CN113063954A - 雌激素的时间分辨荧光、显色双信号试纸条及其制备方法与应用 - Google Patents

雌激素的时间分辨荧光、显色双信号试纸条及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种雌激素的时间分辨荧光、显色双信号试纸条及其制备方法与应用，所述雌激素为具有酚羟基、雌激素效应的雌激素化合物以及类雌激素化合物，包括雌二醇、雌三醇、雌酮、双酚A、己烯雌酚、炔雌醇等。该试纸条基于免疫识别和荧光共振能量转移原理，以雌激素‑牛血清蛋白‑长余辉粒子为荧光供体并将其固定在试纸检测区，以雌激素单克隆抗体修饰的胶体金为荧光受体，以智能手机拍照方式获得时间分辨荧光照片，试纸检测区的时间分辨荧光强度与雌激素含量呈正相关，显色强度与雌激素含量呈负相关，建立了雌激素的竞争型时间分辨荧光、显色双信号免疫层析试纸条，可对具有羟基、雌激素效应的雌激素以及类雌激素进行准确快速的检测。

Description

雌激素的时间分辨荧光、显色双信号试纸条及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及环境雌激素的检测方法，特别是雌激素的时间分辨荧光、显色双信号免疫层析试纸条及其制备方法与应用。
背景技术
雌激素(Estrogen,E)是促进雌性动物第二性征发育及性器官成熟的物质，由雌性动物卵巢和胎盘分泌产生。雌激素具有广泛而重要的生理作用，不仅有促进和维持女性生殖器官和第二性征的生理作用，并对内分泌、心血管、代谢系统、骨骼的生长和成熟，皮肤等均有明显的影响。天然雌激素主要是雌二醇E2、雌酮E1、雌三醇Estriol；目前临床上常用的雌激素类药物多是以雌二醇为母体人工合成的衍生物，如己烯雌酚、炔雌醇等。17β-雌二醇是所有内分泌干扰物中具有最强活性的天然雌激素，常被用作更年期女性的内分泌调节药物。然而，当雌激素通过饮用水和食物在人体内积累超过安全阈值时，会损害人类健康、破坏机体平衡，甚至危害后代。
目前，雌激素的检测方法主要有色谱法、电化学法、表面增强拉曼光谱(SERS)法等。色谱法灵敏度高、稳定性好，但无法应用于现场检测；电化学法和SERS法响应快速、灵敏，均可用于现场检测，但稳定性和重现性较低。
试纸条是一种纸基快速检测技术，低成本、易操作、可实现现场检测，目前已广泛应用于临床诊断、食品安全、环境监测等领域。胶体金因其显色结果肉眼可见而常用作试纸条显色探针，但其灵敏度较低且读数结果具有主观性。为提高试纸灵敏度，可以采用金纳米花/金纳米棒或对胶体金二次标记，或开发荧光型侧流分析试纸，如以小分子有机染料、量子点、上转换纳米粒子等为信号探针，但上述荧光型侧流分析试纸存在试纸荧光背景干扰或需要高能量激光光源等弊端。
发明内容
本发明的目的在于根据目前技术不足及检测需要，提供一种新型、特异、快速的雌激素TRF和显色双信号免疫层析试纸条的制备方法和应用。
本发明基于免疫识别和荧光共振能量转移原理，以偶联雌激素-牛血清蛋白(E-BSA)的长余辉粒子(persistent luminescent particles，PLPs)为荧光供体，以雌激素单克隆抗体修饰的胶体金(CG-mAb)为荧光受体，建立了雌激素的竞争型时间分辨荧光(Time-resolved fluorescence，TRF)、显色双信号试纸条。本方法以低功率紫外灯为激发光源，以智能手机连拍功能实现TRF模式采集试纸的检测区荧光图像，有效去除试纸荧光背景干扰进而提高信噪比；以余辉优良的大尺寸长余辉粒子为荧光信号源并利用其在硝酸纤维素膜上不迁移的特性将雌激素竞争物固定于检测区，巧妙解决了常规试纸对信号材料尺寸的纳米级别限制和小尺寸长余辉粒子余辉短暂的矛盾；TRF和显色双信号检测将裸眼快筛与精密定量相结合，同时提高了结果的可信度。本方法可以用于雌激素的快速、灵敏检测。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
本发明的第一个目的是，提供一种雌激素的时间分辨荧光、显色双信号试纸条，所述试纸条结构为PVC底板上沿水平方向依次交叠粘贴有样品垫、硝酸纤维素膜即NC膜、吸收垫，所述NC膜两端位于交叠下层；NC膜用于实现样品中分析物与其他物质的分离和检测，样品垫用于上样，吸收垫用于吸收过量液体，PVC底板为试纸提供物理支撑；
所述NC膜包括检测区即T区、质控区即C区；
所述检测区上固定有雌激素-牛血清蛋白-长余辉粒子E-BSA-PLPs，所述雌激素为具有酚羟基且具有雌激素效应的雌激素化合物以及类雌激素化合物，包括雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、雌酮(E1)、双酚A(BPA)、己烯雌酚、炔雌醇等；所述雌激素效应是指能够与雌激素受体作用、对内分泌系统产生类似雌激素的生理效应，也称雌激素样效应。
所述质控区上固定有二抗。
进一步的，所述质控区固定的二抗包括但不限于羊抗鼠二抗、兔抗鼠二抗、羊抗兔二抗、驴抗兔二抗。
本发明的另一个目的是，提供一种雌激素的时间分辨荧光、显色双信号试纸条的制备方法，制备步骤如下：
(1)合成雌激素-牛血清蛋白偶联物E-BSA；
(2)对长余辉粒子PLPs进行羧基修饰；
(3)制备偶联E-BSA的长余辉粒子复合物E-BSA-PLPs，在PBS溶液中储存备用；
(4)构建试纸：T区滴加E-BSA-PLPs，C区滴加二抗，干燥后于真空袋中保存备用。
进一步的，所述的步骤(3)使用活性酯法进行生物偶联，具体方法为：将被羧基修饰过的长余辉粒子超声分散至磷酸盐缓冲溶液PBS中；然后加入1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，室温条件下持续搅拌后离心，除去上清液，并用PBS洗涤；再加入E-BSA，持续搅拌过夜，通过离心收集偶联产物，随后用PBS洗涤后再复溶于PBS中备用。
进一步的，所述步骤(4)中，T区滴加含有0.5-5mg/mL E-BSA-PLPs的5-20mM PBS溶液，C区滴加含有0.05-0.5mg/mL二抗的5-20mM PBS溶液。
进一步的，所述的步骤(2)采用雌激素羧甲基醚E-CME、BSA通过活性酯法合成E-BSA，所述步骤(3)采用长余辉粒子PLPs、羧乙基硅烷三醇钠CES，进行羧合反应得羧基修饰的长余辉粒子。
本发明的另一种目的在于，提供一种用于检测雌激素的检测装置，包括试纸条和雌激素单克隆抗体修饰的胶体金CG-mAb，所述试纸条为上述的雌激素的时间分辨荧光、显色双信号试纸条，所述检测装置以试纸条上的雌激素-牛血清蛋白-长余辉粒子复合物为荧光供体，以雌激素单克隆抗体修饰的胶体金为荧光受体。
进一步的，制备雌激素单克隆抗体修饰的胶体金的方法为：制备胶体金并修饰一抗即雌激素单克隆抗体，得到雌激素单克隆抗体修饰的胶体金CG-mAb，所述用于修饰胶体金的单克隆抗体来源包括但不限于小鼠、大鼠、兔。所述雌激素单克隆抗体修饰的胶体金以溶液或冻干粉末的状态保存于包括离心管在内的密闭容器中。对应的，所述质控区固定的二抗是针对一抗来源的二抗。
进一步的，C区作为验证试纸结果有效性的参照，始终显红色、无荧光；T区的时间分辨荧光强度与样品中雌激素含量呈正相关，显色强度与样品中雌激素含量呈负相关，具体为：
当样品不含雌激素时，T区显红色、荧光猝灭；
当样品中含有雌激素时，T区显浅红色甚至消线、荧光增强。
进一步的，该检测装置的应用方法如下：将待测样品与CG-mAb置于运行缓冲液中混合3-10min，放入试纸条，15-30min后读取显色结果；所述运行缓冲液为8-15mmol/L包含5-15％蔗糖、6-10％BSA、0.15-0.30％吐温-20的pH 6.5-8.0的缓冲液，所述缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液；
显色完成后，将试纸条置于紫外灯下激发，使用荧光图像采集设备获取紫外光源关闭前后的荧光图像，读取荧光结果。
更进一步的，所述荧光图像采集设备包括智能手机，所述智能手机以连拍模式获取紫外光源关闭前后的荧光图像，获得时间分辨荧光照片。
本发明的雌激素快速时间分辨荧光、显色双信号免疫层析试纸条检测原理，以雌二醇为例解释如下：C区作为验证试纸结果有效性的参照，始终显红色、不发荧光。样品溶液和CG-mAb预混合后在毛细作用下向吸水纸方向移动，当样品中没有雌二醇时，CG-mAb被T区E2-BSA-PLPs捕获，肉眼可见T区显红色，而E2-BSA-PLPs和CG-mAb之间发生FRET使长余辉粒子荧光猝灭，多余的CG-mAb会被C区的二抗捕获从而C区也显红色；当样品中含有雌二醇时，雌二醇与部分CG-mAb结合从而减少了T区捕获的CG-mAb总量，肉眼可见T区显浅红色甚至消线，而E2-BSA-PLPs和CG-mAb之间的FRET减少甚至消失，使长余辉粒子的荧光恢复。随着样品中雌二醇浓度的增大，被捕获于T区的CG-mAb越来越少，T区变淡，与分析物浓度呈反比，而长余辉粒子的亮度逐渐增大，与分析物浓度呈正比。
有益效果：本发明的雌激素快速时间分辨荧光、显色双信号免疫层析试纸条基于荧光共振能量转移原理，以余辉优良、微米尺寸的长余辉粒子为T区固定荧光探针，低功率紫外灯激发结合智能手机拍摄实现TRF模式荧光采集，有效去除试纸荧光背景干扰进而提高信噪比。该方法具有比胶体金显色法低两个数量级的检测限(可达到0.1mg/mL)和较好的特异性，较同类荧光检测试纸光背景污染更少，且检测速度快，适用于现场筛查。
附图说明
图1为本发明试纸条时间分辨荧光、显色双信号侧流层析示意图；
图2为本发明试纸条对加标饮用水水样的响应：显色模式(A)，TRF模式(B)
图3为本发明试纸条的工作曲线：显色模式(A)，TRF模式(B)；
图4为本发明试纸条对不同浓度雌二醇的响应图：显色模式(A)，TRF模式(B)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例以雌二醇作为雌激素的示例，对整个试纸条的制备、检测装置的使用进行充分详细的说明。
实施例1：雌二醇快速时间分辨荧光、显色双信号免疫层析试纸条及其检测装置的制备及水样检测
1.试纸材料的制备
1.1制备胶体金
采用柠檬酸钠还原法制备胶体金，通过吸附作用与雌二醇单克隆抗体偶联制备CG-mAb，离心(30min，4℃，10000r/min)后的产物以0.2mL重悬缓冲液(20mmol/L硼酸盐缓冲液含5％蔗糖，1％BSA，pH 8.2)溶解储存备用。
1.2合成雌二醇羧甲基醚(E2-CME)和E2-BSA偶联物
称取100mg雌二醇和0.5g KCl溶解于6mL二甲基亚砜(DMSO)中，超声反应5min。在搅拌条件下，加入100mg溴乙酸，反应2h后加入50mL冰水终止反应。用乙酸乙酯萃取收集未反应的雌二醇，向水相中逐滴加入2mol/L盐酸酸化，随之出现白色沉淀，离心后去除上清液，将沉淀用超纯水离心洗涤至pH值为7左右后真空冷冻干燥，得E2-CME。
采用活性酯法合成E2-BSA，具体实验操作为：称取3.3mg E2-CME溶于0.5mL DMSO中，并加入6mg NHS和7mg EDC·HCl，搅拌反应12h。称取20mg BSA溶解于4mL碳酸盐缓冲溶液(CBS)(50mM，pH 9.6)，将活化好的E2-CME溶液缓慢滴加到CBS溶液中继续搅拌反应12h。反应结束后，将混合物转移到透析袋中并放入1L PBS(10mM，pH7.4)溶液中进行透析。每12h更换一次透析液，连续透析3天。透析结束后，分装冷冻保存，即得E2-BSA偶联物。
1.3长余辉粒子修饰
称取30mg长余辉粒子PLPs，并加5mL无水乙醇于10mL离心管中超声分散。在50mL圆底烧瓶中加入20mL无水乙醇，5mL水，0.13mL正硅酸四乙酯(TEOS)，在搅拌条件下迅速将长余辉无水乙醇溶液加入到圆底烧瓶中，超声10min使得溶液充分混匀。然后向溶液中加入0.5mL氨水(28-30％)，超声30min后转移到磁力搅拌器上搅拌反应7.5h。反应结束后，用无水乙醇离心(10000rpm，10min)洗涤3次，所得的产物真空干燥，备用。将25mg二氧化硅封装后的长余辉粒子超声分散至25mL水中，在电磁搅拌条件下，向反应液中加入100μL羧乙基硅烷三醇钠(carboxyethylsilanetriol sodium salt，CES)，然后在室温下持续搅拌24h。搅拌结束后离心分离，沉淀用超纯水洗涤2次，无水乙醇洗涤2次，室温真空干燥，得羧基修饰的长余辉粒子，备用。
1.4 E2-BSA-PLPs复合物制备
以活性酯法将E2-BSA与修饰了羧基的长余辉粒子进行偶联制备E2-BSA-PLPs复合物，具体方法为：将被羧基修饰过的长余辉粒子超声分散至磷酸缓冲盐溶液PBS中；然后加入6mg 1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl和15mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，室温条件下持续搅拌后离心，除去上清液，并用PBS洗涤；再加入1mL浓度为1mg/mL的E2-BSA，持续搅拌过夜，通过离心收集偶联产物，随后用PBS洗涤后再复溶于PBS中备用。产物以2mg/mL(以长余辉粒子浓度计算)在PBS溶液中储存备用。
1.5检测区(T区)溶液的配制
用10mM PBS溶液将E2-BSA-PLPs稀释成2mg/mL。
1.6质控区(C区)溶液的配制
用10mM PBS溶液将羊抗鼠二抗稀释成0.1mg/mL。
2.试纸条的制备
按照图1的模组合方式，将NC膜粘贴在PVC底板中间，样品垫与吸水垫分别搭接于NC膜左右两端，将搭建好的大卡切割成3mm宽度的纸条，即得到空白试纸条。分别在图1中T区和C区滴加1.0μL T区溶液和0.5μL C区溶液。将点样之后的试纸条放在烘箱中，在37℃条件下干燥30min，于真空袋中保存备用。
3.工作曲线绘制
用甲醇配置10mL 1mg/mL E2标准溶液，用10mM PBS稀释到浓度为0mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL，作为待测液备用。将80μL待测液与20μLCG-mAb和10μL运行缓冲液(10mmol/L磷酸盐缓冲液，含10％蔗糖，8％BSA，0.25％吐温-20，pH 7.4)在离心管中混合5min，然后将试纸条插入离心管，25min后读取结果，显色模式的结果如图4A，相应的工作曲线为图3A，TRF模式的结果如图4B，相应的工作曲线为图3B。结果显示，显色模式下，阴性和低浓度阳性试纸T区呈现明显紫红色，E2浓度增加至5ng/mL时T区颜色变淡，10ng/mL时T区颜色消失(图4A)，以此浓度为显色法检测限；TRF模式下，阴性T区无明显荧光，E2浓度为0.1ng/mL时T区发出微弱的光(图4B)，以此浓度为TRF法检测限。因此，所构建的TRF型试纸的检测限可以达到0.1mg/mL。C区作为验证试纸结果有效性的参照，始终显红色、不发荧光。
4.样品预处理
量取1mL液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)检测结果显示未检出雌二醇的饮用水水样，分别加入800μL浓度为0mg/mL、0.10mg/mL、1mg/mL、10mg/mL的E2标准溶液，作为待测液备用。
5.样品检测
将80μL待测液与20μL CG-mAb和10μL运行缓冲液(10mmol/L磷酸盐缓冲液，含10％蔗糖，8％BSA，0.25％吐温-20，pH 7.4)在离心管中混合5min，然后将试纸条插入离心管，25min后读取显色结果。显色完成后，将试纸条置于紫外灯下激发，使用智能手机获取紫外光源关闭前后的荧光图像，读取荧光结果。结果如图2所示，可以检出0.1ng/mL及以上加标E2。而且，分析可在约30分钟内完成。
实施例2：雌二醇快速时间分辨荧光、显色双信号免疫层析试纸条检测牛奶，包括以下步骤：
1.试纸材料的制备
同实施例1
2.试纸条的制备
同实施例1
3.工作曲线绘制
同实施例1
4.样品预处理
牛奶样品(HPLC-MS检测结果显示未检出雌二醇)在10℃经过8000r/min离心10min后弃掉上层乳脂，获得脱脂牛奶。用去离子水按照体积比1:20稀释，过滤，量取4份(每份1mL)于10mL的离心管中，作为待测液备用。
5.样品检测
将80μL待测液与20μL CG-mAb和10μL运行缓冲液(10mmol/L磷酸盐缓冲液，含10％蔗糖，8％BSA，0.25％吐温-20，pH 7.4)在离心管中混合5min，然后将试纸条插入离心管，25min后读取显示结果。显色完成后，将试纸条置于紫外灯下激发，使用智能手机获取紫外光源关闭前后的荧光图像，读取荧光结果。结果显示为低于定量限，即低于检出限。
实施例3：雌二醇快速时间分辨荧光、显色双信号免疫层析试纸条检测猪肉，包括以下步骤：
1.试纸材料的制备
同实施例1
2.试纸条的制备
同实施例1
3.工作曲线绘制
同实施例1
4.样品预处理
称取剔除了骨、猪皮的猪肉(HPLC-MS检测结果显示未检出雌二醇)肌肉组织样本100g，用搅碎机将猪肉样品搅碎到一定程度后取适量肉样于组织捣碎匀浆机中搅成肉糜状，分别称取肉糜状的猪肉4份(每份1g)于离心管中，加入乙酸乙酯3ml，无水氧化钙0.1g，用漩涡振荡器于最大振荡速度下振荡2min，离心机在4000rpm离心min，移取上清液于另一试管，氮气吹干，加入1mL正丁烷溶解残渣，加入PH＝7.0的PBS-甲醇溶液(3:2)0.5mL，漩涡振荡器振荡2min，再用离心机在4000rpm离心10min，吸取除去上层正丁烷层，取下层溶液作为待测液。
5.样品检测
将80μL待测液与20μL CG-mAb和10μL运行缓冲液(10mmol/L磷酸盐缓冲液，含10％蔗糖，8％BSA，0.25％吐温-20，pH 7.4)在离心管中混合5min，然后将试纸条插入离心管，25min后读取显色结果。显色完成后，将试纸条置于紫外灯下激发，使用智能手机获取紫外光源关闭前后的荧光图像，读取荧光结果。结果显示为低于定量限，即低于检出限。
实施例1说明了该试纸条可以检出0.1ng/mL及以上加标E2。而且，分析可在约30分钟内完成，检测时间较短。试纸条及相关检测用材料存放条件温和，可应用场景广泛，能适应不同的场合使用，如实施例2、3。
综上，本发明的试纸条及相应的检测装置具有良好的雌二醇检测性能及适用性，同理，也可推广至与雌二醇具有相同的酚羟基结构且具有雌激素效应的雌激素以及类雌激素，如雌三醇、雌酮、双酚A、己烯雌酚、炔雌醇等，使用时将对应雌激素单克隆单体相应替换为与各雌激素对应的雌激素单克隆单体即可。这些雌激素结构中的酚羟基可以通过一系列化学反应衍生出羧基，然后通过此羧基将雌激素偶联在载体上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种雌激素的时间分辨荧光、显色双信号试纸条，其特征在于：所述试纸条结构为PVC底板上沿水平方向依次交叠粘贴有样品垫、硝酸纤维素膜即NC膜、吸收垫，所述NC膜两端位于交叠下层；
所述NC膜包括检测区即T区、质控区即C区；
所述检测区上固定有雌激素-牛血清蛋白-长余辉粒子E-BSA-PLPs，所述雌激素为具有酚羟基且具有雌激素效应的雌激素化合物以及类雌激素化合物，包括雌二醇、雌三醇、雌酮、双酚A、己烯雌酚、炔雌醇；
所述质控区上固定有二抗。
2.根据权利要求1所述的雌激素的时间分辨荧光、显色双信号试纸条，其特征在于：所述质控区固定的二抗包括但不限于羊抗鼠二抗、兔抗鼠二抗、羊抗兔二抗、驴抗兔二抗。
3.根据权利要求1所述的雌激素的时间分辨荧光、显色双信号试纸条的制备方法，其特征在于：制备步骤如下：
(1)合成雌激素-牛血清蛋白偶联物E-BSA；
(2)对长余辉粒子PLPs进行羧基修饰；
(3)制备偶联E-BSA的长余辉粒子复合物E-BSA-PLPs；
(4)构建试纸：T区滴加E-BSA-PLPs，C区滴加针对一抗来源的二抗，干燥后于真空袋中保存备用。
4.如权利要求3所述的雌激素的时间分辨荧光、显色双信号试纸条的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)使用活性酯法进行生物偶联，具体方法为：将被羧基修饰过的长余辉粒子超声分散至磷酸盐缓冲溶液PBS中；然后加入1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，室温条件下持续搅拌后离心，除去上清液，并用PBS洗涤；再加入E-BSA，持续搅拌过夜，通过离心收集偶联产物，随后用PBS洗涤后再复溶于PBS中备用。
5.如权利要求3所述的雌激素的时间分辨荧光、显色双信号试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中，T区滴加含有0.5-5mg/mL E-BSA-PLPs的5-20mM PBS溶液，C区滴加含有0.05-0.5mg/mL二抗的5-20mM PBS溶液。
6.如权利要求3所述的雌激素的时间分辨荧光、显色双信号试纸条的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)采用雌激素羧甲基醚E-CME、BSA通过活性酯法合成E-BSA，所述步骤(3)采用长余辉粒子PLPs、羧乙基硅烷三醇钠CES，进行羧合反应得羧基修饰的长余辉粒子。
7.一种用于检测雌激素的检测装置，其特征在于：包括试纸条和雌激素单克隆抗体修饰的胶体金CG-mAb，所述试纸条为根据权利要求1或2所述的，或权利要求3-6任一所述方法制备的雌激素的时间分辨荧光、显色双信号试纸条，所述检测装置以试纸条上的雌激素-牛血清蛋白-长余辉粒子复合物为荧光供体，以雌激素单克隆抗体修饰的胶体金为荧光受体。
8.根据权利要求7所述的用于检测雌激素的检测装置，其特征在于：C区作为验证试纸结果有效性的参照，始终显红色、无荧光；T区的时间分辨荧光强度与样品中雌激素含量呈正相关，显色强度与样品中雌激素含量呈负相关，具体为：
当样品不含雌激素时，T区显红色、荧光猝灭；
当样品中含有雌激素时，T区显浅红色甚至消线、荧光增强。
9.根据权利要求7所述的用于检测雌激素的检测装置，其特征在于：该检测装置的应用方法如下：将待测样品与CG-mAb置于运行缓冲液中混合3-10min，放入试纸条，15-30min后读取显色结果；所述运行缓冲液为8-15mmol/L包含5-15％蔗糖、6-10％BSA、0.15-0.30％吐温-20的pH 6.5-8.0的缓冲液，所述缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液；
显色完成后，将试纸条置于紫外灯下激发，使用荧光图像采集设备获取紫外光源关闭前后的荧光图像，读取荧光结果。
10.根据权利要求9所述的用于检测雌激素的检测装置，其特征在于：所述荧光图像采集设备包括智能手机，所述智能手机以连拍模式获取紫外光源关闭前后的荧光图像，获得时间分辨荧光照片。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113588959A (zh) * 2021-09-10 2021-11-02 河南农业大学 一种用于检测T-2毒素的turn-on型试纸条及其制备方法
CN114280046A (zh) * 2021-12-28 2022-04-05 江南大学 检测微生物的比色-光热双模式试纸条及其制备方法
CN114280047A (zh) * 2021-12-28 2022-04-05 江南大学 一种检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条及其制备方法
WO2022193689A1 (zh) * 2021-03-15 2022-09-22 江南大学 雌激素的时间分辨荧光、显色双信号试纸条及其制备方法与应用
ES2939335A1 (es) * 2021-10-20 2023-04-20 Consejo Superior Investigacion Biosensor de estrogenos

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102253222A (zh) * 2011-04-21 2011-11-23 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 检测雌激素的方法及其专用试纸
CN105929155A (zh) * 2016-07-08 2016-09-07 同济大学 免疫层析试纸及其检测方法
CN107656075A (zh) * 2016-07-26 2018-02-02 陆奕娜 雌二醇快速时间分辨免疫层析定量检测试纸条
CN109781687A (zh) * 2019-01-29 2019-05-21 南开大学 一种复合荧光纳米探针的制备方法及其体内应用
CN110596060A (zh) * 2019-09-12 2019-12-20 江南大学 一种检测前列腺特异性抗原的光谱分析中荧光传感器的构建方法及其应用
CN111257564A (zh) * 2018-11-30 2020-06-09 江苏维赛科技生物发展有限公司 一种采用上转换发光免疫层析法测定己烯雌酚的方法
CN111426827A (zh) * 2020-03-17 2020-07-17 哈尔滨工业大学(深圳)(哈尔滨工业大学深圳科技创新研究院) 基于长余辉材料的标记溶液、免疫层析试纸及其应用
CN111624186A (zh) * 2020-06-24 2020-09-04 江南大学 一种基于荧光和拉曼双信号增强的肠毒素光谱分析方法
CN111978953A (zh) * 2020-09-16 2020-11-24 复旦大学 一种基于氟硼二吡咯发光体的长余辉发光组合物及应用
CN212301577U (zh) * 2020-04-28 2021-01-05 上海泰辉生物科技有限公司 长余辉-胶体金联用检测新冠病毒的免疫层析试纸条

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060068501A1 (en) * 2004-09-30 2006-03-30 Nj International Llc Apparatus and methods for steroid hormone testing
GB2522262A (en) * 2014-01-20 2015-07-22 Univ Ningbo Test strip and a preparation method of the test strip for upconversion of fluorescence chromatography of a type of bisphenol A
KR101860543B1 (ko) * 2015-01-09 2018-05-24 한양대학교 에리카산학협력단 성호르몬 검출용 시약 키트 및 이를 이용한 성호르몬 검출 방법
WO2018174733A1 (en) * 2017-03-21 2018-09-27 Gdanski Uniwersytet Medyczny Method for determining bisphenol a in biological material, diagnostic device for detection of bisphenol a in biological material, diagnostic kit for detection of bisphenol a in biological material
CN208060533U (zh) * 2018-04-17 2018-11-06 河南联合利民生物科技有限公司 一种水产品中雌二醇胶体金快速检测试纸条
CN113063954A (zh) * 2021-03-15 2021-07-02 江南大学 雌激素的时间分辨荧光、显色双信号试纸条及其制备方法与应用

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102253222A (zh) * 2011-04-21 2011-11-23 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 检测雌激素的方法及其专用试纸
CN105929155A (zh) * 2016-07-08 2016-09-07 同济大学 免疫层析试纸及其检测方法
CN107656075A (zh) * 2016-07-26 2018-02-02 陆奕娜 雌二醇快速时间分辨免疫层析定量检测试纸条
CN111257564A (zh) * 2018-11-30 2020-06-09 江苏维赛科技生物发展有限公司 一种采用上转换发光免疫层析法测定己烯雌酚的方法
CN109781687A (zh) * 2019-01-29 2019-05-21 南开大学 一种复合荧光纳米探针的制备方法及其体内应用
CN110596060A (zh) * 2019-09-12 2019-12-20 江南大学 一种检测前列腺特异性抗原的光谱分析中荧光传感器的构建方法及其应用
CN111426827A (zh) * 2020-03-17 2020-07-17 哈尔滨工业大学(深圳)(哈尔滨工业大学深圳科技创新研究院) 基于长余辉材料的标记溶液、免疫层析试纸及其应用
CN212301577U (zh) * 2020-04-28 2021-01-05 上海泰辉生物科技有限公司 长余辉-胶体金联用检测新冠病毒的免疫层析试纸条
CN111624186A (zh) * 2020-06-24 2020-09-04 江南大学 一种基于荧光和拉曼双信号增强的肠毒素光谱分析方法
CN111978953A (zh) * 2020-09-16 2020-11-24 复旦大学 一种基于氟硼二吡咯发光体的长余辉发光组合物及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GAOSHUANG HU 等: "Fluorescent quenching immune chromatographic strips with quantum dots and upconversion nanoparticles as fluorescent donors for visual detection of sulfaquinoxaline in foods of animal origin", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022193689A1 (zh) * 2021-03-15 2022-09-22 江南大学 雌激素的时间分辨荧光、显色双信号试纸条及其制备方法与应用
CN113588959A (zh) * 2021-09-10 2021-11-02 河南农业大学 一种用于检测T-2毒素的turn-on型试纸条及其制备方法
ES2939335A1 (es) * 2021-10-20 2023-04-20 Consejo Superior Investigacion Biosensor de estrogenos
WO2023067210A1 (es) * 2021-10-20 2023-04-27 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Biosensor de estrógenos
CN114280046A (zh) * 2021-12-28 2022-04-05 江南大学 检测微生物的比色-光热双模式试纸条及其制备方法
CN114280047A (zh) * 2021-12-28 2022-04-05 江南大学 一种检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条及其制备方法
CN114280046B (zh) * 2021-12-28 2024-01-05 江南大学 检测微生物的比色-光热双模式试纸条及其制备方法
CN114280047B (zh) * 2021-12-28 2024-01-05 江南大学 一种检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条及其制备方法

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