中位值(B)，结果见表5，用所得的计算值与双烯雌酚标准品浓度对数作标准曲线(图6)，计算回归方程为：y＝-0.1308x+0.7738，R²＝0.9983。

表5双烯雌酚标准品的检测结果

2、待测样品测定：

向空白牛奶中添加终浓度为1ng/ml的双烯雌酚，制备待测样品。将待测样品进行前处理，方法如下：取1ml待测样品，加入5ml甲基叔丁基醚，垂直振荡15min，于4℃、10000rpm离心15min，取上层转入另一管中，下层溶液用5ml甲基叔丁基醚重复提取1次，取上层溶液与第一次合并，60℃氮气吹干，加0.5ml甲醇提取，转移甲醇到另一管中，氮气吹干，用0.1ml甲醇溶解，加入0.4ml磷酸盐缓冲液混匀后(样品稀释倍数为0.5倍)，得到处理后的待测样品。取100μl处理后的待测样品与100μl实施例4方法I中所述荧光素标记物混合物混匀，滴加到所述试纸的样品吸收垫上，观察样品层析沿着玻璃纤维纸向硝酸纤维素膜流动，直到被上面的吸水垫吸附；5分钟后，将试纸条放入到激光共聚焦扫描仪中，进行检测，分别测定检测区和质控区的荧光信号中位值；，将检测区的荧光信号中位值(A)比上质控区的荧光信号中位值(B)，将得到的计算值代入上述步骤1的回归方程，计算得到待测样品中双烯雌酚的浓度。

3、检测结果：

检测区的荧光信号中位值(A)为11413.5，质控区的荧光信号中位值(B)为14083.4，A/B为0.81，计算得到的待测样品中双烯雌酚的浓度为0.76ng/ml。

Claims (10)

1.一种检测雌激素的试纸，是如下1)或2)所述的试纸：

1)包括样品吸收垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述反应膜上包括检测区和质控区，检测区包被有雌激素和载体蛋白的偶联物，质控区包被有质控抗原；

2)包括样品吸收垫、标记物垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述标记物垫上包被有荧光素标记的雌激素抗体和荧光素标记的质控抗体；所述反应膜上包括检测区和质控区，检测区包被有雌激素和载体蛋白的偶联物，质控区包被有质控抗原；

所述荧光素标记的雌激素抗体与所述雌激素和载体蛋白的偶联物结合。

2.根据权利要求1所述的试纸，其特征在于：

所述检测区位于近于所述样标记物垫的末端的一侧或所述检测区位于近于所述样品吸收垫的末端的一侧，所述质控区位于近于所述吸水垫的始端的一侧；所述检测区距所述标记物垫的末端或所述样品吸收垫的末端7mm-8mm或7mm或8mm，所述质控区距所述吸水垫的始端7mm-8mm或7mm或8mm。

3.根据权利要求1或2所述的试纸，其特征在于：

所述质控抗原为非雌激素类物质；

所述雌激素为雌二醇或雌酮或己烯雌酚或双烯雌酚；

所述载体蛋白为卵清白蛋白或牛血清白蛋白；

所述雌激素抗体为抗雌二醇抗体或抗雌酮抗体或抗己烯雌酚抗体或抗双烯雌酚抗体；

所述质控抗体为羊抗兔抗体；

所述荧光素为Alexa Fluor647或Cy3或Rhodamine Red或Texas Red或Cy5或Cy5.5或Cy7或Alexa Fluor 555或Alexa Fluor 568或Alexa Fluor 594或Alexa Fluor 633或Alexa Fluor635或Alexa Fluor 680或Alexa Fluor 750。

4.根据权利要求1-3中任一所述的试纸，其特征在于：

所述质控抗原为兔IgG；

所述试纸中包括底板，所述样品吸收垫、反应膜和吸水垫固定在所述底板上或所述样品吸收垫、标记物垫、反应膜和吸水垫固定在所述底板上。

5.一种检测雌激素的方法，包括如下步骤：

(1)用权利要求1-4中任一所述的试纸检测雌激素标准品，记录在所述试纸的检测区和质控区的荧光信号比值，制作雌激素标准品的浓度对应荧光信号比值的一元线性回归曲线，计算回归方程；

(2)将雌激素标准品替换为待测样品，用权利要求1-4中任一所述的试纸检测待测样品，记录在所述试纸的检测区和质控区的荧光信号比值，根据所述步骤(1)的回归方程，得到所述待测样品中雌激素的浓度。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述雌激素标准品为雌二醇、雌酮、己烯雌酚或双烯雌酚。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：

所述方法中，如果权利要求1-4中任一所述的试纸不包括标记物垫，则在所述检测前包括将所述标准品或所述待测样品与荧光标记混合物按照体积比为1∶1的比例混合的步骤；所述荧光标记混合物为荧光素标记的雌激素抗体和荧光素标记的质控抗体按照体积比为1∶1的比例混合得到的混合物。

8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：

所述雌激素抗体为抗雌二醇抗体或抗雌酮抗体或抗己烯雌酚抗体或抗双烯雌酚抗体；

所述质控抗体为羊抗兔抗体。

9.根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于：

所述荧光素为Alexa Fluor647或Cy3或Rhodamine Red或Texas Red或Cy5或Cy5.5或Cy7或Alexa Fluor 555或Alexa Fluor 568或Alexa Fluor 594或Alexa Fluor 633或Alexa Fluor635或Alexa Fluor 680或Alexa Fluor 750。

10.权利要求1-4中任一所述的试纸在检测雌激素中的应用。

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