CN115598339B - 可检测重金属离子的金纳米复合颗粒及免疫层析试纸条 - Google Patents

可检测重金属离子的金纳米复合颗粒及免疫层析试纸条 Download PDF

Info

Publication number
CN115598339B
CN115598339B CN202211610636.9A CN202211610636A CN115598339B CN 115598339 B CN115598339 B CN 115598339B CN 202211610636 A CN202211610636 A CN 202211610636A CN 115598339 B CN115598339 B CN 115598339B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gold
test strip
detection
tco
nano composite
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211610636.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115598339A (zh
Inventor
曹丰晶
董大明
马世祥
田宏武
李传霞
赵贤德
矫雷子
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Intelligent Equipment Technology Research Center of Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Original Assignee
Intelligent Equipment Technology Research Center of Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Intelligent Equipment Technology Research Center of Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences filed Critical Intelligent Equipment Technology Research Center of Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Priority to CN202211610636.9A priority Critical patent/CN115598339B/zh
Publication of CN115598339A publication Critical patent/CN115598339A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115598339B publication Critical patent/CN115598339B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532Production of labelled immunochemicals
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346Nanoparticles
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386Analytical elements
    • G01N33/54387Immunochromatographic test strips
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/553Metal or metal coated
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)

Abstract

本发明涉及化学检测技术领域,尤其涉及可检测重金属离子的金纳米复合颗粒及免疫层析试纸条。金纳米复合颗粒的制备方法包括:制备金纳米颗粒‑Tz:在金纳米颗粒表面修饰四嗪‑五聚乙二醇‑活泼酯;制备金纳米颗粒‑Ab‑TCO:在金纳米颗粒表面修饰抗体和反式环辛炔‑四聚乙二醇‑活泼酯;将所述金纳米颗粒‑Tz与金纳米颗粒‑Ab‑TCO混合。本发明基于点击化学原理设计了一种金纳米复合颗粒,显著提升了试纸条的可读信号,实现了重金属离子的快速高效检测,具有高灵敏度、高选择性和抗干扰性的检测效果。本发明的金纳米复合颗粒也可以推广应用到更多目标物的高效快速检测方法中。

Description

可检测重金属离子的金纳米复合颗粒及免疫层析试纸条
技术领域
本发明涉及化学检测技术领域,尤其涉及可检测重金属离子的金纳米复合颗粒及免疫层析试纸条。
背景技术
重金属离子(Cd2+、Hg2+、Cr3+、Cu2+)污染是目前世界上最严重的环境问题之一,对土壤中或者地表水中重金属离子识别和检测具有重要的意义。工业的快速发展导致环境污染问题也日益显现,特别是由于冶金、化工等领域的含有重金属的废水排放,导致重金属污染超标,不仅对环境造成巨大的危害,还会对身体系统及器官造成严重的损伤。例如:镉不是人体必需元素,而且是一种环境污染物,一般情况下,过度摄入镉可导致人发生镉中毒。世界卫生组织将镉列为重点研究的食品污染物;国际癌症研究机构(IARC)将镉归类为人类致癌物,会对人类造成严重的健康损害;美国毒物和疾病登记署(ATSDR)将镉列为第7位危害人体健康的物质;我国也是将镉列为实施排放总量控制的重点监控指标之一。
目前,关于重金属离子检测的多种方法和技术已经有很多报道,如电感耦合等离子体原子质谱法(ICPMS),原子吸收光谱(AAS),比色传感器,荧光检测,电化学发光,拉曼散射等,在环境监测和食品等方面发挥着重要的作用。虽然这些方法在某些领域具有明显的优势,但是有些仍然存在灵敏度低或者检测过程复杂等问题,因此,探索更多的检测重金属离子的快速高效的检测方法仍然是非常重要和必要的。
发明内容
本发明设计了一种基于点击化学形成的金纳米复合颗粒,将其应用于免疫层析试纸条中,并借助激光诱导击穿光谱技术(LIBS)作为信号检测方式,获得了具有高灵敏度、高选择性和抗干扰性的检测重金属离子的快速试纸条检测方法。
首先,本发明提供了一种金纳米复合颗粒的制备方法,包括:
制备金纳米颗粒-Tz:在金纳米颗粒表面修饰四嗪-五聚乙二醇-活泼酯;
制备金纳米颗粒-Ab-TCO:在金纳米颗粒表面修饰抗体和反式环辛炔-四聚乙二醇-活泼酯;
将所述金纳米颗粒-Tz与金纳米颗粒-Ab-TCO混合后制得所述金纳米复合颗粒。
本发明发现,通过在金纳米颗粒表面修饰环辛炔与四嗪,能够在无铜催化的条件下通过点击化学反应自组装形成金纳米复合颗粒,金纳米复合颗粒作为标记物时,可显著提高金的富集浓度,从而提高肉眼可视化显色和金的检测信号,特别是显著提高了金的LIBS信号。
其中,由于待测物的抗体(Ab)的尺寸约为10nm,本发明选择反式环辛炔-四聚乙二醇-活泼酯(Trans-cyclooctene-PEG4-NHS Ester,TCO)与四嗪-五聚乙二醇-活泼酯(Tetrazine-PEG5-NHS Ester,Tz)对金纳米颗粒进行修饰,能确保金纳米颗粒-Tz和金纳米颗粒-Ab-TCO自组装形成复合颗粒后,颗粒之间仍然存在着10nm左右的粒子间隙,有效阻止金纳米颗粒的等离子体共振,使金纳米颗粒保持着原有的等离子体颜色,有利于信号检测。
作为本发明的一种优选的实施方案,制备所述金纳米复合颗粒时,金纳米颗粒-Ab-TCO的体积为金纳米颗粒-Tz的2倍以上。
更优选地,将所述金纳米颗粒-Tz与金纳米颗粒-Ab-TCO按照体积比为1:2~4的比例混合后制得所述金纳米复合颗粒。
作为本发明的一种优选的实施方案,所述反式环辛炔-四聚乙二醇-活泼酯修饰在抗体上。
作为本发明的一种优选的实施方案,金纳米复合颗粒的制备方法包括:
制备金纳米颗粒-Tz:将金纳米颗粒和巯基-聚乙二醇-氨基混合后反应,制得Au-SH-PEG-NH2结合物;再将所述Au-SH-PEG-NH2结合物与Tz-PEG5-NHS混合后反应,制得金纳米颗粒-Tz;
制备金纳米颗粒-Ab-TCO:将抗体和TCO-PEG4-NHS混合后反应,制得Ab-TCO结合物;再将金纳米颗粒与所述Ab-TCO结合物混合后反应,制得金纳米颗粒-Ab-TCO;
将所述金纳米颗粒-Tz与金纳米颗粒-Ab-TCO混合后在室温下反应,制得所述金纳米复合颗粒。
作为本发明的一种优选的实施方案,金纳米复合颗粒的制备方法包括:
制备金纳米颗粒-Tz:将金纳米颗粒和巯基-聚乙二醇-氨基混合后在室温下反应,然后加入盐溶液混合后在0~8℃静置,制得Au-SH-PEG-NH2结合物;再将Au-SH-PEG-NH2结合物用缓冲液重悬后,与Tz-PEG5-NHS溶液混合后反应,制得金纳米颗粒-Tz;
制备金纳米颗粒-Ab-TCO:将抗体和TCO-PEG4-NHS溶液混合后在室温下反应,制得Ab-TCO结合物;再将金纳米颗粒与所述Ab-TCO结合物混合后在pH为7.5~8.5进行震荡反应,之后加入封闭蛋白液封闭后,制得金纳米颗粒-Ab-TCO;
将所述金纳米颗粒-Tz与金纳米颗粒-Ab-TCO混合后在室温下震荡反应,制得所述金纳米复合颗粒。
作为本发明的一种优选的实施方案,制备金纳米颗粒-Tz和金纳米颗粒-Ab-TCO中所采用的金纳米颗粒的粒径相同。
采用相同粒径的金纳米颗粒制备金纳米颗粒-Tz与金纳米颗粒-Ab-TCO,有利于二者结构相匹配,进一步促进自组装过程形成合适尺寸与结构的金纳米复合颗粒。
作为本发明的一种优选的实施方案,所述金纳米颗粒的粒径为30~40nm。
在上述粒径时,金纳米颗粒能够与环辛炔与四嗪小分子更好地组装形成具有一定粒子间隙的金纳米复合颗粒,进一步促进检测信号的提升。
作为本发明的一种优选的实施方案,所述抗体为重金属离子特异性抗体。优选为镉离子特异性抗体。
进一步,本发明提供了由上述任一实施方案制备的金纳米复合颗粒。
进一步,本发明还提供了一种免疫层析试纸条,包括:金标结合物模块,所述金标结合物模块中含有所述金纳米复合颗粒。
作为本发明的一种优选的实施方案,所述免疫层析试纸条通过竞争法原理对待测物进行检测。
作为本发明的一种优选的实施方案,免疫层析试纸条还包括:样品滴加模块;所述样品滴加模块中含有离子螯合剂。
作为本发明的一种优选的实施方案,免疫层析试纸条还包括:检测模块;所述检测模块中的测试线T线含有待测物抗原。
作为本发明的一种优选的实施方案,免疫层析试纸条包括沿着层析方向依次设置的样品滴加模块、金标结合物模块、以及检测模块;
样品滴加模块中含有离子螯合剂;
所述金标结合物模块中含有所述金纳米复合颗粒;
检测模块中含有测试线T线和质控线C线;测试线T线中含有待测物抗原,质控线C线中含有质控抗体。
在具体实施过程中,免疫层析试纸条的制备方法按照本领域常规的制备方法制作。其中包括但不限于采用NC膜、PVC底板、或吸水纸等实施本发明。
进一步,本发明也提供了一种重金属离子的检测方法,包括:采用上述任一实施方案所述的免疫层析试纸条检测待测样本,然后采用激光诱导击穿光谱设备检测测试线T线处的信号。
作为本发明的一种优选的实施方案,激光诱导击穿光谱设备的检测波长为235~245 nm。
当在免疫竞争法原理的基础上进行重金属离子的检测时,在相同目标物的浓度下,与传统方法相比,金纳米复合颗粒增强后在测试线T线处会有更多的金纳米颗粒聚集,加深了测试线的显色程度,而且金纳米复合颗粒会比单个金纳米颗粒产生更强的LIBS信号。因此根据竞争法原理,重金属离子浓度与被激发产生的金的LIBS信号成反比关系,通过建立金的LIBS信号与重金属离子浓度之间的线性关系,可实现重金属离子的高灵敏度快速检测。
本发明将激光诱导击穿光谱、经典的化学反应-点击化学和免疫层析技术相结合,不仅拓展了激光诱导击穿光谱的应用研究,同时也丰富了免疫层析技术的读出方法。对环境中的重金属离子、水体中抗生素、农产品中农药残留的检测提供了一定的指导意义。
此外,本发明采用金纳米颗粒制备复合颗粒,相比其它金属纳米颗粒,采用LIBS技术进行信号检测时可产生更高的LIBS信号,进一步实现信号的扩增,从而大幅提升重金属离子的检测能力。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
本发明基于点击化学原理设计了一种金纳米复合颗粒,显著提升了试纸条的可读信号,实现了重金属离子的快速高效检测,具有高灵敏度、高选择性和抗干扰性的优异检测效果。同时,本发明的金纳米复合颗粒也可以推广应用到更多目标物的高效快速检测方法中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的激光诱导击穿光谱检测示意图;其中,1表示激光器,2表示信号延时发生器,3表示光谱仪,4表示计算机,5表示样品台,6表示试纸条检测样本,7表示信号收集器,8表示聚焦镜,9表示光纤,10表示镜面。
图2为本发明提供的金纳米复合颗粒的制备流程图;其中,1表示金纳米颗粒,2表示镉抗体,3表示反式环辛炔-四聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯,4表示巯基-聚乙二醇-氨基,5表示四嗪-五聚乙二醇-活泼酯。
图3为传统标记试纸条(a)和金纳米复合颗粒标记试纸条(b)的检测示意图;其中,1表示螯合剂,2表示PVC底板,3表示样品垫,4表示金标结合物垫,5表示测试线T线,6表示质控线C线,7表示硝酸纤维素膜,8表示吸水纸,9表示样品,10表示30nm金颗粒标记的镉抗体,11表示本发明的金纳米复合颗粒。
图4为本发明实施例1制备的金纳米颗粒以及金纳米复合颗粒的透射电镜图片;其中,A为金纳米颗粒;B为金纳米复合颗粒(500nm 比例尺);C为金纳米复合颗粒(50nm 比例尺)。
图5为传统标记试纸条(a)和金纳米复合颗粒标记试纸条(b)对不同浓度的Cd2+检测的试纸条可视化对比图片。
图6为本发明金纳米复合颗粒标记试纸条检测不同浓度Cd2+后T线处金的LIBS图。
图7为本发明金纳米复合颗粒标记试纸条检测不同浓度Cd2+(0-10000ppb)后T线处金的LIBS信号变化趋势及LIBS信号值与Cd2+在1-1000ppb之间的线性曲线图。
图8为本发明金纳米复合颗粒标记试纸条检测不同浓度Cd2+后T线处金的LIBS信号值与Cd2+在低浓度区间(0-0.5ppb)的线性曲线图。
图9为本发明金纳米复合颗粒标记试纸条检测不同金属离子及空白样品后试纸条的图片。
图10为本发明金纳米复合颗粒标记试纸条检测不同金属离子及空白样品后试纸条T线处的LIBS信号值柱状图。
图11为本发明不同反应条件下制备的金纳米复合颗粒标记试纸条的可视化对比图片以及LIBS信号图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明中的附图,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下述实施例中,试剂包括:四氯金酸,柠檬酸三钠,乙二胺四乙酸钠(EDTA),吐温20(T20),氯化钠,碳酸钾,磷酸盐缓冲液液片剂(PBS, pH7.2,索莱宝),牛血清蛋白(BSA),四嗪-五聚乙二醇-活泼酯(Tz-PEG5-NHS),反式环辛炔-四聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯(TCO-PEG4-NHS),巯基-聚乙二醇-氨基(SH-PEG-NH2),酪蛋白钠,蔗糖,4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES),镉抗体(Cd-Ab,山东绿都)镉抗原(Cd-EDTA-BSA,山东绿都),二抗(羊抗鼠IgG,索莱宝);
耗材包括:PVC底板(80mm*300mm,上海捷宁),玻璃纤维(8mm*300mm,上海捷宁),样品垫(17 mm*300mm,上海捷宁),硝酸纤维素膜(NC膜)(CN140,2.5cm,赛多利斯),吸水纸(CF-7,27 mm*300mm,上海捷宁)。
实施例中未注明具体技术或条件者,均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行,或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
下述试验例中采用的激光诱导击穿光谱仪的检测示意图如图1所示。
实施例1
本实施例提供了一种金纳米复合颗粒,制备方法如下:
1、金纳米颗粒(AuNPs)的制备
采用化学还原法用柠檬酸三钠作为还原剂制备了约30 nm的金纳米颗粒(AuNPs)。所有的玻璃器皿都预先用新鲜王水浸泡并清洗,最后用超纯水冲洗三次。具体步骤为:将2mL 1% HAuCl4溶液与95.8 mL超纯水在圆烧瓶中混合,加热并回流,煮沸后立即加入2.2mL1%柠檬酸三钠溶液,继续搅拌15 min。在此过程中该溶液颜色逐渐变为鲜亮的酒红色,证明金纳米颗粒的形成。最后,冷却至室温后,收集金纳米颗粒,所制备金纳米颗粒的浓度为0.5mM,放置4℃保存备用。附图4A显示经透射电镜表征后,该金纳米颗粒的尺寸为30nm左右。
2、金纳米颗粒-Tz (AuNPs-Tz)的制备
首先,将金纳米颗粒(5mL)和(0.1mL, 10 μM)巯基-聚乙二醇-氨基(SH-PEG-NH2)在室温下混合后搅拌反应3小时,SH-PEG-NH2通过Au-S键修饰到金纳米颗粒上,然后加入氯化钠溶液使其终浓度为0.3M,然后将该溶液置于4℃放置24小时,之后将其离心并洗涤两次去除多余的试剂后得到Au-SH-PEG-NH2结合物。用碳酸盐缓冲液(2.5mL)将该结合物重悬后,加入Tz-PEG5-NHS(0.05mL, 25 mM)溶液,Tz-PEG5-NHS通过活泼酯(NHS)和Au-SH-PEG-NH2上的NH2连接并搅拌2小时,加入Tris-HCl(0.05M, 50μL)终止反应,15min后离心并洗涤两次,并加入1mL PBS缓冲液最终得到金纳米颗粒-Tz,4℃保存备用。
3、金纳米颗粒-Ab-TCO (AuNPs- Ab-TCO)的制备
用1mL PBS缓冲液(10 mM, pH 7.2)将抗体稀释到终浓度为1 mg/mL,然后滴加7.5μL TCO-PEG4-NHS (25 mM, DMF溶解)进行混合,抗体上的NH2可以和TCO-PEG4-NHS的活泼酯(NHS)发生反应。室温反应1小时,加入10 μL Tris-HCl缓冲液(50 mM),室温下反应15 min。最后,将混合物转入超滤装置(10KD过滤离心管),9000rpm离心20 min,去除未结合的TCO分子。用PBS缓冲液洗涤2次后,得到Ab-TCO结合物并转到1mL的PBS缓冲液中待用。
取金纳米颗粒溶液(5mL)用碳酸钾溶液(2.5M)调节其pH为8左右,然后加入上述Ab-TCO(125μL)结合物,Ab-TCO中抗体(Ab)通过静电吸附修饰到金颗粒的表面并在室温震荡反应1小时,加入BSA溶液(5%,0.3mL)进行封闭15min,最后9000rpm离心30min后,得到金纳米颗粒-Ab-TCO,置于1mL PBS缓冲溶液中4℃保存备用。
4、金纳米复合颗粒的制备
将上述制备的金纳米颗粒-Tz和 金纳米颗粒-Ab-TCO按照(体积比)1:3的比例(即分别取上述所制备的金纳米颗粒-Tz和金纳米颗粒-Ab-TCO 0.333 mL和1 mL)混合在室温下震荡反应2小时,在该反应过程中以金纳米颗粒-Tz为核心,在其周围进行金纳米颗粒-Ab-TCO的包裹,两种颗粒表面分别修饰的Tz和TCO通过点击反应发生环加成并链接后最终生成金纳米复合颗粒,即AuNPs-Tz-TCO-Ab-AuNPs复合物(1.333mL,所制备金纳米复合颗粒中金的浓度为2.5mM,附图2显示了整个金纳米复合颗粒制备的详细流程),最后置于4℃保存待用。附图4B,4C透射电镜显示该金纳米复合颗粒制备成功。
实施例2
本实施例提供了含有实施例1金纳米复合颗粒的镉离子检测试纸条,制备方法包括:
1、样品垫的制备
由于镉离子需要和螯合剂进行螯合后才可参与后续的免疫检测实验,所以预先在样品垫喷涂螯合剂缓冲液(0.02M HEPES, 0.13M NaCl, 0.05M EDTA, 0.1% T20, pH7.4),然后37℃烘干2小时备用。
2、金标结合物垫的制备
将制备好的金纳米复合颗粒(AuNPs-Tz-TCO-Ab-AuNPs,1.333 mL)用1.333 mL金标恢复液进行重悬(0.01M PBS,0.5%酪蛋白钠,1%BSA,0.05% T20,2%蔗糖,pH 7.4),重悬后金纳米复合颗粒的浓度为1.25mM,然后喷涂在玻璃纤维上,喷涂参数为20 μL /cm。
3、试纸条的包被与切割
配制测试线T(Cd-EDTA-BSA抗原,1mg/mL)和控制线C(羊抗鼠IgG,1mg/mL)所需试剂,用三维平面划膜仪器在NC膜上进行包被(NC膜须预先黏贴在PVC底板相应的位置,方便包被操作,仪器包被参数为1μL /cm),然后置于烘箱,37℃烘干2小时。按照层析试纸条黏贴顺序依次黏贴吸水纸,金标结合物垫,样品垫。最后使用切条机切成4cm宽的试纸条,放置干燥、避光、室温环境下待用。
试验例1
对镉离子检测试纸条的灵敏度、特异性进行测试,具体如下:
配制一系列不同浓度梯度的Cd2+溶液(10000,1000,100,50,10,5,1,0.5,0.1,0.05,0 ppb),然后每个浓度滴加150 μL在各试纸条的样品垫上进行反应,由于层析作用,原先涂敷在金标结合物垫上的金纳米复合颗粒(AuNPs-Tz-TCO-Ab-AuNPs)被释放出来。若是空白样本(无Cd2+),则释放出来的金纳米复合颗粒和包被在NC膜处的T线(Cd-EDTA-BSA)会直接发生免疫反应并在该T线处形成一条红色条带;若样本为阳性(含有Cd2+),Cd2+首先会和样品垫处的螯合剂EDTA发生络合并生成EDTA- Cd2+,然后经过金标结合物垫处再和金纳米复合颗粒发生免疫反应,由于EDTA-Cd2+和T线处的Cd-EDTA-BSA存在竞争关系,EDTA-Cd2+占据了金纳米复合颗粒上的更多的结合位点使得没有更多的金纳米复合颗粒去和NC膜上T线处的Cd-EDTA-BSA进行反应,使得该T线处颜色变淡;当Cd2+浓度达到较高浓度时,由于金纳米复合颗粒的位点全部被占据,金纳米复合颗粒则没有空余的位点和T线处的Cd-EDTA-BSA反应,T线完全被抑制而不会不显色,因此随着Cd2+浓度的提高,T线显色程度降低,金纳米复合颗粒也减少,相应的金的LIBS信号也降低,最终Cd2+浓度与金的LIBS信号成反比关系。当滴加样本反应15min 后,用LIBS仪器检测测试线T处金的LIBS信号(242.7 nm),并收集处理信号,建立金的LIBS信号与Cd2+之间的线性关系,实现快速定量检测Cd2+的目的。
附图3展示了传统标记方法与本发明金纳米复合颗粒标记方法的原理示意图。附图5通过对比传统方法与本发明的检测方法,结果显示采用本发明金纳米复合颗粒时,测试线的可视化程度大大提高,说明了基于点击化学实现金纳米颗粒自组装形成金纳米复合颗粒确实能够提高金在测试线处的富集浓度。附图6显示金纳米复合颗粒增强后,测试线T处金的LIBS信号与Cd2+浓度的变化趋势,可以看出,随着浓度的提高,金在242.7 nm处的信号逐渐降低。通过处理信号,得到在1-1000ppb有较好的线性范围(附图7),线性曲线为Y=4087.99-844.56Log[Cd2+],R2=0.9786。进一步在较低浓度范围内(0-0.5ppb)做线性曲线(附图8),计算得到对Cd2+的最低检出限为0.194ppb,线性曲线为Y=5003-1451X,R2=0.946。
配制一系列的500ppb 的普通金属离子溶液(Cd2+,Fe2+,Al3+,Zn2+,Mn2+,Mg2+,Ca2+,Cu2+,Pb2+,Hg2+,Cr3+,Ag+),各滴加150μL 进行检测,15min后LIBS检测测试线T处的金的LIBS信号,并收集处理信号。附图9和10分别为特异性的可视化图片及相对应的金的LIBS信号的柱状图分析,证明镉离子检测试纸条对Cd2+具有较高的特异性和选择性。
试验例2
本试验例采用上述镉离子检测试纸条对河水和池塘水中的镉离子进行检测。具体步骤为:
取河水和池塘水作为加标的基础样本,添加三个浓度(0.5, 10, 100 ppb)的Cd2+溶液,各滴加150μL 进行检测,15min后用LIBS检测测试线T处的金的LIBS信号,并收集处理信号,将LIBS信号代入已经建立的线性曲线,计算得到Cd2+的浓度,并计算回收率,结果如表1所示。
表1
试验例3
本试验例对金纳米复合颗粒的制备中,金纳米颗粒-Tz和 金纳米颗粒-Ab-TCO的最佳反应比例进行测试。具体步骤为:
在金纳米复合颗粒的制备中,将制备的金纳米颗粒-Tz和 金纳米颗粒-Ab-TCO分别按照体积比为1:2、1:3、1:4的比例混合后在室温下震荡反应并根据显色情况及金的LIBS信号来确定最佳的反应比例。其他反应条件、制备试纸条的步骤以及测试条件参照上述实施例和试验例。
经过肉眼识别和LIBS信号检测测试后,结果如图11所示,发现当金纳米颗粒-Tz和金纳米颗粒-Ab-TCO按照体积比为1:3的比例混合反应为最佳的反应比例,能够以最佳条件得到金纳米复合颗粒。因为,当比例为1:2的时候,由于金纳米颗粒-Ab-TCO含量较少,没有更多金纳米颗粒-Ab-TCO在金纳米颗粒-Tz核周围进行包裹,使得形成的金纳米复合颗粒相对较少,最终使得显色略淡,相应的金的LIBS信号略弱;而当比例为1:4时,与1:3相比,显色基本相同,且金的LIBS信号也基本保持接近,金纳米颗粒-Ab-TCO含量过多又会造成不必要的浪费。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种检测重金属离子的免疫层析试纸条,其特征在于,包括:金标结合物模块,所述金标结合物模块中含有金纳米复合颗粒;
所述金纳米复合颗粒的制备方法包括:
制备金纳米颗粒-Tz:在金纳米颗粒表面修饰四嗪-五聚乙二醇-活泼酯;
制备金纳米颗粒-Ab-TCO:在金纳米颗粒表面修饰抗体和反式环辛炔-四聚乙二醇-活泼酯;所述抗体为镉离子特异性抗体;
将所述金纳米颗粒-Tz与金纳米颗粒-Ab-TCO混合后制得所述金纳米复合颗粒。
2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条,其特征在于,所述金纳米颗粒的粒径为30~40nm。
3.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条,其特征在于,所述免疫层析试纸条通过竞争法原理对待测物进行检测。
4.根据权利要求3所述的免疫层析试纸条,其特征在于,还包括:样品滴加模块;所述样品滴加模块中含有离子螯合剂。
5.根据权利要求3所述的免疫层析试纸条,其特征在于,还包括:检测模块;所述检测模块中的测试线T线含有待测物抗原。
6.一种重金属离子的检测方法,其特征在于,包括:采用权利要求1~5中任一项所述的免疫层析试纸条检测待测样本,然后采用激光诱导击穿光谱设备检测测试线T线处的信号。
7.根据权利要求6所述的检测方法,其特征在于,激光诱导击穿光谱设备的检测波长为235~245nm。
CN202211610636.9A 2022-12-15 2022-12-15 可检测重金属离子的金纳米复合颗粒及免疫层析试纸条 Active CN115598339B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211610636.9A CN115598339B (zh) 2022-12-15 2022-12-15 可检测重金属离子的金纳米复合颗粒及免疫层析试纸条

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211610636.9A CN115598339B (zh) 2022-12-15 2022-12-15 可检测重金属离子的金纳米复合颗粒及免疫层析试纸条

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115598339A CN115598339A (zh) 2023-01-13
CN115598339B true CN115598339B (zh) 2023-04-07

Family

ID=84854319

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211610636.9A Active CN115598339B (zh) 2022-12-15 2022-12-15 可检测重金属离子的金纳米复合颗粒及免疫层析试纸条

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115598339B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116930485B (zh) * 2023-09-14 2023-12-22 北京市农林科学院智能装备技术研究中心 一种基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法及检测系统

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104655836A (zh) * 2013-11-25 2015-05-27 国家纳米科学中心 一种免疫层析试纸条、检测方法及应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013078332A1 (en) * 2011-11-23 2013-05-30 The General Hospital Corporation Analyte detection using magnetic hall effect
CN104730253B (zh) * 2015-03-20 2017-04-12 国家纳米科学中心 一种基于点击化学的检测试纸条、检测方法和应用
WO2018222034A1 (en) * 2017-05-30 2018-12-06 Jurriaan Huskens Surface with poly-cationic polymers and functionalized using coupling chemistry, biosensor comprising the same and use thereof in bio-sensing
CN114720515B (zh) * 2022-03-07 2024-04-09 华中农业大学 一种线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法及应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104655836A (zh) * 2013-11-25 2015-05-27 国家纳米科学中心 一种免疫层析试纸条、检测方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN115598339A (zh) 2023-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5376556A (en) Surface-enhanced Raman spectroscopy immunoassay
US5266498A (en) Ligand binding assay for an analyte using surface-enhanced scattering (SERS) signal
JP5132664B2 (ja) イムノクロマトグラフ方法
CN112014374B (zh) 一种表面增强拉曼免疫分析平面传感器及制备方法和应用
CN113552341B (zh) 基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN115598339B (zh) 可检测重金属离子的金纳米复合颗粒及免疫层析试纸条
Tian et al. Copper deposition-induced efficient signal amplification for ultrasensitive lateral flow immunoassay
CN110779905B (zh) 一种基于表面增强拉曼散射的金纳米标记的试纸条、制备方法及使用方法
CN213041862U (zh) 一种一体化的增敏型胶体金免疫层析试剂盒
JP7104798B2 (ja) 免疫クロマトグラフィー用複合粒子及びその製造方法、並びに、免疫クロマトグラフィー
CN108535481A (zh) 一种基于液晶的可视化检测肿瘤标志物的检测试剂盒
CN114280046B (zh) 检测微生物的比色-光热双模式试纸条及其制备方法
CN113588627B (zh) 一种基于激光诱导击穿光谱的二价铜离子检测方法和应用
CN108398419B (zh) 一种利用竞争型的纳米传感器超灵敏检测凝血酶的方法
JP3841559B2 (ja) 免疫学的検査方法および免疫学的検査キット
CN103735271A (zh) 利用暗场显微镜同时进行指纹识别与分析物检测的方法
CN114717345A (zh) CRISPR/Cas9介导的金黄色葡萄球菌检测等温核酸扩增方法、试纸条及其应用
CN116930485B (zh) 一种基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法及检测系统
JP3718267B2 (ja) 特異的結合反応を行うための再生可能な固相
CN114341642A (zh) 免疫层析法
JP7274595B2 (ja) イムノクロマトグラフィー
CN114563572B (zh) 一种烟叶多合一重金属快速定量检测卡及检测方法
WO2021152966A1 (ja) イムノクロマトグラフィー
JP2013181935A (ja) クロマトグラフ方法
CN116087494A (zh) 一种用于同时检测多种真菌毒素的光热侧流分析装置及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant