CN114280047B - 一种检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测小分子化合物的比色‑光热双模式试纸条及其制备方法，包括以下步骤：(1)制备Au‑CuFeSe2复合物纳米颗粒，表面吸附待测物抗体即一抗得到信号探针；(2)组装试纸条，在检测区和质控区上分别固定待测物抗原和二抗；(3)将信号探针与待测样品液混合后将试纸条样品垫端插入该混合液中进行层析；(4)比色模式：检测区颜色深度与样品待测物浓度成反比，肉眼定性、灰度分析定量；(5)光热模式：以808nm激光照射检测区并用热成像或测温设备采集温度，根据检测区温度与样品待测物浓度的线性关系进行定量分析。本发明检测模式灵活、线性范围宽、灵敏性高、特异性好。
Description
技术领域
本发明属于小分子分析检测技术领域，具体涉及一种检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条及其制备方法。
背景技术
侧流免疫层析试纸(LFIA)具有分析性能快、选择性良好、成本低、样品量要求小、易于大规模生产以及可稳定的长期储存的特点，被广泛应用于便携式分析检测传感器的设计中。
传统的LFIA中，胶体金纳米粒子通常被用作信号探针。肉眼可以直接观察进行定性或半定量检测。然而，以胶体金为主的比色型LFIA存在灵敏度低、线性范围窄和缺乏定量分析等缺陷。为提高分析检测的灵敏度，研究人员通过使用各种荧光纳米粒子作为探针，开发了荧光型LFIA，然而，这些荧光物质受到自发荧光的干扰，导致信噪比较低。此外，通常用昂贵且复杂的仪器进行信号采集，这也降低了其现场检测的适用性。
近年来，金纳米粒子的表面等离子体共振效应(LSPR)被发现，以光热信号探针的形式再次运用到了LFIA中，与比色模式相比，灵敏度提高了几十至上百倍，光热型LFIA开始受到研究人员们的关注与探索，此类检测方式的信号由光热效应引起温度变化，背景信号较低，传感灵敏，可以在不同颜色的各种基底上进行，有强大的应用潜力。目前仍然需要具有更高光热转换效率的新纳米材料作为信号探针形成更明显的热反差，以进一步提高光热型LFIA的性能。
因此如何开发一种新纳米材料，应用到比色-光热双模式的检测试纸中，显得十分必要。
发明内容
为解决相关技术中的技术问题，本发明提供一种高光热转换效率的Au-CuFeSe2复合材料在制备比色-光热双模式试纸条、制备方法及应用，所述试纸条用于检测小分子化合物，以实现一种以更低的检测限、更宽的检测范围和更好的特异性，较其他光热检测试纸灵敏度更高的检测方式。
一方面，本发明提供一种检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条，用于检测小分子化合物，所述试纸条包含试纸条主体和信号探针两部分：
所述试纸条主体包含：在PVC底板上沿水平方向依次从上到下交叠粘贴有样品垫、硝酸纤维素膜即NC膜、吸收垫；其中，硝酸纤维素膜用于实现样品中分析物与其他物质的分离和检测，样品垫用于上样，吸收垫用于吸收过量液体，PVC底板为试纸提供物理支撑；
所述硝酸纤维素膜包括检测区即T区、质控区即C区；其中，T区上固定有待测物抗原，即待测分子-蛋白偶联物；C区上固定有二抗，二抗是针对一抗来源的二抗，即抗一抗；
所述信号探针包含Au-CuFeSe2复合材料、待测物抗体即一抗、牛血清蛋白三者的混合物，即Au-CuFeSe2-mAb混合液；
所述信号探针以独立于所述比色-光热双模式试纸条主体结构的形式使用，或者将信号探针干燥于结合垫上，将所述结合垫插入所述样品垫与所述NC膜之间使用。
作为一种可选的实施方式，所述待测物抗原为抗原位点较少或仅具有单个抗原位点的小分子化合物，包括但不限制于黄曲霉毒素、镰刀菌毒素等真菌毒素，杀菌剂、抗生素、激素等农兽药残留等。
作为一种可选的实施方式，所述待测物抗体即一抗来源包括但不限于小鼠、大鼠、兔。
作为一种可选的实施方式，所述二抗包括但不限于羊抗鼠二抗、兔抗鼠二抗、羊抗兔二抗、驴抗兔二抗。
另一方面，提供一种检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条的制备方法，所述比色-光热双模式试纸条的制备方法，包括：
制备信号探针Au-CuFeSe2复合材料；
制备Au-CuFeSe2复合材料、待测物抗体、牛血清蛋白的Au-CuFeSe2-mAb混合液；
构建试纸：T区滴加或喷涂待测物抗原，C区滴加或喷涂针对一抗来源的二抗，即抗一抗，干燥后于真空袋中保存备用；
将信号探针，即Au-CuFeSe2-mAb混合液，以溶液或冻干粉的状态保存于密闭容器中；或者将信号探针，即Au-CuFeSe2-mAb混合液，干燥于结合垫上、将结合垫插入样品垫与NC膜之间使用。
作为一种可选的实施方式，所述制备信号探针Au-CuFeSe2复合材料的具体方法为：将用湿化学方法在水溶液中制备的CuFeSe2纳米晶分散液进行稀释，取稀释后的CuFeSe2溶液于离心管中，加入柠檬酸三钠溶液，混匀后加入HAuCl4溶液，加入超纯水，然后室温下振荡反应，溶液颜色由浅棕色变为紫色，得到Au-CuFeSe2复合材料，冷藏备用。
作为一种可选的实施方式，所述制备Au-CuFeSe2复合材料、待测物抗体、牛血清蛋白的Au-CuFeSe2-mAb混合液，具体方法为：取Au-CuFeSe2复合材料于离心管中，加入弱碱性溶液调节体系的pH至6～8，振荡混匀再加入待测物抗体，在室温下振荡反应30～60min后，加入牛血清白蛋白BSA封闭，在室温下振荡反应1～1.5h，经离心后去除上清液，再将剩余物质复溶于缓冲液中，得到Au-CuFeSe2-mAb混合液，冷藏备用。
作为一种可选的实施方式，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。
作为一种可选的实施方式，所述T区滴加或喷涂待测物抗原，具体为：T区滴加或喷涂含有0.5-10mg/mL待测物抗原的5-20mM PBS溶液；所述C区滴加或喷涂针对一抗来源的二抗，即抗一抗，具体为：C区滴加或喷涂含有0.05-10mg/mL二抗的5-20mM PBS溶液。
另一方面，所述检测区的光热温度与待测小分子化合物含量呈负相关，显色强度与样品中小分子化合物含量呈负相关，具体为：
当样品不含小分子化合物时，T区显紫色、温度高；
当样品中含有小分子化合物时，T区显浅紫色甚至消线、温度降低；
所述质控区作为验证试纸结果有效性的参照，始终显紫色。
另一方面，提供一种检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条的应用，用于检测小分子化合物，具体包括：
将待测样品与Au-CuFeSe2-mAb溶液置于运行缓冲液中混合3-10min，放入试纸条，15-30min后读取比色结果，进行半定量分析；获得比色结果照片，利用图像处理软件进行灰度分析，进行定量分析；
试纸干燥后，将试纸条置于808nm激光光源下激发，使用热成像或测温设备获取温度结果。
又一种检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条的应用，用于检测小分子化合物，具体包括：
将信号探针，即Au-CuFeSe2-mAb混合液，干燥于结合垫上、将结合垫插入样品垫与NC膜之间。将待测样品与运行缓冲液混合，放入所述的试纸条，20-40min后读取比色结果，进行半定量分析；获得比色结果照片，利用图像处理软件进行灰度分析，进行定量分析；
试纸干燥后，将试纸条置于808nm激光光源下激发，使用热成像或测温设备获取温度结果，进行定量分析。
作为一种可选的实施方式，所述的运行缓冲液为pH 6.5～8.0，总浓度为10mM的PBS溶液，以下组分含量为质量百分比，具体包含：0～15％蔗糖，1～10％BSA，0.15～1％吐温-20。
作为一种可选的实施方式，所述热成像或测温设备包括但不限于手机红外热成像分析配件、红外热成像仪或者测温枪。
作为一种可选的实施方式，所述智能显示端包括但不限于电脑、智能手机。
作为一种可选的实施方式，所述热成像设备采集光热成像照片，并通过与之相连的智能显示端得以输出显示。
本发明的检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条检测原理，以脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)为例解释如下：质控区(C区)作为验证试纸结果有效性的参照，始终显紫色。样品溶液和Au-CuFeSe2-mAb预混合后在毛细作用下向吸水纸方向移动，当样品中没有DON时，Au-CuFeSe2-mAb被T区DON-BSA捕获，肉眼可见T区显紫色，而在激光的激发下Au-CuFeSe2-mAb产生LSPR效应，温度升高。多余的Au-CuFeSe2-mAb会被C区的二抗捕获从而C区也显紫色；当样品中含有DON时，DON与部分Au-CuFeSe2-mAb结合从而减少了T区捕获的Au-CuFeSe2-mAb总量，肉眼可见T区显浅紫色甚至消线，而T区Au-CuFeSe2-mAb的LSPR效应减少甚至消失，温度下降。随着样品中DON浓度的增大，被捕获于T区的Au-CuFeSe2-mAb越来越少，T区变淡且温度逐渐降低，与分析物浓度呈反比。
本发明至少包含以下有益效果：
(1)本发明提供的Au-CuFeSe2复合材料应用在制备比色-光热双模式试纸条的应用比色-光热双模式试纸条的中，无需改变试纸条的常规结构，作为信号探针使用，既可以独立于所述的比色-光热双模式试纸条形式使用，方便存放，也可以固定在试纸的结合垫上使用，方便携带。
(2)本发明提供的包含比色-光热双模式试纸条的检测方法，用于检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条基于等离子体共振效应，以高光热转换效率、微小尺寸的Au-CuFeSe2复合材料为T区固定信号探针，近红外激光光源激发，结合智能终端及红外热成像配件实现光热信号的采集，有效去除样品液基底颜色以及试纸荧光背景干扰进而提高信噪比。
(3)本发明提供的检查方法具有更低的检测限、更宽的检测范围和较好的特异性，较其他光热检测试纸灵敏度更高，适用于小分子化合物的快速检测。
附图说明
图1为本发明试纸条比色-光热双模式侧流层析示意图；
图2为本发明试纸条含有结合垫时的结构示意图；
图3为本发明试纸条比色模式下对不同浓度脱氧雪腐镰刀菌烯醇水样的响应情况(A)以及工作曲线(B)；
图4为本发明试纸条光热模式下对不同浓度脱氧雪腐镰刀菌烯醇水样的响应情况(A)以及工作曲线(B)；
图5为本发明针对脱氧雪腐镰刀菌烯醇试纸条对不同毒素特异性的响应情况。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例以脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)作为待检测的小分子化合物的示例，对整个试纸条的制备、检测装置的使用进行充分详细的说明。
实施例1原材料的制备
1.1制备CuFeSe2纳米晶
采用湿化学方法在水溶液中制备CuFeSe2纳米晶。将39.48mg Se粉分散在100mL超纯水中，然后加入50mg NaBH4，在氮气流保护的环境条件下进行还原。分别制备CuCl2·2H2O(42.62mg)、FeSO4·7H2O(69.75mg)和PTMP-PMAA(400mg)的5ml混合物。待硒粉完全还原后，立即将上述混合物加入硒前体溶液中，形成黑色溶液。将所得溶液以3500rpm的速度通过分子量截止(MWCO)为100kDa的膜进行超滤。上清液用超纯水(MWCO为8-14kDa)透析48小时以去除杂质。纯化后的CuFeSe2NC溶液采用类似的超滤方法浓缩，4℃保存备用。
1.2制备Au-CuFeSe2复合材料
将CuFeSe2分散液稀释至体积分数为10％，取320μL稀释后的CuFeSe2溶液于离心管中，加入20μL浓度为194mmol/L的柠檬酸三钠溶液，混匀后加入50μL HAuCl4溶液(m/v＝1％)，加入超纯水3.59mL然后立即置于涡旋振荡器上，室温下振荡反应10min，溶液颜色由浅棕色变为紫色，即可得到Au与CuFeSe2的复合纳米材料Au-CuFeSe2。
1.3 Au-CuFeSe2与抗体吸附：制备Au-CuFeSe2复合材料、待测物抗体、牛血清蛋白的Au-CuFeSe2-mAb混合液
取1mL Au-CuFeSe2于离心管中，加入4μL 0.2mol/L K2CO3溶液调节体系的pH值，振荡混匀再加入5μL1mg/mL DON抗体，混匀后于室温下振荡反应45min。反应结束后，加入100μL BSA(m/m＝5％)封闭1h，经12000r/min离心30min，去除上清液，再重溶于100μL缓冲液(20mmol/L Na3PO4、5％BSA、0.25％Tween-20、10％蔗糖)中，得到Au-CuFeSe2-mAb混合液，4℃环境中保存备用。
1.4检测区(T区)溶液的配制
用10mM PBS溶液将DON-BSA稀释成0.6mg/mL。
1.5质控区(C区)溶液的配制
用10mM PBS溶液将羊抗鼠二抗稀释成0.4mg/mL。
实施例2试纸条的制备
按照图1的模组合方式，将NC膜粘贴在PVC底板中间，样品垫与吸水垫分别搭接于NC膜左右两端，使其覆压NC膜2mm左右，将搭建好的大卡切割成3mm宽度的纸条，即得到空白试纸条。分别在图1中T区和C区滴加0.5μL T区溶液和0.5μL C区溶液。将点样之后的试纸条放在烘箱中，在37℃条件下干燥60min，于真空袋中保存备用。
实施例3含有结合垫版试纸条的制备
按照图2的模组合方式，将NC膜粘贴在PVC底板中间，结合垫右端搭接于NC膜的左端，使其覆压NC膜2mm左右，样品垫搭接于结合垫的左端，使其覆压结合垫2mm左右，吸水垫搭接于NC膜的右端，使其覆压NC膜2mm左右，将搭建好的大卡切割成3mm宽度的纸条，即得到空白试纸条。结合垫上固定10μLAu-CuFeSe2复合材料、待测物抗体、牛血清蛋白的混合液，即Au-CuFeSe2-mAb混合液。分别在图2中T区和C区滴加0.5μL T区溶液和0.5μL C区溶液。将点样之后的试纸条放在烘箱中，在37℃条件下干燥60min，于真空袋中保存备用。
实施例4工作曲线绘制
4.1比色模式下工作曲线的绘制
用乙腈配置10mL 1mg/mL DON标准溶液，用10mM PBS稀释到浓度为0ng/mL、0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.5ng/mL、0.75ng/mL、1 ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、5ng/mL、7ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，作为待测液备用。将80μL待测液与10μLAu-CuFeSe2-mAb和10μL运行缓冲液(10mM PBS溶液，含5％蔗糖，1％BSA，1％吐温-20，pH7.4)在离心管中混合10min，然后将试纸条插入离心管，25min后读取结果，比色模式的结果如图3(A)，相应的工作曲线为图3(B)。
4.2光热模式下工作曲线的绘制
用乙腈配置10mL 1mg/mL DON标准溶液，用10mM PBS稀释到浓度为10-2pg/mL、10- 1pg/mL、100pg/mL、101pg/mL、102pg/mL、103pg/mL、104pg/mL、105pg/mL、106pg/mL，作为待测液备用。将80μL待测液与10μL Au-CuFeSe2-mAb和10μL运行缓冲液(10mM PBS溶液，含5％蔗糖，1％BSA，1％吐温-20，pH 7.4)在离心管中混合10min，然后将试纸条插入离心管，待试纸干燥后用808nm激光器(功率为1.36W/cm2)照射3min，利用手机及红外热成像配件监测温度变化，光热模式的结果如图4(A)，相应的工作曲线为图4(B)。
结果显示，比色模式下，阴性和低浓度阳性试纸T区呈现明显深紫色，DON浓度增加至0.01ng/mL时T区颜色变淡，10ng/mL时T区颜色消失，以此浓度为比色模式检测限；光热模式下，阴性T区温度最高，DON浓度为106pg/mL时T区温度降至最低，以此浓度为光热模式检测限。因此，所构建的双模式试纸的检测限可以达到10-1pg/mL。
实施例5检测小分子化合物脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)
对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的Au-CuFeSe2复合物光热定量双模式试纸条进行特异性验证，包括以下步骤：
1.试纸材料的制备
同实施例1
2.试纸条的制备
同实施例2
3.工作曲线绘制
同实施例3
4.样品预处理
用乙腈配置10mL 1mg/mL展青毒素(PAT)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉毒素B1(AFB1)标准溶液，用10mM PBS稀释到浓度为120ng/mL，作为待测液备用。
5.样品检测
将80μL待测液与10μL Au-CuFeSe2-mAb和10μL运行缓冲液(10mM PBS溶液，含5％蔗糖，1％BSA，1％吐温-20，pH 7.4)在离心管中混合10min，然后将试纸条插入离心管，待试纸干燥后，用808nm激光器(功率为1.36W/cm2)照射3min，利用手机及红外热成像配件监测温度变化，光热模式结果显示如图5。PAT、ZEN、OTA、AFB1试纸的T区均显色较深、温度较高，特异性识别结果好。
通过以上实施例可以看出，本申请提供的Au-CuFeSe2复合材料应用在制备比色-光热双模式试纸条的应用比色-光热双模式试纸条中，无需改变试纸条的常规结构，作为信号探针使用，既可以独立于所述的比色-光热双模式试纸条形式使用，方便存放，也可以固定在试纸的结合垫上使用，方便携带；本发明提供的包含比色-光热双模式试纸条的检测方法，用于检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条基于等离子体共振效应，以高光热转换效率、微小尺寸的Au-CuFeSe2复合材料为T区固定信号探针，近红外激光光源激发，结合智能终端及红外热成像配件实现光热信号的采集，有效去除样品液基底颜色以及试纸荧光背景干扰进而提高信噪比；检查方法具有更低的检测限、更宽的检测范围和较好的特异性，较其他光热检测试纸灵敏度更高。
综上所述，本说明书内容不应该理解为本发明的限制，凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。
Claims (7)
1.一种检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条，其特征在于，所述比色-光热双模式试纸条包含试纸条主体和信号探针；
其中，所述试纸条主体包含：在PVC底板上沿水平方向依次从上到下交叠粘贴有样品垫、硝酸纤维素膜即NC膜、吸收垫；其中，硝酸纤维素膜用于实现样品中分析物与其他物质的分离和检测，样品垫用于上样，吸收垫用于吸收过量液体，PVC底板为试纸提供物理支撑；所述硝酸纤维素膜包括检测区即T区、质控区即C区；其中，T区上固定有待测物抗原，即待测分子-蛋白偶联物；C区上固定有二抗，二抗是针对一抗来源的二抗，即抗一抗；
所述信号探针包含Au-CuFeSe2复合材料、待测物抗体即一抗、牛血清蛋白三者的混合物，即Au-CuFeSe2-mAb混合液；
所述信号探针以独立于所述比色-光热双模式试纸条主体结构的形式使用，或者将信号探针干燥于结合垫上，将所述结合垫插入所述样品垫与所述NC膜之间使用。
2.根据权利要求1所述的一种检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条，其特征在于，所述待测物抗体即一抗来源包括小鼠、大鼠、兔中的至少一种；所述二抗包括羊抗鼠二抗、兔抗鼠二抗、羊抗兔二抗、驴抗兔二抗中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条，其特征在于，所述检测区的光热温度与待测小分子化合物含量呈负相关，显色强度与样品中小分子化合物含量呈负相关，具体为：
当样品不含小分子化合物时，T区显紫色、温度高；
当样品中含有小分子化合物时，T区显浅紫色甚至消线、温度降低；
所述质控区作为验证试纸结果有效性的参照，始终显紫色。
4.一种根据权利要求1所述的检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条的制备方法，其特征在于，包括：
制备信号探针Au-CuFeSe2复合材料；
制备Au-CuFeSe2复合材料与待测物抗体、牛血清蛋白的Au-CuFeSe2-mAb混合液；
构建试纸：T区滴加或喷涂待测物抗原，C区滴加或喷涂针对一抗来源的二抗，即抗一抗，干燥后于真空袋中保存备用；
将信号探针，即Au-CuFeSe2-mAb混合液，以溶液或冻干粉的状态保存于密闭容器中；或者将信号探针，即Au-CuFeSe2-mAb混合液，干燥于结合垫上、将结合垫插入样品垫与NC膜之间使用。
5.根据权利要求4所述的检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备信号探针Au-CuFeSe2复合材料的具体方法为：将用湿化学方法在水溶液中制备的CuFeSe2纳米晶分散液进行稀释，取稀释后的CuFeSe2溶液于离心管中，加入柠檬酸三钠溶液，混匀后加入HAuCl4溶液，加入超纯水，然后室温下振荡反应，溶液颜色由浅棕色变为紫色，得到Au-CuFeSe2复合材料，冷藏备用；
所述制备Au-CuFeSe2复合材料与待测物抗体、牛血清蛋白的Au-CuFeSe2-mAb混合液，具体方法为：取Au-CuFeSe2复合材料于离心管中，加入弱碱性溶液调节体系的pH至6～8，振荡混匀再加入待测物抗体，在室温下振荡反应30～60min后，加入牛血清白蛋白BSA封闭，在室温下振荡反应1～1.5h，经离心后去除上清液，再将剩余物质复溶于缓冲液中，得到Au-CuFeSe2-mAb混合液，冷藏备用。
6.根据权利要求4所述的检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条的制备方法，其特征在于，所述T区滴加或喷涂待测物抗原，具体为：T区滴加或喷涂含有0.5-10mg/mL待测物抗原的5-20mM PBS溶液；所述C区滴加或喷涂针对一抗来源的二抗，即抗一抗，具体为：C区滴加或喷涂含有0.05-10mg/mL二抗的5-20mM PBS溶液。
7.一种根据权利要求1所述的检测小分子化合物的比色-光热双模式试纸条的应用，其特征在于，用于检测小分子化合物，具体包括：
当信号探针以独立于比色-光热双模式试纸条主体结构的形式使用时，具体包括：
将待测样品与Au-CuFeSe2-mAb溶液置于运行缓冲液中混合3-10min，放入所述试纸条；15-30min后读取比色结果，进行半定量分析；获得比色结果照片，利用图像处理软件进行灰度分析，进行定量分析；
当信号探针以干燥于结合垫上、并将结合垫插入试纸主体结构的样品垫与NC膜之间使用时，具体包括：
将待测样品与运行缓冲液混合，放入所述的试纸条，20-40min后读取比色结果，获得比色结果照片，进行半定量分析；利用图像处理软件进行灰度分析，进行定量分析；
试纸条干燥后，将试纸条置于808nm激光光源下激发，使用热成像或测温设备及智能显示端获取温度结果，所述热成像或测温设备包括手机红外热成像分析配件、红外热成像仪或者测温枪中的至少一种，所述智能显示端包括电脑、智能手机中的至少一种，所述热成像设备采集光热成像照片，并通过与之相连的智能显示端得以输出显示。
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