WO2021152966A1 - イムノクロマトグラフィー - Google Patents

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WO2021152966A1
WO2021152966A1 PCT/JP2020/042912 JP2020042912W WO2021152966A1 WO 2021152966 A1 WO2021152966 A1 WO 2021152966A1 JP 2020042912 W JP2020042912 W JP 2020042912W WO 2021152966 A1 WO2021152966 A1 WO 2021152966A1
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antigen
particles
modified
concentrate
labeling
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PCT/JP2020/042912
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吉宏 油屋
順一 片田
淳彦 和田
大 氏原
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富士フイルム株式会社
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/5695—Mycobacteria
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Definitions

  • the present invention relates to immunochromatography.
  • Immunochromatography is frequently used these days because it is easy to operate and can be measured in a short time.
  • an antigen such as influenza virus or lipoarabinomannan (LAM)
  • LAM lipoarabinomannan
  • the following operation is performed.
  • a substance to be a label modified with an antibody for example, gold particles
  • the modified gold particles are prepared and mixed with a sample containing an antigen.
  • the modified gold particles bind to the antigen to form a complex.
  • the complex is developed on an insoluble carrier having a detection line coated with an antibody that specifically reacts with an antigen
  • the complex is captured by reacting with the antibody on the detection line (test line) and detected visually or the like. Is confirmed.
  • Examples of such an immunochromatography include the methods disclosed in Patent Document 1.
  • an object of the present invention to provide an immunochromatography having high detection sensitivity.
  • the present inventors have found that the above problems can be solved by concentrating the sample by a predetermined method, and have reached the present invention. That is, the present inventors have found that the above problems can be solved by the following configuration.
  • Particles that are a complex of the antigen and the modified particles by mixing a sample that can contain the antigen and modified particles that are particles modified with a substance that has a specific affinity for the antigen.
  • a mixing step and A sedimentation step of precipitating the particle complex in the mixture using a centrifuge By mixing the precipitated particle complex with a dissociation solution which is an alkaline or acidic solution in a smaller amount than the sample which can contain the antigen, the dissociation of the particle complex is dissociated between the antigen and the particles.
  • Process and A recovery step of precipitating the separated particles using a centrifuge and recovering the antigen concentrate are examples of precipitating the separated particles using a centrifuge and recovering the antigen concentrate.
  • a labeling particle complex which is a composite of the antigen in the neutralized antigen concentrate and the labeling-modified particles, which are the labeling particles modified with the first binding substance capable of binding to the antigen, was formed.
  • a development step in which a second binding substance capable of binding to the above antigen is developed on an insoluble carrier having an immobilized reaction site, and a development step.
  • Immunochromatography comprising a capture step of capturing the labeling particle complex at the reaction site of the insoluble carrier.
  • the developing step is a complex of the antigen in the neutralized antigen concentrate and modified gold particles which are gold particles modified with a first binding substance capable of binding to the antigen.
  • This is a step of developing a second binding substance capable of binding to the antigen on an insoluble carrier having an immobilized reaction site in a state where the complex is formed.
  • the capture step is a step of capturing the labeling particle complex at the reaction site of the insoluble carrier.
  • the immunochromatography according to (1) above further comprising a silver amplification step of silver-amplifying the labeling particle complex captured in the capture step.
  • (3) The immunochromatography according to (1) or (2) above, wherein the modified particles used in the mixing step have a particle size of 50 nm to 3000 nm.
  • the neutralizing solution contains HCl and at least one selected from the group consisting of tricine, tris, HEPES, acetamide glycine, glycinamide and bicine, or NaOH and tricine, tris, HEPES.
  • the immunochromatography according to any one of (1) to (7) above, which contains at least one selected from the group consisting of acetamide glycine, glycine amide and bicine.
  • the lateral chromatography according to any one of (1) to (8) above, wherein the antigen is lipoarabinomannan.
  • the immunochromatography of the present invention will be described below.
  • the numerical range represented by using “-" in the present specification means a range including the numerical values before and after "-" as the lower limit value and the upper limit value.
  • each component may be used alone or in combination of two or more.
  • the content of the component means the total content unless otherwise specified.
  • “the detection sensitivity and the S / N ratio (signal / noise ratio) are further improved” is also referred to as "the effect of the present invention is more excellent”.
  • the process from the mixing step to the neutralization step is also referred to as a "concentration step”
  • the steps after the developing step are also referred to as a "detection step”.
  • the immunochromatography of the present invention (hereinafter, also referred to as "the method of the present invention") is By mixing a sample that can contain an antigen and modified particles that are particles modified with a substance that has a specific affinity for the antigen, a particle complex that is a complex of the antigen and the modified particles can be obtained.
  • the mixing step and A sedimentation step of precipitating the particle complex in the mixture using a centrifuge and By mixing the precipitated particle complex with a dissociation solution which is an alkaline or acidic solution in a smaller amount than the sample which can contain the antigen, the dissociation of the particle complex is dissociated between the antigen and the particles.
  • a labeling particle complex which is a composite of the antigen in the neutralized antigen concentrate and the labeling-modified particles, which are the labeling particles modified with the first binding substance capable of binding to the antigen, was formed.
  • the sample usually contains impurities such as small molecule components and salts in addition to water.
  • impurities such as urea are included. From the studies by the present inventors, it was found that when water in the sample is simply volatilized, these impurities are concentrated together with the antigen, the antigen-antibody reaction is inhibited, and the detection sensitivity is lowered. ing. That is, it is known that the effect of improving the detection sensitivity by concentration cannot be sufficiently obtained.
  • the method of the present invention is based on the above findings and the like.
  • the sample that can contain the antigen is concentrated by a predetermined method, the antigen is selectively concentrated, and the above-mentioned decrease in detection sensitivity is unlikely to occur. As a result, it is considered that extremely high detection sensitivity is achieved.
  • the mixing step is a complex of the antigen and the modified particles by mixing a sample that can contain the antigen and modified particles that are particles modified with a substance having a specific affinity for the antigen. This is a step of obtaining a mixture containing a particle composite.
  • the sample used in the mixing step is not particularly limited as long as it is a sample that can contain an antigen.
  • samples include, for example, biological samples, especially animal (particularly human) body fluids (eg, blood, serum, plasma, spinal fluid, tears, sweat, urine, pus, runny nose, or sputum) or Excrement (eg, Feces), organs, tissues, mucous membranes and skin, scraped specimens (swabs) thought to contain them, mouthwash, or animals and plants themselves or their dried bodies.
  • the sample is preferably a liquid and more preferably urine because the effects of the present invention are more excellent.
  • antigen examples include bacteria, bacteria (for example, Mycobacterium tuberculosis, lipoarabinomannan (LAM) contained in Mycobacterium tuberculosis), bacteria, viruses (for example, influenza virus), and their nucleoproteins.
  • LAM is a major antigen in tuberculosis. Glycolipids are the main constituents of cell membranes and cell walls.
  • the antigen is preferably an antigen that is a sugar chain (particularly a glycolipid), and more preferably LAM, for the reason that the effects of the present invention are more excellent.
  • the above sample is in the form of an extract obtained by extracting the sample as it is or by extracting the antigen with an appropriate extraction solvent, and further, a diluent obtained by diluting the extract with an appropriate diluent.
  • the extract can be used in a concentrated form by an appropriate method.
  • the extraction solvent is a solvent used in ordinary immunological analysis methods (for example, water, physiological saline, buffer solution, etc.), or a direct antigen-antibody reaction is carried out by diluting with such a solvent. It is also possible to use a water-miscible organic solvent that can be used.
  • the modified particles used in the mixing step are particles modified with a substance having a specific affinity for the antigen.
  • the particles are not particularly limited. Specific examples of the particles include metal particles, ceramic particles, polymer particles and the like. Among them, metal particles and polymer particles are preferable because the effects of the present invention are more excellent.
  • the metal of the metal particles is not particularly limited, and specific examples thereof include copper, chromium, lead, nickel, gold, silver, platinum, tin, zinc, iron, and the like, and among them, the effects of the present invention and the like can be obtained. For better reasons, the noble metals iridium, platinum and gold are preferred, with gold being particularly preferred.
  • the polymer of the polymer particles is not particularly limited, and specific examples thereof include polyurethane, polystyrene, poly (meth) acrylate, and diene-based polymers. Among them, polystyrene is used because the effect of the present invention is more excellent. Is preferable.
  • the particle size of the particles and the particle size of the modified particles are not particularly limited, but are preferably 1 nm to 10 ⁇ m, more preferably 10 nm to 5 ⁇ m, and more preferably 50 nm to 50 nm because the effects of the present invention are more excellent. It is more preferably 3 ⁇ m.
  • the particle size can be measured with a commercially available particle size distribution meter or the like.
  • the measurement method of particle size distribution optical microscopy, confocal laser microscopy, electron microscopy, atomic force microscopy, static light scattering, laser diffraction, dynamic light scattering, centrifugal sedimentation, electric pulse Measurement methods, chromatography methods, ultrasonic attenuation methods, etc. are known, and devices corresponding to each principle are commercially available.
  • a dynamic light scattering method can be preferably used because of the particle size range and ease of measurement.
  • Nanotrack UPA Nikkiso Co., Ltd.
  • dynamic light scattering particle size distribution measuring device LB- examples thereof include 550 (HORIBA, Ltd.) and FPAR-1000 (Otsuka Electronics Co., Ltd.), a concentrated particle size analyzer.
  • d 50
  • the specific gravity of the particles is preferably larger than 1, more preferably 2 or more, and even more preferably 3 or more, for the reason that the effects of the present invention are more excellent.
  • the upper limit of the specific gravity of the particles is not particularly limited, but is preferably 30 or less for the reason that the effect of the present invention is more excellent.
  • the particles are metal particles, it is preferably a metal having a high specific density. It is preferable to use the above-mentioned precious metal having a specific gravity of about 20.
  • a substance having a specific affinity for an antigen is not particularly limited, but a protein is preferable, and an antibody (for example, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody) is more preferable for the reason that the effect of the present invention is more excellent.
  • a monoclonal antibody is more preferable from the viewpoint of achieving higher detection sensitivity.
  • the above antibody is not particularly limited, but for example, an antiserum prepared from the serum of an animal immunized with an antigen, an immunoglobulin fraction purified from the antiserum can be used, and the antibody is immunized with the antigen.
  • Monoclonal antibodies obtained by cell fusion using animal spleen cells or fragments thereof [eg, F (ab') 2, Fab, Fab', or Fv] can be used. Preparation of these antibodies can be carried out by a conventional method.
  • An example of a substance having a specific affinity for an antigen when the antigen is LAM is the A194-01 antibody described in International Publication No. 2017/139153. All content described in WO 2017/139153 relating to A194-01 antibody is incorporated herein by reference as part of the disclosure herein. As another example of a substance having a specific affinity for an antigen when the antigen is LAM, Antibodies having the sequence described as MoAb1 in paragraph number [0080] of WO 2013/12963 can be mentioned. All of the content described in WO 2013/129634 relating to MoAb1 antibodies is incorporated herein by reference as part of the disclosure herein.
  • the method for producing the modified particles is not particularly limited, and a known method can be used.
  • the particles are gold particles
  • the chemical bond between gold and the SH group is utilized, and when the SH group on the antibody approaches the gold particle, the SH bond is cleaved and formed on the Au surface.
  • Au- Examples thereof include a chemical bonding method such as immobilization with an S bond.
  • a method of activating the -COOH-terminal particles with EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) to support the antibody on the particles can be mentioned.
  • the sample and the modified particles are mixed.
  • the antigen in the sample reacts with the substance having a specific affinity for the antigen of the modified particles, and the antigen and the modified particles are combined in the sample.
  • a particle complex that is a body is formed.
  • the particle complex is not formed.
  • the sedimentation step is a step of sedimenting the particle complex in the mixture obtained in the above-mentioned mixing step using a centrifuge.
  • the centrifugal separation condition of the centrifuge is not particularly limited, but the centrifugal force is preferably 100 to 1,000,000 G, preferably 1,000 to 10,000 G, for the reason that the effect of the present invention is more excellent. More preferably, the time is preferably 1 to 1,000 minutes, and more preferably 1 to 100 minutes.
  • the dissociation liquid is an alkaline or acidic liquid in an amount smaller than that of the sample which can contain the antigen with respect to the precipitated particle composite obtained by removing the supernatant liquid generated in the sedimentation step described above.
  • This is a step of dissociating the particle complex into an antigen and a particle by mixing with.
  • the above-mentioned particle complex is dissociated (separated) from the antigen and the particles by the dissociation liquid. As a result, a divergent solution containing an antigen is obtained.
  • the concentration of the antigen in the diverging solution is the amount of the "sample containing an antigen" used in the above-mentioned mixing step. It will be higher than the concentration of the antigen in. That is, a liquid in which the concentration of the antigen is concentrated (antigen concentrate) is obtained by the dissociation step.
  • the divergent liquid is not particularly limited as long as it is an alkaline or acidic liquid.
  • the alkaline solution is not particularly limited, and specific examples thereof include an aqueous NaOH solution and an aqueous KOH solution. Of these, an aqueous NaOH solution is preferable because the effects of the present invention are more excellent.
  • the acidic liquid is not particularly limited, and specific examples thereof include an aqueous HCl solution, an aqueous H 2 SO 4 solution, and an aqueous HNO 3 solution. Of these, an aqueous HCl solution is preferable because the effects of the present invention are more excellent.
  • the divergent liquid is preferably an alkaline liquid for the reason that the effect of the present invention is more excellent.
  • the divergent liquid preferably contains NaOH or HCl, more preferably contains NaOH, and even more preferably an aqueous NaOH solution, for reasons such as the effects of the present invention being more excellent.
  • the amount of the divergent solution is less than the amount of the "antigen-containing sample" used in the mixing step described above.
  • the ratio of the divergent solution to the "sample containing an antigen" used in the above-mentioned mixing step is preferably 1/2 or less, preferably 1/3 or less, in terms of mass ratio, for the reason that the effect of the present invention is more excellent. It is more preferably 1/4 or less, and particularly preferably 1/5 or less.
  • the recovery step is a step of precipitating the above-mentioned dissociated particles using a centrifuge and recovering the antigen concentrate. More specifically, after dissociating the particle complex into the antigen and the particles in the dissociation step described above, further centrifugation is performed to precipitate the dissociated particles, and the antigen concentrate containing the antigen is recovered. It is a process. At the time of mixing the divergent liquid which is an alkaline or acidic liquid in the divergence step, the redispersed particles are separated by centrifuging again, and the antigen concentrate of the supernatant is separated from the particles and recovered.
  • the conditions for centrifugation in this step are preferably the same as those in the sedimentation step.
  • the neutralization step is a step of obtaining a neutralized antigen concentrate by neutralizing the antigen concentrate recovered in the above-mentioned recovery step using a neutralizing solution.
  • the dissociation liquid is an alkaline or acidic liquid, so that the antigen concentrate obtained in the dissociation step is usually alkaline or acidic.
  • the neutralizing solution is used to neutralize the antigen concentrate.
  • the neutralizing solution is not particularly limited, but for example, a known buffer solution can be used.
  • the neutralizing solution contains HCl (particularly 1M HCl), tricine, tris, and HEPES (particularly, 1M HCl). It is preferable to contain at least one selected from the group consisting of 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine essential acid acid), acetoamide glycine, glycine amide and bicine, and the divergence liquid used in the above-mentioned divergence step is preferably contained.
  • an acidic liquid it is preferable to contain NaOH (particularly 1M NaOH) and at least one selected from the group consisting of tricine, tris, HEPES, acetoamide glycine, glycinamide and bicine.
  • the amount of the neutralizing solution is smaller than the amount of the "sample containing an antigen" used in the above-mentioned mixing step.
  • the ratio of the neutralizing solution to the "sample containing an antigen" used in the above-mentioned mixing step is preferably 1/10 or less, preferably 1/100, in terms of mass ratio, for the reason that the effect of the present invention is more excellent. The following is more preferable.
  • the total amount of the above-mentioned dissociated solution and the above-mentioned neutralizing solution is preferably smaller than the amount of the "sample containing an antigen" used in the above-mentioned mixing step.
  • the total ratio of the above-mentioned dissociated solution and the above-mentioned neutralizing solution to the "sample containing an antigen" used in the above-mentioned mixing step may be 1/2 or less for the reason that the effect of the present invention is more excellent. It is preferably 1/3 or less, more preferably 1/4 or less, and particularly preferably 1/5 or less.
  • the developing step is a composite of the antigen in the neutralized antigen concentrate obtained in the above-mentioned neutralization step and the labeling-modified particles which are the labeling particles modified with the first binding substance capable of binding to the antigen.
  • the labeling particle complex which is a body
  • the second binding substance capable of binding to the antigen is developed on an insoluble carrier having an immobilized reaction site (developing the labeling particle complex). It is a process.
  • the capture step is a step of capturing the labeling particle complex at the reaction site of the insoluble carrier.
  • the labeling particles are preferably gold particles described later, and the labeling modification particles are preferably modified gold particles described later, for the reason that the effects of the present invention are more excellent.
  • the labeling particle composite is preferably a gold particle composite described later. That is, the above detection step is performed because the effect of the present invention is more excellent.
  • Gold particle composite which is a composite of an antigen in the neutralizing antigen concentrate obtained in the above-mentioned neutralizing step and modified gold particles which are gold particles modified with a first binding substance capable of binding to the antigen.
  • the developing step is a complex of the antigen in the neutralized antigen concentrate obtained in the neutralization step described above and the modified gold particles which are gold particles modified with the first binding substance capable of binding to the antigen.
  • This is a step of developing a second binding substance capable of binding to the antigen on an insoluble carrier having an immobilized reaction site (developing the gold particle complex) in a state where a certain gold particle complex is formed.
  • ⁇ Gold particle complex As described above, in the developing step, first, the antigen in the neutralizing antigen concentrate obtained in the neutralizing step described above and the modified gold which is a gold particle modified with a first binding substance capable of binding to the antigen. A gold particle complex, which is a complex with particles, is formed.
  • the modified gold particles are gold particles modified with a first binding substance capable of binding to the antigen.
  • Gold particles are not particularly limited, but are preferably gold colloidal particles for the reason that the effects of the present invention are more excellent.
  • the gold particles act as a catalyst for reducing silver ions in the silver amplification step.
  • the particle size of the gold particles is preferably 5 nm to 500 nm, more preferably 7 nm to 300 nm, and even more preferably 10 nm to 200 nm because the effects of the present invention are more excellent.
  • the particle size of the gold particles can be obtained by the same method as that of the particles in the above-mentioned mixing step.
  • the first binding substance is not particularly limited as long as it can bind to the above antigen, but it is preferably a protein and an antibody (for example, for example) because the effect of the present invention is more excellent. , Polyclonal antibody, or monoclonal antibody), and a monoclonal antibody is even more preferable from the viewpoint of achieving higher detection sensitivity.
  • the above antibody is not particularly limited, but for example, an antiserum prepared from the serum of an animal immunized with an antigen, an immunoglobulin fraction purified from the antiserum can be used, and the antibody is immunized with the antigen.
  • Monoclonal antibodies obtained by cell fusion using animal spleen cells or fragments thereof [eg, F (ab') 2, Fab, Fab', or Fv] can be used. Preparation of these antibodies can be carried out by a conventional method.
  • the A194-01 antibody described in International Publication No. 2017/139153 can be mentioned. All content described in WO 2017/139153 relating to A194-01 antibody is incorporated herein by reference as part of the disclosure herein.
  • an antibody having the sequence described as MoAb1 in paragraph number [0080] of WO 2013/12963 can be mentioned. All of the content described in WO 2013/129634 relating to MoAb1 antibodies is incorporated herein by reference as part of the disclosure herein.
  • the method for producing the modified gold particles is not particularly limited, and a known method can be used. For example, by utilizing the chemical bond between gold and SH group, when the SH group on the antibody approaches the gold particle, the SH bond is cleaved and immobilized by the Au—S bond generated on the Au surface. Chemical binding method of.
  • the insoluble carrier is an insoluble carrier having a reaction site (test line) on which a second binding substance capable of binding to the antigen is immobilized.
  • the insoluble carrier may have a plurality of test lines depending on the type of antigen (for example, a test line for influenza A virus and a test line for influenza B virus).
  • the insoluble carrier may have a control line on the downstream side of the test line in order to confirm the development of the gold particle complex.
  • the method of the present invention includes a silver amplification step described later and a reducing agent solution is used in the silver amplification step, the color-developing reagent is fixed downstream from the test line in order to detect the reducing agent solution. It may have a conversion line.
  • the insoluble carrier for example, as shown in FIG. 1, a nitrocellulose membrane having a gold colloid holding pad 1, a test line 2, a control line 3, and a coloring reagent immobilization line 4 from the upstream side. 100 is mentioned.
  • the gold colloid holding pad 1 is a pad for holding gold particles (modified gold particles) modified with the first binding substance
  • the test line 2 is a line on which the second binding substance is immobilized.
  • the control line 3 is a line for confirming the development
  • the color-developing reagent immobilization line 4 is a line for detecting the reducing agent solution described later.
  • the upstream side and the downstream side mean a description intended to be developed from the upstream side to the downstream side when the gold particle composite is developed.
  • the insoluble carrier or an immunochromatographic kit having the same
  • the insoluble carrier and the immunochromatographic kit described in Japanese Patent No. 5728453 can be mentioned, and Patent No. All of the content described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 5728453 is incorporated herein by reference as part of the disclosure of this specification.
  • the insoluble carrier is preferably a porous carrier.
  • nitrocellulose membrane nitrocellulose membrane
  • cellulose membrane cellulose membrane
  • acetylcellulose membrane polysulfone membrane
  • polyethersulfone membrane nylon membrane
  • glass fiber glass fiber
  • non-woven fabric cloth, thread, etc.
  • a nitrocellulose membrane is more preferable.
  • the second binding substance is not particularly limited as long as it can bind to the above antigen. Specific examples and preferred embodiments of the second binding substance are the same as those of the first binding substance described above.
  • the second binding substance may be the same as or different from the first binding substance described above, but it is preferable that the second binding substance is a different substance for the reason that the effect of the present invention is more excellent. Further, when the first binding substance and the second binding substance are antibodies, the antibody which is the first binding substance and the antibody which is the second binding substance are different because the effects of the present invention and the like are more excellent. Aspects are preferred. When the first binding substance and the second binding substance are antibodies, the epitope of the first binding substance (a part of the antigen recognized by the first binding substance) and the epitope of the second binding substance (the first). A different embodiment of the antigen recognized by the binding substance (2) is preferable because the effect of the present invention is more excellent. The difference in the epitope of the antibody can be confirmed by, for example, ELISA (Enzyme-Linked Immuno Substance Assay).
  • the method of developing the gold particle complex on an insoluble carrier having a test line is not particularly limited, and for example, a nitrocellulose membrane 100 (or an immunochromatographic kit having the same) as shown in FIG. 1 described above). Is prepared, the neutralizing antigen concentrate obtained in the above-mentioned neutralization step is dropped onto a gold colloid holding pad, and as shown in FIG. 1, a method of moving from the upstream side to the downstream side using a capillary phenomenon. And so on.
  • the capture step is a step of capturing the gold particle complex at the reaction site of the insoluble carrier.
  • the gold particle composite (antigen and modified gold particles) developed on the insoluble carrier in the above developing step. Complex) is captured at the reaction site (test line) of the insoluble carrier.
  • the captured gold particle complex is visible because it is colored by the surface plasmon of the gold particles. It is also possible to estimate the concentration of the captured complex using an image analysis device or the like. In this way, the antigen in the sample can be detected.
  • the gold particle complex is not formed, so that the sample is not captured at the reaction site of the insoluble carrier and is not colored.
  • the silver amplification step is a step of silver-amplifying the gold particle complex captured in the capture step.
  • the silver amplification step is a step of forming large silver particles in the gold particle composite captured at the reaction site of the insoluble carrier by imparting silver ions to the insoluble carrier after the capture step. More specifically, it is a step in which silver ions are reduced using the gold particles of the gold particle complex as a catalyst to form silver particles (for example, a diameter of 10 ⁇ m or more). This significantly improves the detection sensitivity of the captured gold particle complex.
  • the method of imparting silver ions to the insoluble carrier after the capture step is not particularly limited, but a method of using the following reducing agent solution and the following silver amplification solution is preferable for the reason that the effect of the present invention is more excellent. Further, in addition to the reducing agent solution and the silver amplification solution, a washing solution may be used to wash the gold particle complex remaining on the insoluble carrier other than the specific binding reaction.
  • the reducing liquid may also serve as a cleaning liquid.
  • the reducing agent solution contains a reducing agent capable of reducing silver ions.
  • the reducing agent capable of reducing silver ions can be used in any inorganic or organic material or a mixture thereof as long as silver ions can be reduced to silver.
  • As the inorganic reducing agent a reducing metal salt whose valence can be changed by metal ions such as Fe 2+ , V 2+ , and Ti 3+, and a reducing metal complex salt can be preferably mentioned.
  • an inorganic reducing agent it is necessary to complex or reduce oxidized ions to remove or detoxify them.
  • citric acid or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) can be used to form a complex of Fe 3+ , which is an oxide, to make it harmless.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • a metal salt of Fe 2+ as a reducing agent.
  • the main developer used in the wet silver halide photographic photosensitive material for example, methyl gallic acid, hydroquinone, substituted hydroquinone, 3-pyrazolidones, p-aminophenols, p-phenylenediamines, hindered phenols, amidoxime).
  • Adins, catechols, pyrogallols, ascorbic acid (or derivatives thereof), and leuco pigments and other materials apparent to those skilled in the art, such as US Pat. No. 6,
  • the materials described in Nos. 020 and 117 can also be used as reducing agents.
  • Ascorbic acid reducing agent is also preferable as the reducing agent.
  • Useful ascorbic acid reducing agents include ascorbic acid and its analogs, isomers and derivatives thereof, such as D- or L-ascorbic acid and sugar derivatives thereof (eg, ⁇ -lactoascorbic acid, glucoascorbic acid, fucoascorbic acid).
  • Acid glucoheptascorbic acid, maltoascorbic acid
  • sodium salt of ascorbic acid potassium salt of ascorbic acid
  • isoascorbic acid or L-erythroascorbic acid
  • salts thereof eg alkali metal salt, ammonium salt or the present technology Salts known in the art
  • endiol type ascorbic acid enaminol type ascorbic acid, thioenoal type ascorbic acid and the like
  • endiol type ascorbic acid enaminol type ascorbic acid, thioenoal type ascorbic acid and the like
  • D, L or D, L-ascorbic acid And the alkali metal salt) or isoascorbic acid (or the alkali metal salt thereof) is preferable, and the sodium salt is a preferable salt.
  • a mixture of these reducing agents can be used.
  • the reducing agent solution is preferably flown so that the angle between the developing direction in the developing step and the developing direction of the reducing agent solution is 0 to 150 degrees for the reason that the effect of the present invention is more excellent. It is more preferable to flow the reducing agent solution so that the angle between the developing direction and the developing direction of the reducing agent liquid is 0 to 135 degrees. Examples of the method for adjusting the angle between the developing direction and the developing direction of the reducing agent solution in the developing step include the methods described in Examples of JP-A-2009-150869.
  • the silver amplification liquid is a liquid containing a compound containing silver ions.
  • a compound containing silver ions for example, an organic silver salt, an inorganic silver salt, or a silver complex can be used.
  • silver nitrate, silver acetate, silver lactate, silver butyrate, silver thiosulfate and the like which are silver ion-containing compounds having high solubility in a solvent such as water, can be mentioned.
  • Particularly preferred is silver nitrate.
  • a silver complex coordinated with a ligand having a water-soluble group such as a hydroxyl group or a sulfone group is preferable, and hydroxythioether silver and the like can be mentioned.
  • the organic silver salt, the inorganic silver salt, or the silver complex is 0.001 mol / L to 5 mol / L, preferably 0.005 mol / L to 3 mol / L, and further 0.01 mol / L to 1 mol in the silver amplification solution as silver. It is preferably contained at a concentration of / L.
  • auxiliary agent for the silver amplification liquid examples include buffers, preservatives, for example, antioxidants or organic stabilizers, speed regulators and the like.
  • buffers include acetic acid, citric acid, sodium hydroxide or one of these salts, a buffer using tris (hydroxymethyl) aminomethane, and other buffers used in general chemical experiments. Can be used. These buffers can be appropriately used to adjust the pH to the optimum pH for the amplified solution.
  • an alkylamine can be used as an auxiliary agent as an antifog agent, and dodecylamine is particularly preferable.
  • a surfactant can be used, and particularly preferably C 9 H 19- C 6 H 4- O- (CH 2 CH 2 O) 50 H.
  • the silver amplification liquid is preferably flowed from the direction opposite to the development step described above because the effect of the present invention is more excellent, and the angle between the development direction in the development step and the development direction of the reducing agent solution is 45 degrees or more. It is more preferable to flow at 180 degrees.
  • Examples of the method for adjusting the angle between the developing direction and the developing direction of the silver amplification liquid in the developing step include the methods described in Examples of JP-A-2009-150869.
  • Lipoarabinomannan (LAM) (02249-61, Nacalai Tesque) (antigen) extracted from Mycobacterium tuberculosis was added to a pooled urine sample of a healthy person (Bioreclamation IVT), and is shown in Table 1.
  • a sample solution having a LAM concentration (a sample that may contain an antigen) was prepared.
  • Example 1 The later, immunochromatography of Example 1 was performed.
  • Example 2 Immunochromatography was performed and evaluated according to the same procedure as in Example 1 described above, except that the following modified particles were used in the mixing step. The results are shown in Table 1.
  • Modified particles used in the mixing step of Example 2 -COOH-terminated polystyrene particles (Corefront, particle size: 2 ⁇ m) and anti-lipoarabinomannan (LAM) monoclonal antibody (substance having specific affinity for antigen) (Nacalai Tesque product code 05494-84)
  • LAM anti-lipoarabinomannan
  • modified polystyrene particles which are polystyrene particles modified with an anti-LAM monoclonal antibody.
  • 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride EDC, manufactured by Nakarai Co., Ltd. was used to activate the -COOH terminal of the polystyrene particles.
  • Example 3 In the dissociation step, 0.2 mL of 50 mmol / L HCl aqueous solution (acidic solution) was used instead of 0.2 mL of 50 mmol / L NaOH aqueous solution, and in the neutralization step, 1 mol instead of 0.01 mL of 1 mol / L Tris HCl was used. Immunochromatography was performed and evaluated according to the same procedure as in Example 2 described above, except that 0.01 mL of / L Tris NaOH was used. The results are shown in Table 1.
  • Example 1 The procedure is the same as that of Example 1 described above, except that the sample solution itself is used instead of the neutralized LAM concentrate after the developing step without performing the concentration step (from the mixing step to the neutralization step). Therefore, immunochromatization was performed and evaluated. The results are shown in Table 1.
  • Examples 1 to 3 in which the above-mentioned concentration step was performed had higher detection. Showed sensitivity. Among them, Examples 1 and 2 in which the divergent solution contained NaOH showed higher detection sensitivity.
  • Lipoarabinomannan (LAM) (02249-61, Nacalai Tesque) (antigen) extracted from Mycobacterium tuberculosis was added to a pooled urine sample of a healthy person (Bioreclamation IVT), and is shown in Table 2.
  • a sample solution having a LAM concentration (a sample that may contain an antigen) was prepared.
  • Example 4 The concentration step (from the mixing step to the neutralization step) was carried out according to the same procedure as in Example 2 described above, except that the sample solution (6 mL) having the LAM concentration shown in Table 2 was used. Then, using the obtained neutralizing LAM concentrate (neutralizing antigen concentrate), the following development steps and subsequent steps were performed.
  • a nitrocellulose membrane 100 having a gold colloid holding pad 1, a test line 2, a control line 3, and a coloring reagent immobilization line 4 was prepared from the upstream side.
  • the gold colloid holding pad 1 is a pad for holding modified gold colloid particles (modified particles for labeling) which are gold colloid particles modified with an anti-LAM monoclonal antibody
  • the test line 2 is fixed with an anti-LAM monoclonal antibody.
  • the colloidal gold dust line, the control line 3 is a line for confirming the development, and the color-developing reagent immobilization line 4 is a line for detecting the reducing liquid in the silver amplification step described later.
  • the neutralized LAM concentrate was added dropwise to the gold colloid holding pad.
  • a labeling particle composite which is a composite of LAM in the liquid and modified gold colloid particles (labeling modified particles) which are gold colloid particles modified with an anti-LAM monoclonal antibody was formed.
  • labeling modified particles which are gold colloid particles modified with an anti-LAM monoclonal antibody was formed.
  • the nitrocellulose membrane was developed from the upstream side to the downstream side.
  • the silver amplification step was carried out as follows.
  • Example 4 in which the above-mentioned concentration step was performed showed higher detection sensitivity as compared with Comparative Example 3 in which the above-mentioned concentration step was not performed. rice field.

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Abstract

検出感度の高いイムノクロマトグラフィーを提供する。抗原を含み得る試料と抗原と特異的に親和性を有する物質で修飾された粒子である修飾粒子とを混合することで粒子複合体を含有する混合物を得る、混合工程と、　遠心機を用いて混合物中の粒子複合体を沈降させる、沈降工程と、　沈降した粒子複合体と抗原を含み得る試料よりも少ない量の乖離液とを混合することで粒子複合体を抗原と粒子とに乖離させる、乖離工程と、　遠心機を用いて乖離した粒子を沈降させ抗原濃縮液を回収する、回収工程と、　中和することで中和抗原濃縮液を得る、中和工程と、　中和抗原濃縮液中の抗原と標識用修飾粒子との複合体である標識用粒子複合体を形成させた状態で反応部位を有する不溶性担体に展開する、展開工程と、　不溶性担体の反応部位において、標識用粒子複合体を捕捉する、捕捉工程と、 を備える、イムノクロマトグラフィー。

Description

イムノクロマトグラフィー
　本発明は、イムノクロマトグラフィーに関する。
　イムノクロマトグラフィーは、操作が簡便であり短時間で測定可能であることから、昨今頻繁に利用されている。
　例えば、インフルエンザウイルス、リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）等の抗原をイムノクロマトグラフィーで検出する場合、以下のような操作が行われる。
　まず、抗体で修飾された標識となる物質、例えば、金粒子を用いる場合には修飾金粒子を用意し、抗原を含む試料と混合する。修飾金粒子は抗原と結合し、複合体を形成する。この状態で、抗原と特異的に反応する抗体が塗布された検出ラインを有する不溶性担体に展開させると、複合体は検出ライン（テストライン）上で抗体と反応して捕捉され、目視等により検出が確認される。
　このようなイムノクロマトグラフィーとしては、例えば、特許文献１に開示される方法が挙げられる。
特許第５７２８４５３号公報
　昨今、抗原の濃度が極めて薄い試料にも適用可能な免疫診断法が望まれるなか、イムノクロマトグラフィーに対しても従来の方法（例えば、特許文献１に開示される方法）よりもさらに高感度な方法が求められている。
　そこで、本発明は、上記実情を鑑みて、検出感度の高いイムノクロマトグラフィーを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、試料を所定の方法によって濃縮することで上記課題が解決できることを見出し、本発明に至った。
　すなわち、本発明者らは、以下の構成により上記課題が解決できることを見出した。
（１）　抗原を含み得る試料と、上記抗原と特異的に親和性を有する物質で修飾された粒子である修飾粒子とを混合することで、上記抗原と上記修飾粒子との複合体である粒子複合体を含有する混合物を得る、混合工程と、
　遠心機を用いて、上記混合物中の上記粒子複合体を沈降させる、沈降工程と、
　上記沈降した粒子複合体と、上記抗原を含み得る試料よりも少ない量の、アルカリ性又は酸性の液である乖離液とを混合することで、上記粒子複合体を抗原と粒子とに乖離させる、乖離工程と、
　遠心機を用いて、上記乖離した粒子を沈降させ、抗原濃縮液を回収する、回収工程と、
　中和液を用いて、上記抗原濃縮液を中和することで、中和抗原濃縮液を得る、中和工程と、
　上記中和抗原濃縮液中の抗原と、上記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された標識用粒子である標識用修飾粒子との複合体である標識用粒子複合体を形成させた状態で、
上記抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する、展開工程と、
　上記不溶性担体の反応部位において、上記標識用粒子複合体を捕捉する、捕捉工程と、を備える、イムノクロマトグラフィー。
（２）　上記展開工程が、上記中和抗原濃縮液中の抗原と、上記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された金粒子である修飾金粒子との複合体である標識用粒子複合体を形成させた状態で、上記抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する工程であり、
　上記捕捉工程が、上記不溶性担体の反応部位において、上記標識用粒子複合体を捕捉する工程であり、
　さらに、上記捕捉工程で捕捉された標識用粒子複合体を銀増幅する、銀増幅工程を備える、上記（１）に記載のイムノクロマトグラフィー。
（３）　上記混合工程で用いられる修飾粒子の粒子径が、５０ｎｍ～３０００ｎｍである、上記（１）又は（２）に記載のイムノクロマトグラフィー。
（４）　上記抗原を含み得る試料に対する、上記乖離液の割合が、質量比で、１／５以下である、上記（１）～（３）のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー。
（５）　上記抗原を含み得る試料が、尿である、上記（１）～（４）のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー。
（６）　上記抗原が、糖鎖である、上記（１）～（５）のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー。
（７）　上記乖離液が、ＮａＯＨ又はＨＣｌを含有する、上記（１）～（６）のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー。
（８）　上記中和液が、ＨＣｌと、トリシン、トリス、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、グリシンアミド及びビシンからなる群より選択される少なくとも１種とを含有する、又は、ＮａＯＨと、トリシン、トリス、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、グリシンアミド及びビシンからなる群より選択される少なくとも１種とを含有する、上記（１）～（７）のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー。
（９）　上記抗原が、リポアラビノマンナンである、上記（１）～（８）のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー。
　以下に示すように、本発明によれば、検出感度の高いイムノクロマトグラフィーを提供することができる。
本発明の方法で使用される不溶性担体の一態様の模式図である。
　以下に、本発明のイムノクロマトグラフィーについて説明する。
　なお、本明細書において「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
　また、本明細書において各成分は、１種を単独で用いても、２種以上を併用して用いてもよい。ここで、各成分について２種以上を併用する場合、その成分について含有量とは、特段の断りが無い限り、合計の含有量を指す。
　また、本明細書において「検出感度及びＳ／Ｎ比（信号／ノイズ比）がより向上する」ことを「本発明の効果等がより優れる」とも言う。
　また、本明細書において、混合工程から中和工程までを「濃縮工程」とも言い、展開工程以降を「検出工程」とも言う。
　本発明のイムノクロマトグラフィー（以下、「本発明の方法」とも言う）は、
　抗原を含み得る試料と、上記抗原と特異的に親和性を有する物質で修飾された粒子である修飾粒子とを混合することで、上記抗原と上記修飾粒子との複合体である粒子複合体を含有する混合物を得る、混合工程と、
　遠心機を用いて、上記混合物中の上記粒子複合体を沈降させる、沈降工程と、
　上記沈降した粒子複合体と、上記抗原を含み得る試料よりも少ない量の、アルカリ性又は酸性の液である乖離液とを混合することで、上記粒子複合体を抗原と粒子とに乖離させる、乖離工程と、
　遠心機を用いて、上記乖離した粒子を沈降させ、抗原濃縮液を回収する、回収工程と、
　中和液を用いて、上記抗原濃縮液を中和することで、中和抗原濃縮液を得る、中和工程と、
　上記中和抗原濃縮液中の抗原と、上記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された標識用粒子である標識用修飾粒子との複合体である標識用粒子複合体を形成させた状態で、
上記抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する、展開工程と、
　上記不溶性担体の反応部位において、上記標識用粒子複合体を捕捉する、捕捉工程と、
を備える、イムノクロマトグラフィーである。
　本発明の方法はこのような構成をとるため、上述した効果が得られるものと推測される。その理由は明らかではないが、およそ以下のとおりと考えられる。
　試料中には、通常、水に加えて低分子成分や塩等の夾雑物が含まれる。例えば、試料が尿である場合、尿素等の夾雑物が含まれる。本発明者らの検討から、単に試料中の水を揮発させた場合、抗原と一緒にこれらの夾雑物が濃縮され、抗原抗体反応が阻害されて、検出感度が低下してしまうことが知見されている。すなわち、濃縮による検出感度の向上効果が十分に得られないことが分かっている。
　本発明の方法は上記知見等に基づくものである。すなわち、本発明の方法においては、
抗原を含み得る試料を所定の方法によって濃縮するため、抗原が選択的に濃縮され、上述したような検出感度の低下が生じ難い。結果として、極めて高い検出感度が達成されるものと考えられる。
　以下、本発明の方法が備える各工程について説明する。
［混合工程］
　混合工程は、抗原を含み得る試料と、上記抗原と特異的に親和性を有する物質で修飾された粒子である修飾粒子とを混合することで、上記抗原と上記修飾粒子との複合体である粒子複合体を含有する混合物を得る工程である。
〔試料〕
　混合工程で使用される試料は、抗原を含み得る試料であれば特に制限されない。そのような試料としては、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、
糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる擦過検体（スワブ）、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。
　上記試料は、本発明の効果等がより優れる理由から、液体であることが好ましく、尿であることがより好ましい。
＜抗原＞
　抗原としては、例えば、菌、細菌（例えば、結核菌、結核菌に含まれるリポアラビノマンナン（ＬＡＭ））、バクテリア、ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）や、それらの核タンパク質等が挙げられる。なお、ＬＡＭは、結核における主要な抗原であり、
細胞膜および細胞壁の主要構成成分である糖脂質である。
　抗原は、本発明の効果等がより優れる理由から、糖鎖（特に糖脂質）である抗原であることが好ましく、ＬＡＭであることがより好ましい。
＜試料の前処理＞
　上記試料は、試料をそのままで、又は、抗原を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。
　上記抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等）、あるいは、かかる溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。
〔修飾粒子〕
　上記混合工程で用いられる上記修飾粒子は、上記抗原と特異的に親和性を有する物質で修飾された粒子である。
＜粒子＞
　粒子は特に制限されない。粒子の具体例としては、金属粒子、セラミック粒子、ポリマー粒子等が挙げられる。なかでも、本発明の効果等がより優れる理由から、金属粒子、ポリマー粒子が好ましい。
　上記金属粒子の金属は特に制限されないが、その具体例としては、銅、クロム、鉛、ニッケル、金、銀、白金、すず、亜鉛、鉄等が挙げられ、なかでも、本発明の効果等がより優れる理由から、貴金属である、イリジウム、白金、金が好ましく、金が特に好ましい。
　上記ポリマー粒子のポリマーは特に制限されないが、その具体例としては、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、ジエン系ポリマー等が挙げられ、なかでも、本発明の効果等がより優れる理由から、ポリスチレンが好ましい。
（粒子径）
　上記粒子の粒子径及び上記修飾粒子の粒子径は特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、１ｎｍ～１０μｍであることが好ましく、１０ｎｍ～５μｍであることがより好ましく、５０ｎｍ～３μｍであることが更に好ましい。
　なお、本明細書において、粒子径は、市販の粒度分布計等で計測することができる。粒度分布の測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。粒子径の測定方法としては、粒子径範囲および測定の容易さから、動的光散乱法を好ましく用いることができる。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックＵＰＡ（日機装（株））、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ－
５５０（（株）堀場製作所）、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ－１０００（大塚電子（株））等が挙げられ、本発明においては、２５℃の測定温度で測定したメジアン径（ｄ＝５０）の値として求める。
（比重）
　上記粒子の比重は、本発明の効果等がより優れる理由から、１より大きいことが好ましく、２以上であることがより好ましく、３以上であることがさらに好ましい。粒子の比重の上限は特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、３０以下であることが好ましい。上記粒子が金属粒子の場合には、高い比重の金属であることが好ましく、
比重が２０前後の上述の貴金属を用いることが好ましい。
＜抗原と特異的に親和性を有する物質＞
　抗原と特異的に親和性を有する物質は特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、タンパク質であることが好ましく、抗体（例えば、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体）であることがより好ましく、モノクローナル抗体であることがより高い検出感度を実現する観点でさらに好ましい。
　上記抗体は特に制限されないが、例えば、抗原によって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分を用いることが可能であり、また、抗原によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行うことができる。
　抗原がＬＡＭである場合の、抗原と特異的に親和性を有する物質の一例としては、国際公開２０１７／１３９１５３号に記載のＡ１９４－０１抗体が挙げられる。Ａ１９４－０１抗体に関する国際公開２０１７／１３９１５３号に記載の内容はすべて本明細書の開示の一部として本明細書中に援用される。
　抗原がＬＡＭである場合の、抗原と特異的に親和性を有する物質の別の一例としては、
国際公開２０１３／１２９６３４号の段落番号［００８０］においてＭｏＡｂ１として記載される配列を有する抗体を挙げることができる。ＭｏＡｂ１抗体に関する国際公開２０１３／１２９６３４号に記載の内容はすべて本明細書の開示の一部として本明細書中に援用される。
＜修飾粒子の製造方法＞
　上記修飾粒子を製造する方法は特に制限されず、公知の方法を用いることができる。
　例えば、粒子が金粒子である場合には、金とＳＨ基とが化学結合することを利用し、抗体上のＳＨ基が金粒子と接近するときにＳＨ結合が開裂してＡｕ表面上に生成するＡｕ－
Ｓ結合で固定化させる等の化学的な結合方法が挙げられる。
　また、例えば、－ＣＯＯＨ末端の粒子をＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）で活性化し、抗体を粒子上に担持させる方法等が挙げられる。
〔混合〕
　上記混合工程では、上記試料と上記修飾粒子とを混合する。
　これにより、上記試料が抗原を含む場合には、試料中の抗原と上記修飾粒子の上記抗原と特異的に親和性を有する物質とが反応し、上記試料中で抗原と上記修飾粒子との複合体である粒子複合体が形成される。一方、上記試料が抗原を含まない場合には、上記粒子複合体は形成されない。
［沈降工程］
　沈降工程は、遠心機を用いて、上述した混合工程で得られた混合物中の粒子複合体を沈降させる工程である。
　上記遠心機の遠心分離条件は特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、遠心力は、１００～１，０００，０００Ｇであることが好ましく、１，０００～１０，０００Ｇであることがより好ましく、時間は、１～１，０００分間であることが好ましく、１～１００分間であることがより好ましい。
［乖離工程］
　乖離工程は、上述した沈降工程で生じた上澄み液を除去して得られた沈降した粒子複合体に対して、上記抗原を含み得る試料よりも少ない量の、アルカリ性又は酸性の液である乖離液とを混合することで、上記粒子複合体を抗原と粒子とに乖離させる工程である。
　乖離工程では、乖離液によって上述した粒子複合体が抗原と粒子とに乖離（分離）する。結果として、抗原を含有する乖離液が得られる。ここで、乖離液の量は上述した混合工程で用いられる「抗原を含み得る試料」の量よりも少ないため、乖離液中の抗原の濃度は上述した混合工程で用いられる「抗原を含み得る試料」中の抗原の濃度よりも高くなる。すなわち、乖離工程によって、抗原の濃度が濃縮された液（抗原濃縮液）が得られる。
〔乖離液〕
　乖離液は、アルカリ性又は酸性の液であれば特に制限されない。
　上記アルカリ性の液は特に制限されないが、具体例としては、ＮａＯＨ水溶液、ＫＯＨ水溶液等が挙げられる。なかでも、本発明の効果等がより優れる理由から、ＮａＯＨ水溶液が好ましい。
　上記酸性の液は特に制限されないが、具体例としては、ＨＣｌ水溶液、Ｈ２ＳＯ４水溶液、ＨＮＯ３水溶液等が挙げられる。なかでも、本発明の効果等がより優れる理由から、ＨＣｌ水溶液が好ましい。
　乖離液は、本発明の効果等がより優れる理由から、アルカリ性の液であることが好ましい。
　乖離液は、本発明の効果等がより優れる理由から、ＮａＯＨ又はＨＣｌを含有するのが好ましく、ＮａＯＨを含有するのがより好ましく、ＮａＯＨ水溶液であるのがさらに好ましい。
＜量＞
　上述のとおり、乖離液の量は、上述した混合工程で用いられる「抗原を含み得る試料」の量よりも少ない。
　上述した混合工程で用いられる「抗原を含み得る試料」に対する乖離液の割合は、本発明の効果等がより優れる理由から、質量比で、１／２以下であることが好ましく、１／３以下であることがより好ましく、１／４以下であることがさらに好ましく、１／５以下であることが特に好ましい。
［回収工程］
　回収工程は、遠心機を用いて、上述した乖離した粒子を沈降させ、抗原濃縮液を回収する工程である。より具体的には、上述した乖離工程で上記粒子複合体を抗原と粒子とに乖離させた後に、更に遠心分離を行って、乖離した粒子を沈降させて、抗原を含む抗原濃縮液を回収する工程である。
　乖離工程でアルカリ性又は酸性の液である乖離液を混合する時点で再分散した粒子を改めて遠心分離を行って乖離させ、上澄液の抗原濃縮液を粒子から分離し回収する。この工程での遠心分離の条件は、上記沈降工程と同じ条件とすることが好ましい。
［中和工程］
　中和工程は、中和液を用いて、上述した回収工程で回収された抗原濃縮液を中和することで、中和抗原濃縮液を得る工程である。
　上述した乖離工程ではアルカリ性又は酸性の液である乖離液で乖離させるため、乖離工程で得られた抗原濃縮液は通常アルカリ性又は酸性である。一方、アルカリ性又は酸性の液を後述する展開工程に用いた場合、後述する第１の結合物質や第２の結合物質が変性して、検出感度の低下に繋がる場合がある。そのため、中和工程では、中和液を用いて抗原濃縮液を中和する。
〔中和液〕
　中和液は特に制限されないが、例えば、公知の緩衝液を用いることができる。
　中和液は、本発明の効果等がより優れる理由から、上述した乖離工程で使用された乖離液がアルカリ性の液である場合は、ＨＣｌ（特に、１Ｍ　ＨＣｌ）と、トリシン、トリス、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）、アセトアミドグリシン、グリシンアミド及びビシンからなる群より選択される少なくとも１種とを含有するのが好ましく、上述した乖離工程で使用された乖離液が酸性の液である場合は、ＮａＯＨ（特に、１Ｍ　ＮａＯＨ）と、トリシン、トリス、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、グリシンアミド及びビシンからなる群より選択される少なくとも１種とを含有するのが好ましい。
＜量＞
　中和液の量は、上述した混合工程で用いられる「抗原を含み得る試料」の量よりも少ない。
　上述した混合工程で用いられる「抗原を含み得る試料」に対する中和液の割合は、本発明の効果等がより優れる理由から、質量比で、１／１０以下であることが好ましく、１／１００以下であることがより好ましい。
　上述した乖離液と上述した中和液の合計の量は、上述した混合工程で用いられる「抗原を含み得る試料」の量よりも少ないことが好ましい。
　上述した混合工程で用いられる「抗原を含み得る試料」に対する上述した乖離液と上述した中和液の合計の割合は、本発明の効果等がより優れる理由から、１／２以下であることが好ましく、１／３以下であることがより好ましく、１／４以下であることがさらに好ましく、１／５以下であることが特に好ましい。
［展開工程］
　展開工程は、上述した中和工程で得られた中和抗原濃縮液中の抗原と、上記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された標識用粒子である標識用修飾粒子との複合体である標識用粒子複合体を形成させた状態で、上記抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する（標識用粒子複合体を展開する）工程である。
［捕捉工程］
　捕捉工程は、上記不溶性担体の反応部位において、上記標識用粒子複合体を捕捉する工程である。
［検出工程の好適な態様］
　上記展開工程以降（検出工程）において、本発明の効果等がより優れる理由から、上記標識用粒子は、好ましくは後述する金粒子であり、上記標識用修飾粒子は、好ましくは後述する修飾金粒子であり、上記標識用粒子複合体は、好ましくは後述する金粒子複合体である。
　すなわち、上記検出工程は、本発明の効果等がより優れる理由から、
　上述した中和工程で得られた中和抗原濃縮液中の抗原と、上記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された金粒子である修飾金粒子との複合体である金粒子複合体を形成させた状態で、上記抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する、展開工程と、
　上記不溶性担体の反応部位において、上記金粒子複合体を捕捉する、捕捉工程と、を備えるのが好ましい。
　なかでも、本発明の効果等がより優れる理由から、さらに、上記捕捉工程で捕捉された金粒子複合体を銀増幅する、銀増幅工程を備えるのが好ましい。
　以下、上記好適な態様が備える各工程について説明する。
〔展開工程〕
　展開工程は、上述した中和工程で得られた中和抗原濃縮液中の抗原と、上記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された金粒子である修飾金粒子との複合体である金粒子複合体を形成させた状態で、上記抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する（金粒子複合体を展開する）工程である。
＜金粒子複合体＞
　上述のとおり、展開工程では、まず、上述した中和工程で得られた中和抗原濃縮液中の抗原と、上記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された金粒子である修飾金粒子との複合体である金粒子複合体を形成させる。
（修飾金粒子）
　修飾金粒子は、上記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された金粒子である。
（１）金粒子
　金粒子は特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、金コロイド粒子であることが好ましい。
　金粒子は、本発明の方法が後述する銀増幅工程を備える場合、銀増幅工程において銀イオンを還元する触媒として働く。
　上記金粒子の粒子径は、本発明の効果等がより優れる理由から、５ｎｍ～５００ｎｍであることが好ましく、７ｎｍ～３００ｎｍであることがより好ましく、１０ｎｍ～２００　ｎｍであることが更に好ましい。
　なお、金粒子の粒子径は上述した混合工程における粒子と同様の方法で求めることができる。
（２）第１の結合物質
　第１の結合物質は上記抗原と結合し得るものであれば特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、タンパク質であることが好ましく、抗体（例えば、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体）であることがより好ましく、モノクローナル抗体であることがより高い検出感度を実現する観点でさらに好ましい。
　上記抗体は特に制限されないが、例えば、抗原によって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分を用いることが可能であり、また、抗原によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行うことができる。
　抗原がＬＡＭである場合の、第１の結合物質の一例としては、国際公開２０１７／１３９１５３号に記載のＡ１９４－０１抗体が挙げられる。Ａ１９４－０１抗体に関する国際公開２０１７／１３９１５３号に記載の内容はすべて本明細書の開示の一部として本明細書中に援用される。
　抗原がＬＡＭである場合の、第１の結合物質の別の一例としては、国際公開２０１３／１２９６３４号の段落番号［００８０］においてＭｏＡｂ１として記載される配列を有する抗体を挙げることができる。ＭｏＡｂ１抗体に関する国際公開２０１３／１２９６３４号に記載の内容はすべて本明細書の開示の一部として本明細書中に援用される。
（３）修飾金粒子の製造方法
　上記修飾金粒子を製造する方法は特に制限されず、公知の方法を用いることができる。
例えば、金とＳＨ基とが化学結合することを利用し、抗体上のＳＨ基が金粒子と接近するときにＳＨ結合が開裂してＡｕ表面上に生成するＡｕ－Ｓ結合で固定化させる等の化学的な結合方法が挙げられる。
＜不溶性担体＞
　上記不溶性担体は、上記抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化された反応部位（テストライン）を有する不溶性担体である。不溶性担体は、抗原の種類に合わせて複数のテストラインを有していてもよい（例えば、インフルエンザＡ型ウイルス用のテストラインとインフルエンザＢ型用のテストライン）。また、不溶性担体は、上記金粒子複合体の展開を確認するために、テストラインより下流側にコントロールラインを有していてもよい。また、本発明の方法が後述する銀増幅工程を備える場合であって、銀増幅工程において還元剤液を用いる場合には、還元剤液を検出するために、テストラインより下流側に発色試薬固定化ラインを有していてもよい。
　上記不溶性担体の具体的な態様としては、例えば、図１に示されるような、上流側から、金コロイド保持パッド１、テストライン２、コントロールライン３、発色試薬固定化ライン４を有するニトロセルロースメンブレン１００が挙げられる。ここで、金コロイド保持パッド１は第１の結合物質で修飾された金粒子（修飾金粒子）を保持するパッドであり、テストライン２は第２の結合物質が固定化されたラインであり、コントロールライン３は展開を確認するためのラインであり、発色試薬固定化ライン４は後述する還元剤液を検出するためのラインである。ここで上流側、下流側とは、金粒子複合体が展開する際、上流側から下流側に向けて展開することを意図した記載を意味する。
　上記不溶性担体（又はこれを有するイムノクロマトグラフキット）のより具体的な態様としては、例えば、特許第５７２８４５３号公報に記載の不溶性担体及びイムノクロマトグラフキットが挙げられ、不溶性担体及びイムノクロマトグラフキットに関する特許第５７２８４５３号公報に記載の内容はすべて本明細書の開示の一部として本明細書中に援用される。
（不溶性担体）
　不溶性担体は、多孔性担体が好ましい。特に、本発明の効果等がより優れる理由から、ニトロセルロース膜（ニトロセルロースメンブレン）、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましく、ニトロセルロース膜がより好ましい。
（第２の結合物質）
　第２の結合物質は上記抗原と結合し得るものであれば特に制限されない。
　第２の結合物質の具体例及び好適な態様は、上述した第１の結合物質と同じである。
　なお、上記第２の結合物質は上述した第１の結合物質と同じであっても異なってもよいが、本発明の効果等がより優れる理由から、異なる物質である態様が好ましい。
　また、第１の結合物質及び第２の結合物質が抗体である場合、第１の結合物質である抗体と第２の結合物質である抗体は、本発明の効果等がより優れる理由から、異なる態様が好ましい。
　また、第１の結合物質及び第２の結合物質が抗体である場合、第１の結合物質のエピトープ（第１の結合物質が認識する抗原の一部）と第２の結合物質のエピトープ（第２の結合物質が認識する抗原の一部）は、本発明の効果等がより優れる理由から、異なる態様が好ましい。抗体のエピトープが異なることは、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）によって確認することができる。
＜展開＞
　金粒子複合体を形成させた状態でテストラインを有する不溶性担体に展開する方法は特に制限されないが、例えば、上述した図１に示されるようなニトロセルロースメンブレン１００（又はこれを有するイムノクロマトグラフキット）を準備して、上述した中和工程で得られた中和抗原濃縮液を金コロイド保持パッドに滴下し、図１に示されるように上流側から下流側に毛細管現象を利用して移動させる方法等が挙げられる。
〔捕捉工程〕
　捕捉工程は、上記不溶性担体の反応部位において、上記金粒子複合体を捕捉する工程である。
　上述のとおり、不溶性担体の反応部位には抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化されているため、上記展開工程で不溶性担体に展開された金粒子複合体（抗原と修飾金粒子との複合体）は、不溶性担体の反応部位（テストライン）で捕捉される。
　捕捉された金粒子複合体は金粒子の表面プラズモン等により着色するため、視認できる。また、画像解析装置等を用いて、捕捉された複合体の濃度を見積もることもできる。このようにして、試料中の抗原を検出することができる。
　なお、試料が抗原を含まない場合には上記金粒子複合体が形成されないため、不溶性担体の反応部位で捕捉されず、着色しない。
〔銀増幅工程〕
　銀増幅工程は、上記捕捉工程で捕捉された金粒子複合体を銀増幅する工程である。
　銀増幅工程は、上記捕捉工程後の不溶性担体に銀イオンを付与することで、不溶性担体の反応部位で捕捉された金粒子複合体に大きな銀粒子を形成する工程である。より詳細には、上記金粒子複合体の金粒子を触媒として銀イオンが還元され、銀粒子（例えば、直径１０μｍ以上）が形成される工程である。
　これにより、捕捉された金粒子複合体の検出感度が著しく向上する。
＜好適な態様＞
　上記捕捉工程後の不溶性担体に銀イオンを付与する方法は特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、下記還元剤液及び下記銀増幅液を使用する方法が好ましい。
　また、還元剤液及び銀増幅液に加えて、特異的な結合反応以外で不溶性担体に残存している金粒子複合体を洗浄するために洗浄液を使用してもよい。上記還元液は洗浄液を兼ねていてもよい。
（還元剤液）
　上記還元剤液は、銀イオンを還元し得る還元剤を含有する。銀イオンを還元し得る還元剤は、銀イオンを銀に還元することができれば、無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。無機還元剤としては、Ｆｅ２＋、Ｖ２＋、Ｔｉ３＋、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元性金属塩、還元性金属錯塩を好ましく挙げることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Ｆｅ２＋を還元剤として用いる系では、クエン酸やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて酸化物であるＦｅ３＋の錯体を形成し、無害化することができる。本発明ではこのような無機還元剤を用いることが好ましい。
本発明のより好ましい態様としては、Ｆｅ２＋の金属塩を還元剤として用いることが好ましい。
　なお、湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬（例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、３－ピラゾリドン類、ｐ－アミノフェノール類、ｐ－フェニレンジアミン類、ヒンダードフェノール類、アミドキシム類、アジン類、カテコール類、ピロガロール類、アスコルビン酸（またはその誘導体）、およびロイコ色素類）、および本分野での技術に熟練しているものにとって明らかなその他の材料、例えば米国特許第６，０２０，１１７号に記載されている材料も還元剤として用いることができる。
　還元剤としては、アスコルビン酸還元剤も好ましい。有用なアスコルビン酸還元剤は、アスコルビン酸とその類縁体、異性体とその誘導体を含み、例えば、Ｄ－またはＬ－アスコルビン酸とその糖誘導体（例えばγ－ラクトアスコルビン酸、グルコアスコルビン酸、フコアスコルビン酸、グルコヘプトアスコルビン酸、マルトアスコルビン酸）、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸（又はＬ－エリスロアスコルビン酸）、その塩（例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩又は当技術分野において知られている塩）、エンジオールタイプのアスコルビン酸、エナミノールタイプのアスコルビン酸、チオエノ－ルタイプのアスコルビン酸等を好ましく挙げることができ、特にはＤ、ＬまたはＤ，Ｌ－アスコルビン酸（そして、そのアルカリ金属塩）若しくはイソアスコルビン酸（またはそのアルカリ金属塩）が好ましく、ナトリウム塩が好ましい塩である。必要に応じてこれらの還元剤の混合物を用いることができる。
　還元剤液は、本発明の効果等がより優れる理由から、展開工程における展開方向と還元剤液の展開方向との間の角度が０度～１５０度になるように流すのが好ましく、展開工程における展開方向と還元剤液の展開方向との間の角度が０度～１３５度になるように流すのがより好ましい。
　なお、展開工程における展開方向と還元剤液の展開方向との間の角度を調節する方法としては、例えば、特開２００９－１５０８６９号公報の実施例に記載の方法等が挙げられる。
（銀増幅液）
　上記銀増幅液は、銀イオンを含む化合物を含有する液である。銀イオンを含む化合物としては、例えば、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。好ましくは、水などの溶媒に対して溶解度の高い銀イオン含有化合物である、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀、チオ硫酸銀などが挙げられる。特に好ましくは硝酸銀である。銀錯体としては、水酸基やスルホン基など水溶性基を有する配位子に配位された銀錯体が好ましく、ヒドロキシチオエーテル銀等が挙げられる。
　有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体は、銀として銀増幅液に０．００１ｍｏｌ／Ｌ～５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．００５ｍｏｌ／Ｌ～３ｍｏｌ／Ｌ、更には０．０１ｍｏｌ／Ｌ～１ｍｏｌ／Ｌの濃度で含有されることが好ましい。
　銀増幅液の助剤としては、緩衝剤、防腐剤、例えば酸化防止剤または有機安定剤、速度調節剤等が挙げられる。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらの塩のうちの一つ、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅溶液に最適なｐＨに調整することができる。また、カブリ防止剤としてアルキルアミンを助剤として用いることができ、特に好ましくはドデシルアミンである。またこれら助剤の溶解性向上のため、界面活性剤を用いることができ、特に好ましくはＣ９Ｈ１９－Ｃ６Ｈ４－Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）５０Ｈである。
　銀増幅液は、本発明の効果等がより優れる理由から、上述した展開工程と逆方向から流すのが好ましく、展開工程における展開方向と還元剤液の展開方向との間の角度が４５度～１８０度になるように流すのがより好ましい。
　なお、展開工程における展開方向と銀増幅液の展開方向との間の角度を調節する方法としては、例えば、特開２００９－１５０８６９号公報の実施例に記載の方法等が挙げられる。
　以下、実施例により、本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［１］実施例Ａ
［検体液の調製］
　健常人の尿検体（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社）をプールした尿検体に、結核菌より抽出されたリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）（０２２４９－６１、ナカライテスク社）（抗原）を添加し、表１に記載のＬＡＭ濃度の検体液（抗原を含み得る試料）を調製した。
［実施例１］
　以下のとおり、実施例１のイムノクロマトグラフィーを行った。
〔混合工程〕
　金コロイド粒子（ＢＢＩ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ；粒子径：５０ｎｍ）と抗ＬＡＭモノクローナル抗体（抗原と特異的に親和性を有する物質）（国際公開２０１７／１３９１５３号（ＤＥＴＡＩＬＥＤ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ　Ｄ．Ａｎｔｉ－ＬＡＭ　ａｎｄ　Ａｎｔｉ－ＰＩＭ６／ＬＡＭ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　１））とを反応させて、抗ＬＡＭモノクローナル抗体で修飾された金コロイド粒子である修飾金コロイド粒子（修飾粒子）を得た。
　上述した検体液（６ｍＬ）に免疫反応に十分な量の上記修飾粒子を加え、４０分間反応させた。このようにして、ＬＡＭと上記修飾粒子との複合体である粒子複合体を含有する混合物を得た。
〔沈降工程〕
　次いで、遠心機を用いて、遠心力：８０００Ｇ、時間：１５分間の遠心分離条件で、上記混合物中の粒子複合体を沈降させた。
〔乖離工程〕
　沈降後、上澄み液を廃棄して、粒子複合体に５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ水溶液（アルカリ性の液）を０．２ｍＬ添加した。添加後５分間超音波処理して、６０分間静置した。このようにして、粒子複合体を抗原と粒子とに乖離させた。
　なお、検体液に対する乖離液の割合は、質量比で、１／３０である。
〔回収工程〕
　そして、遠心機を用いて、上述した遠心分離条件で、乖離した粒子を沈降させ、上澄み液（ＬＡＭ濃縮液）（抗原濃縮液）を回収した。
〔中和工程〕
　１ｍｏｌ／Ｌの濃度の　トリスＨＣｌ　０．０１ｍＬを中和液として用いて、上記ＬＡＭ濃縮液を中和して、中和ＬＡＭ濃縮液（中和抗原濃縮液）を得た。得られたＬＡＭ濃縮液について質量分析を行ったところ、ＬＡＭ濃度が１０倍に濃縮されていることが確認された。
〔展開工程及び捕捉工程〕
　得られた中和ＬＡＭ濃縮液をＡｌｅｒｅ社製のＬＡＭ検出キット（Ｃｌｅａｒｖｉｅｗ　ＴＢ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ）に適用することで、上述した展開工程及び捕捉工程を行った。
〔評価〕
　テストラインの着色を目視により確認し、以下の基準で評価した。
　＋＋：明確に検出された。
　＋：うっすらと検出された。
　－：濃度上昇が検出されない。
　結果を表１に示す。＋＋又は＋と評価された検体液のＬＡＭ濃度のうち最も小さいＬＡＭ濃度（最小検出感度）が小さい程、検出感度が高いことを意味する。
［実施例２］
　混合工程において下記修飾粒子を用いた点以外は、上述した実施例１と同様の手順にしたがってイムノクロマトグラフィーを実施し、評価した。結果を表１に示す。
〔実施例２の混合工程で用いた修飾粒子〕
　－ＣＯＯＨ末端のポリスチレン粒子（Ｃｏｒｅｆｒｏｎｔ社製、粒子径：２μｍ）と抗リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）モノクローナル抗体（抗原と特異的に親和性を有する物質）（ナカライテスク社製　製品コード０５４９４－８４）とを反応させて、抗ＬＡＭモノクローナル抗体で修飾されたポリスチレン粒子である修飾ポリスチレン粒子（修飾粒子）を得た。なお、修飾の際に１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、ナカライ社製）を用いてポリスチレン粒子の－ＣＯＯＨ末端を活性化させた。
［実施例３］
　乖離工程において、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ水溶液０．２ｍＬの代わりに、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＣｌ水溶液（酸性の液）０．２ｍＬを用い、中和工程において、１ｍｏｌ／Ｌ　トリスＨＣｌ　０．０１ｍＬの代わりに、１ｍｏｌ／Ｌ　トリスＮａＯＨ　０．０１ｍＬを用いた以外は、上述した実施例２と同様の手順にしたがって、イムノクロマトグラフィーを実施し、評価した。結果を表１に示す。
［比較例１］
　濃縮工程（混合工程から中和工程まで）を行わずに、展開工程以降において中和ＬＡＭ濃縮液の代わりに上述した検体液自体を用いた点以外は、上述した実施例１と同様の手順にしたがって、イムノクロマトグラフィーを実施し、評価した。結果を表１に示す。
［比較例２］
　展開工程において中和ＬＡＭ濃縮液の代わりに下記ＬＡＭ濃縮液を用いた点以外は、上述した実施例１と同様の手順にしたがって、イムノクロマトグラフィーを実施し、評価した。結果を表１に示す。
〔比較例２で用いられたＬＡＭ濃縮液〕
　上述した検体液６ｍＬを凍結乾燥によって濃縮した。具体的には、上述した検体液６ｍＬを－８０℃で１０時間凍結させた後、小型凍結乾燥機ＦＤＳ－１０００（東京理科器械（株）社製）を用いて、２４時間凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、ＬＡＭが含まれていない尿を０．２ｍＬ添加して、ＬＡＭ濃度が１０倍に濃縮されたＬＡＭ濃縮液を得た。なお、組成分析の結果、尿素及びリン酸ナトリウム等の夾雑物が含まれていることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１から分かるように、上述した濃縮工程を行わなかった比較例１、及び、凍結乾燥によって濃縮した比較例２と比較して、上述した濃縮工程を行った実施例１～３は、高い検出感度を示した。なかでも、乖離液がＮａＯＨを含有する実施例１～２は、より高い検出感度を示した。
［２］実施例Ｂ
［検体液の調製］
　健常人の尿検体（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社）をプールした尿検体に、結核菌より抽出されたリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）（０２２４９－６１、ナカライテスク社）（抗原）を添加し、表２に記載のＬＡＭ濃度の検体液（抗原を含み得る試料）を調製した。
［実施例４］
　表２に記載のＬＡＭ濃度の検体液（６ｍＬ）を用いた点以外は、上述した実施例２と同様の手順に従って、濃縮工程（混合工程から中和工程まで）を行った。そして、得られた中和ＬＡＭ濃縮液（中和抗原濃縮液）を用いて、下記展開工程以降を行った。
〔展開工程〕
　図１に示されるように、上流側から、金コロイド保持パッド１、テストライン２、コントロールライン３、発色試薬固定化ライン４を有するニトロセルロースメンブレン１００を準備した。なお、金コロイド保持パッド１は、抗ＬＡＭモノクローナル抗体で修飾された金コロイド粒子である修飾金コロイド粒子（標識用修飾粒子）を保持するパッドであり、テストライン２は、抗ＬＡＭモノクローナル抗体が固定化されたラインであり、コントロールライン３は、展開を確認するためのラインであり、発色試薬固定化ライン４は、後述する銀増幅工程の還元液を検出するためのラインである。
　上記中和ＬＡＭ濃縮液を金コロイド保持パッドに滴下した。これにより、液中のＬＡＭと抗ＬＡＭモノクローナル抗体で修飾された金コロイド粒子である修飾金コロイド粒子（標識用修飾粒子）との複合体である標識用粒子複合体が形成された。この状態で、上記ニトロセルロースメンブレンの上流側から下流側に向けて展開した。
〔捕捉工程〕
　展開工程で展開された標識用粒子複合体はテストラインで捕捉される。
〔銀増幅工程〕
　以下のとおり、銀増幅工程を実施した。
＜還元剤液の調製＞
　水２９０ｇに、硝酸鉄（ＩＩＩ）九水和物（富士フイルム和光純薬（株）社製）を水に溶解して作製した１ｍｏｌ／Ｌの硝酸鉄水溶液２３．６ｍＬ、及び、クエン酸（富士フイルム和光純薬社製）１３．１ｇを溶解させた。全て溶解した後、スターラーで攪拌しながら硝酸（１０質量％）を３６ｍｌ加え、硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物（富士フイルム和光純薬（株）社製）を６０．８ｇ加え、これを還元剤液とした。
＜銀増幅液の調製＞
　水６６ｇに、硝酸銀溶液８ｍＬ（１０ｇの硝酸銀を含む）と１ｍｏｌ／Ｌの硝酸鉄水溶液２４ｍＬを加えた。さらに、この溶液と、硝酸（１０質量％）５．９ｍＬ、ドデシルアミン（富士フイルム和光純薬（株）社製）０．１ｇ、界面活性剤Ｃ１２Ｈ２５－Ｃ６Ｈ４－Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）５０Ｈ　０．１ｇをあらかじめ４７．６ｇの水に溶解した溶液を混合し、これを銀増幅液とした。
＜還元剤液の展開＞
　ニトロセルロースメンブレンにおいて、上述した展開工程と同じ方向から（より上流側から）、上述のとおり調製した還元剤液を流した。
＜銀増幅液の展開＞
　発色試薬固定化ラインが変色した後、展開工程における展開方向と逆方向から（下流側から）、上述のとおり調製した銀増幅液を流した。このようにして、テストラインで捕捉された標識用粒子複合体を銀増幅した。
〔評価〕
　テストラインの着色を目視により確認し、以下の基準で評価した。
　＋＋：明確に検出された。
　＋：うっすらと検出された。
　－：濃度上昇が検出されない。
　結果を表２に示す。＋＋又は＋と評価された検体液のＬＡＭ濃度のうち最も小さいＬＡＭ濃度（最小検出感度）が小さい程、検出感度が高いことを意味する。
［比較例３］
　濃縮工程（混合工程から中和工程まで）を行わずに、展開工程以降において中和ＬＡＭ濃縮液の代わりに上述した検体液自体を用いた点以外は、上述した実施例４と同様の手順にしたがって、イムノクロマトグラフィーを実施し、評価した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２から分かるように、銀増幅を行ったイムノクロマトグラフィーにおいても、上述した濃縮工程を行わなかった比較例３と比較して、上述した濃縮工程を行った実施例４は、高い検出感度を示した。
　１　金コロイド保持パッド
　２　テストライン
　３　コントロールライン
　４　発色試薬固定化ライン
　１００　ニトロセルロースメンブレン

Claims (9)

  1. 　抗原を含み得る試料と、前記抗原と特異的に親和性を有する物質で修飾された粒子である修飾粒子とを混合することで、前記抗原と前記修飾粒子との複合体である粒子複合体を含有する混合物を得る、混合工程と、
    　遠心機を用いて、前記混合物中の前記粒子複合体を沈降させる、沈降工程と、
    　前記沈降した粒子複合体と、前記抗原を含み得る試料よりも少ない量の、アルカリ性又は酸性の液である乖離液とを混合することで、前記粒子複合体を抗原と粒子とに乖離させる、乖離工程と、
    　遠心機を用いて、前記乖離した粒子を沈降させ、抗原濃縮液を回収する、回収工程と、
    　中和液を用いて、前記抗原濃縮液を中和することで、中和抗原濃縮液を得る、中和工程と、
    　前記中和抗原濃縮液中の抗原と、前記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された標識用粒子である標識用修飾粒子との複合体である標識用粒子複合体を形成させた状態で、前記抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する、展開工程と、
    　前記不溶性担体の反応部位において、前記標識用粒子複合体を捕捉する、捕捉工程と、を備える、イムノクロマトグラフィー。
  2. 　前記展開工程が、前記中和抗原濃縮液中の抗原と、前記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された金粒子である修飾金粒子との複合体である標識用金粒子複合体を形成させた状態で、前記抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する工程であり、
    　前記捕捉工程が、前記不溶性担体の反応部位において、前記標識用金粒子複合体を捕捉する工程であり、
    　さらに、前記捕捉工程で捕捉された標識用金粒子複合体を銀増幅する、銀増幅工程を備える、請求項１に記載のイムノクロマトグラフィー。
  3. 　前記混合工程で用いられる修飾粒子の粒子径が、５０ｎｍ～３０００ｎｍである、請求項１又は２に記載のイムノクロマトグラフィー。
  4. 　前記抗原を含み得る試料に対する、前記乖離液の割合が、質量比で、１／５以下である、請求項１～３のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー。
  5. 　前記抗原を含み得る試料が、尿である、請求項１～４のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー。
  6. 　前記抗原が、糖鎖である、請求項１～５のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー。
  7. 　前記乖離液が、ＮａＯＨ又はＨＣｌを含有する、請求項１～６のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー。
  8. 　前記中和液が、トリシン、トリス、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、グリシンアミド及びビシンからなる群より選択される少なくとも１種とＨＣＬとを含有する、又は、トリシン、トリス、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、グリシンアミド及びビシンからなる群より選択される少なくとも１種とＮａＯＨとを含有する、請求項１～７のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー。
  9. 　前記抗原が、リポアラビノマンナンである、請求項１～８のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー。
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