WO2021152965A1 - イムノクロマトグラフィー - Google Patents

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WO2021152965A1
WO2021152965A1 PCT/JP2020/042911 JP2020042911W WO2021152965A1 WO 2021152965 A1 WO2021152965 A1 WO 2021152965A1 JP 2020042911 W JP2020042911 W JP 2020042911W WO 2021152965 A1 WO2021152965 A1 WO 2021152965A1
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antigen
complex
silver
immunochromatography
solution
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PCT/JP2020/042911
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吉宏 油屋
順一 片田
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富士フイルム株式会社
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    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Definitions

  • the present invention relates to immunochromatography.
  • Immunochromatography is frequently used these days because it is easy to operate and can be measured in a short time.
  • an antigen such as influenza virus or lipoarabinomannan (LAM)
  • LAM lipoarabinomannan
  • the following operation is performed.
  • a substance to be a label modified with an antibody for example, gold particles
  • the modified gold particles are prepared and mixed with a sample containing an antigen.
  • the modified gold particles bind to the antigen to form a particle complex.
  • the particle complex is developed on an insoluble carrier having a detection line coated with an antibody that specifically reacts with an antigen
  • the particle complex reacts with the antibody on the detection line (test line) and is captured, and is visually observed or the like. Detection is confirmed.
  • Examples of such an immunochromatography include the methods disclosed in Patent Document 1.
  • an object of the present invention to provide an immunochromatography having high detection sensitivity.
  • the present inventors have found that the above problems can be solved by concentrating the sample solution by ultrafiltration, and have reached the present invention. That is, the present inventors have found that the above problems can be solved by the following configuration.
  • the immunochromatography of the present invention will be described below.
  • the numerical range represented by using “-" in the present specification means a range including the numerical values before and after "-" as the lower limit value and the upper limit value.
  • each component may be used alone or in combination of two or more.
  • the content of the component means the total content unless otherwise specified.
  • the detection sensitivity and the S / N ratio (signal / noise ratio) are further improved is also referred to as "the effect of the present invention is more excellent”.
  • the immunochromatography of the present invention (hereinafter, also referred to as "the method of the present invention") is A concentration step of concentrating a solution containing an antigen by ultrafiltration to obtain an antigen concentrate, It binds to the antigen in a state where a particle complex which is a complex of the antigen in the antigen concentrate and modified particles which are particles modified with a first binding substance capable of binding to the antigen is formed.
  • sample solution that may contain an antigen
  • sample solution that may contain an antigen
  • the sample solution is concentrated by ultrafiltration.
  • the water in the sample solution passes through the ultrafiltration membrane, whereas the antigen in the sample solution has a certain molecular weight, so it is difficult to pass through the ultrafiltration membrane.
  • the antigen in the sample solution is concentrated, leading to improvement in detection sensitivity.
  • the sample solution usually contains impurities such as small molecule components and salts in addition to water.
  • the method of the present invention is based on the above findings and the like. That is, in the method of the present invention, since it is concentrated by ultrafiltration, these impurities pass through the ultrafiltration membrane together with water. Therefore, the above-mentioned decrease in detection sensitivity is unlikely to occur. As a result, it is considered that extremely high detection sensitivity is achieved.
  • the concentration step is a step of concentrating a liquid (sample liquid) that can contain an antigen by ultrafiltration to obtain an antigen concentrate.
  • sample solution used in the concentration step is not particularly limited as long as it can contain an antigen.
  • fluids include, for example, biological samples, especially animal (particularly human) body fluids (eg, blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, tears, sweat, urine, pus, runny nose, or sputum). Mouthwash and the like can be mentioned.
  • the sample solution is preferably urine because the effect of the present invention is more excellent.
  • antigen examples include bacteria, bacteria (for example, Mycobacterium tuberculosis, lipoarabinomannan (LAM) contained in Mycobacterium tuberculosis), bacteria, viruses (for example, influenza virus), and their nucleoproteins.
  • LAM is a major antigen in tuberculosis and a glycolipid which is a major constituent of cell membranes and cell walls.
  • the antigen is more preferably a virus (particularly influenza virus) or LAM, and even more preferably LAM, for the reason that the effects of the present invention are more excellent.
  • the sample solution is obtained as it is, in the form of an extract obtained by extracting an antigen with an appropriate extraction solvent, and further by diluting the extract with an appropriate diluent. It can be used in the form of a diluted solution or in the form of the extract concentrated by an appropriate method.
  • the extraction solvent is a solvent used in ordinary immunological analysis methods (for example, water, physiological saline, buffer solution, etc.), or a direct antigen-antibody reaction is carried out by diluting with such a solvent. It is also possible to use a water-miscible organic solvent that can be used.
  • the ultrafiltration membrane used in the above ultrafiltration is not particularly limited.
  • the material of the ultrafiltration membrane is not particularly limited, and specific examples thereof include cellulose, cellulose ester, polysulfone, sulfonated polysulfone, polyethersulfone, sulfonated polyethersulfone, chlorinated polyethylene, polypropylene, polyolefin, polyvinyl alcohol, and the like. Examples thereof include organic materials such as polymethylmethacrylate, polyvinylidene fluoride and polytetrafluoroethylene, metals such as stainless steel, and inorganic materials such as ceramics.
  • the fractional molecular weight of the ultrafiltration membrane is preferably smaller than the molecular weight of the antigen described above.
  • the fractional molecular weight is preferably 10 kDa or less, and more preferably 5 kDa or less.
  • the lower limit of the molecular weight cut-off is not particularly limited, but for the reason that the effect of the present invention is more excellent, it is preferably 0.1 kDa or more, more preferably 1 kDa or more, and further preferably 3 kDa or more. ..
  • the molecular weight of the fraction is described in "Molecular Weight of Solutes" on page 92 of the Membrane Experiment Series, Volume III, Artificial Membrane, Editor / Naofumi Kimura, Shinichi Nakao, Haruhiko Oya, Tsutomu Nakagawa (Kyoritsu Shuppan, 1993).
  • the horizontal axis is the horizontal axis and the inhibition rate is the vertical axis, and the data plotted is called the fractional molecular weight curve.
  • the molecular weight at which the inhibition rate is 90% is called the fractional molecular weight of the membrane.
  • the procedure of the concentration step is not particularly limited, and examples thereof include a method in which the sample solution is placed in an ultrafiltration device having an ultrafiltration membrane and centrifuged to obtain a residual solution (antigen concentrate). Among them, for the reason that the effect of the present invention is more excellent, a part of the sample solution is put into the limit filter device and centrifuged, and then a part of the remaining sample solution is added to the residual liquid after filtration of the limit filter device. It is preferable to put it in, further centrifuge it, and repeat this.
  • the developing step is a modified particle (preferably gold particles described later) modified with the antigen in the antigen concentrate obtained in the above-mentioned concentration step and a first binding substance capable of binding to the above-mentioned antigen.
  • the capture step is a step of capturing the particle complex at the reaction site of the insoluble carrier.
  • the amplification step is a step of amplifying the information of the particle complex captured in the capture step (preferably a silver amplification step described later).
  • a gold particle complex is formed, which is a complex of an antigen in the antigen concentrate obtained in the above-mentioned concentration step and modified gold particles which are gold particles modified with a first binding substance capable of binding to the antigen.
  • a second binding substance capable of binding to the antigen is developed into an insoluble carrier having an immobilized reaction site.
  • a capture step of capturing the gold particle complex at the reaction site of the insoluble carrier and It is preferable to include a silver amplification step of amplifying the gold particle complex captured in the capture step with silver.
  • the developing step is a gold particle which is a complex of an antigen in the antigen concentrate obtained in the above-mentioned concentration step and a modified gold particle which is a gold particle modified with a first binding substance capable of binding to the antigen.
  • This is a step of developing a second binding substance capable of binding to the antigen on an insoluble carrier having an immobilized reaction site (developing a gold particle complex) in a state where the complex is formed.
  • ⁇ Gold particle complex As described above, in the developing step, first, the antigen in the antigen concentrate obtained in the above-mentioned concentration step and the modified gold particles which are gold particles modified with the first binding substance capable of binding to the antigen are combined. A gold particle complex, which is a complex, is formed.
  • the modified gold particles are gold particles modified with a first binding substance capable of binding to the antigen.
  • Gold particles are not particularly limited, but are preferably gold colloidal particles for the reason that the effects of the present invention are more excellent.
  • the gold particles act as a catalyst for reducing silver ions in the silver amplification step described later.
  • the particle size of the gold particles is preferably 500 nm or less, more preferably 300 nm or less, further preferably 200 nm or less, still more preferably 150 nm or less, for the reason that the effects of the present invention are more excellent. Is particularly preferable.
  • the lower limit of the particle size of the gold particles is not particularly limited, but for the reason that the effect of the present invention is more excellent, it is preferably 5 nm or more, more preferably 7 nm or more, still more preferably 10 nm or more. ..
  • the particle size can be measured with a commercially available particle size distribution meter or the like.
  • a measurement method of particle size distribution optical microscopy, confocal laser microscopy, electron microscopy, atomic force microscopy, static light scattering, laser diffraction, dynamic light scattering, centrifugal sedimentation, electric pulse Measurement methods, chromatography methods, ultrasonic attenuation methods, etc. are known, and devices corresponding to each principle are commercially available.
  • a dynamic light scattering method can be preferably used because of the particle size range and ease of measurement.
  • Nanotrack UPA Nikkiso Co., Ltd.
  • dynamic light scattering particle size distribution measuring device LB-550 Horiba Seisakusho Co., Ltd.
  • the first binding substance is not particularly limited as long as it can bind to the above antigen, but it is preferably a protein and an antibody (for example, for example) because the effect of the present invention is more excellent. , Polyclonal antibody, or monoclonal antibody), and a monoclonal antibody is even more preferable from the viewpoint of achieving higher detection sensitivity.
  • the above antibody is not particularly limited, but for example, an antiserum prepared from the serum of an animal immunized with an antigen, an immunoglobulin fraction purified from the antiserum can be used, and the antibody is immunized with the antigen.
  • Monoclonal antibodies obtained by cell fusion using animal spleen cells or fragments thereof [eg, F (ab') 2, Fab, Fab', or Fv] can be used. Preparation of these antibodies can be carried out by a conventional method.
  • the A194-01 antibody described in International Publication No. 2017/139153 can be mentioned. All content described in WO 2017/139153 relating to A194-01 antibody is incorporated herein by reference as part of the disclosure herein.
  • an antibody having the sequence described as MoAb1 in paragraph number [0080] of WO 2013/12963 can be mentioned. All of the content described in WO 2013/129634 relating to MoAb1 antibodies is incorporated herein by reference as part of the disclosure herein.
  • the method for producing the modified gold particles is not particularly limited, and a known method can be used. For example, by utilizing the chemical bond between gold and SH group, when the SH group on the antibody approaches the gold particle, the SH bond is cleaved and immobilized by the Au—S bond generated on the Au surface. Chemical binding method of.
  • the insoluble carrier is an insoluble carrier having a reaction site (test line) on which a second binding substance capable of binding to the antigen is immobilized.
  • the insoluble carrier may have a plurality of test lines depending on the type of antigen (for example, a test line for influenza A virus and a test line for influenza B virus).
  • the insoluble carrier may have a control line on the downstream side of the test line in order to confirm the development of the gold particle complex.
  • a color-developing reagent immobilization line may be provided on the downstream side of the test line in order to detect the reducing agent solution.
  • the insoluble carrier for example, as shown in FIG.
  • the gold colloid holding pad 1 is a pad for holding gold particles (modified gold particles) modified with the first binding substance
  • the test line 2 is a line on which the second binding substance is immobilized.
  • the control line 3 is a line for confirming the development
  • the color-developing reagent immobilization line 4 is a line for detecting the reducing agent solution described later.
  • the upstream side and the downstream side mean a description intended to be developed from the upstream side to the downstream side when the gold particle composite is developed.
  • the insoluble carrier or an immunochromatographic kit having the same
  • the insoluble carrier and the immunochromatographic kit described in Japanese Patent No. 5728453 can be mentioned, and Patent No. All of the content described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 5728453 is incorporated herein by reference as part of the disclosure of this specification.
  • the insoluble carrier is preferably a porous carrier.
  • nitrocellulose membrane nitrocellulose membrane
  • cellulose membrane cellulose membrane
  • acetylcellulose membrane polysulfone membrane
  • polyethersulfone membrane nylon membrane
  • glass fiber glass fiber
  • non-woven fabric cloth, thread, etc.
  • a nitrocellulose membrane is more preferable.
  • the second binding substance is not particularly limited as long as it can bind to the above antigen. Specific examples and preferred embodiments of the second binding substance are the same as those of the first binding substance described above.
  • the second binding substance may be the same as or different from the first binding substance described above, but it is preferable that the second binding substance is a different substance for the reason that the effect of the present invention is more excellent. Further, when the first binding substance and the second binding substance are antibodies, the antibody which is the first binding substance and the antibody which is the second binding substance are different because the effects of the present invention and the like are more excellent. Aspects are preferred. When the first binding substance and the second binding substance are antibodies, the epitope of the first binding substance (a part of the antigen recognized by the first binding substance) and the epitope of the second binding substance (the first). A different embodiment of the antigen recognized by the binding substance (2) is preferable because the effect of the present invention is more excellent. The difference in the epitope of the antibody can be confirmed by, for example, ELISA (Enzyme-Linked Immuno Substance Assay).
  • the method of developing the gold particle complex on an insoluble carrier having a test line is not particularly limited, and for example, a nitrocellulose membrane 100 (or an immunochromatographic kit having the same) as shown in FIG. 1 described above). Is prepared, and the antigen concentrate obtained in the above-mentioned concentration step is dropped onto a gold colloid holding pad and moved from the upstream side to the downstream side by using the capillary phenomenon as shown in FIG. Be done.
  • the capture step is a step of capturing the gold particle complex at the reaction site of the insoluble carrier.
  • the gold particle composite (antigen and modified gold particles) developed on the insoluble carrier in the above developing step. Complex) is captured at the reaction site (test line) of the insoluble carrier. If the sample solution does not contain an antigen, the gold particle complex is not formed, so that the gold particle complex is not captured at the reaction site of the insoluble carrier.
  • the silver amplification step is a step of silver-amplifying the gold particle complex captured in the capture step.
  • the silver amplification step is a step of forming large silver particles in the gold particle composite captured at the reaction site of the insoluble carrier by imparting silver ions to the insoluble carrier after the capture step. More specifically, it is a step in which silver ions are reduced using the gold particles of the gold particle complex as a catalyst to form silver particles (for example, a diameter of 10 ⁇ m or more). This significantly improves the detection sensitivity of the captured gold particle complex.
  • the method of imparting silver ions to the insoluble carrier after the capture step is not particularly limited, but a method of using the following reducing agent solution and the following silver amplification solution is preferable for the reason that the effect of the present invention is more excellent. Further, in addition to the reducing agent solution and the silver amplification solution, a washing solution may be used to wash the complex remaining on the insoluble carrier other than the specific binding reaction.
  • the reducing liquid may also serve as a cleaning liquid.
  • the reducing agent solution contains a reducing agent capable of reducing silver ions.
  • the reducing agent capable of reducing silver ions can be used in any inorganic or organic material or a mixture thereof as long as silver ions can be reduced to silver.
  • As the inorganic reducing agent a reducing metal salt whose valence can be changed by metal ions such as Fe 2+ , V 2+ , and Ti 3+, and a reducing metal complex salt can be preferably mentioned.
  • an inorganic reducing agent it is necessary to complex or reduce oxidized ions to remove or detoxify them.
  • citric acid or ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) can be used to form a complex of Fe 3+ , which is an oxide, to make it harmless.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • a metal salt of Fe 2+ as a reducing agent.
  • the main developer used in the wet silver halide photographic photosensitive material for example, methyl gallic acid, hydroquinone, substituted hydroquinone, 3-pyrazolidones, p-aminophenols, p-phenylenediamines, hindered phenols, amidoxime).
  • Adins, catechols, pyrogallols, ascorbic acid (or derivatives thereof), and leuco pigments and other materials apparent to those skilled in the art, such as US Pat. No. 6,
  • the materials described in Nos. 020 and 117 can also be used as reducing agents.
  • Ascorbic acid reducing agent is also preferable as the reducing agent.
  • Useful ascorbic acid reducing agents include ascorbic acid and its analogs, isomers and derivatives thereof, such as D- or L-ascorbic acid and sugar derivatives thereof (eg, ⁇ -lactoascorbic acid, glucoascorbic acid, fucoascorbic acid).
  • Acid glucoheptascorbic acid, maltoascorbic acid
  • sodium salt of ascorbic acid potassium salt of ascorbic acid
  • isoascorbic acid or L-erythroascorbic acid
  • salts thereof eg alkali metal salt, ammonium salt or the present technology Salts known in the art
  • endiol type ascorbic acid enaminol type ascorbic acid, thioenoal type ascorbic acid and the like
  • endiol type ascorbic acid enaminol type ascorbic acid, thioenoal type ascorbic acid and the like
  • D, L or D, L-ascorbic acid And the alkali metal salt) or isoascorbic acid (or the alkali metal salt thereof) is preferable, and the sodium salt is a preferable salt.
  • a mixture of these reducing agents can be used.
  • the reducing agent solution is preferably flown so that the angle between the developing direction in the developing step and the developing direction of the reducing agent solution is 0 to 150 degrees for the reason that the effect of the present invention is more excellent. It is more preferable to flow the reducing agent solution so that the angle between the developing direction and the developing direction of the reducing agent liquid is 0 to 135 degrees. Examples of the method for adjusting the angle between the developing direction and the developing direction of the reducing agent solution in the developing step include the methods described in Examples of JP-A-2009-150869.
  • the silver amplification liquid is a liquid containing a compound containing silver ions.
  • a compound containing silver ions for example, an organic silver salt, an inorganic silver salt, or a silver complex can be used.
  • silver nitrate, silver acetate, silver lactate, silver butyrate, silver thiosulfate and the like which are silver ion-containing compounds having high solubility in a solvent such as water, can be mentioned.
  • Particularly preferred is silver nitrate.
  • a silver complex coordinated with a ligand having a water-soluble group such as a hydroxyl group or a sulfone group is preferable, and hydroxythioether silver and the like can be mentioned.
  • the organic silver salt, the inorganic silver salt, or the silver complex is 0.001 mol / L to 5 mol / L, preferably 0.005 mol / L to 3 mol / L, and further 0.01 mol / L to 1 mol in the silver amplification solution as silver. It is preferably contained at a concentration of / L.
  • auxiliary agent for the silver amplification liquid examples include buffers, preservatives, for example, antioxidants or organic stabilizers, speed regulators and the like.
  • buffers include acetic acid, citric acid, sodium hydroxide or one of these salts, a buffer using tris (hydroxymethyl) aminomethane, and other buffers used in general chemical experiments. Can be used. These buffers can be appropriately used to adjust the pH to the optimum pH for the amplified solution.
  • an alkylamine can be used as an auxiliary agent as an antifog agent, and dodecylamine is particularly preferable.
  • a surfactant can be used, and particularly preferably C 9 H 19- C 6 H 4- O- (CH 2 CH 2 O) 50 H.
  • the silver amplification liquid is preferably flowed from the direction opposite to the development step described above because the effect of the present invention is more excellent, and the angle between the development direction in the development step and the development direction of the reducing agent solution is 45 degrees or more. It is more preferable to flow at 180 degrees.
  • Examples of the method for adjusting the angle between the developing direction and the developing direction of the silver amplification liquid in the developing step include the methods described in Examples of JP-A-2009-150869. Further, a supply mode in which silver is dropped onto the insoluble carrier from above is also preferable so that silver amplification can be performed in a short time.
  • Lipoarabinomannan (LAM) (02249-61, Nacalai Tesque) (antigen) extracted from Mycobacterium tuberculosis was added to a pooled urine sample of a healthy person (Bioreclamation IVT), and is shown in Table 1.
  • a sample solution having a LAM concentration (a solution capable of containing an antigen) was prepared.
  • Example 1 The later, immunochromatography of Example 1 was performed.
  • a nitrocellulose membrane 100 having a gold colloid holding pad 1, a test line 2, a control line 3, and a coloring reagent immobilization line 4 was prepared from the upstream side.
  • the gold colloid holding pad 1 is a pad that holds gold colloid (modified gold particles) modified with an anti-LAM monoclonal antibody
  • the test line 2 is a line on which an anti-LAM monoclonal antibody is immobilized and is a control.
  • the line 3 is a line for confirming the development
  • the color-developing reagent immobilization line 4 is a line for detecting the reducing liquid in the silver amplification step described later.
  • the above LAM concentrate was added dropwise to the gold colloid holding pad.
  • a gold particle composite which is a composite of LAM in the liquid and gold colloidal particles (modified gold particles) modified with an anti-LAM monoclonal antibody, was formed.
  • the nitrocellulose membrane was developed from the upstream side to the downstream side.
  • the silver amplification step was carried out as follows.
  • Example 2 In the concentration step, instead of the Mercon (registered trademark) Ultra ultrafiltration unit (molecular weight cut-off of the ultrafiltration membrane: 3 kDa, 0.5 mL), the Amicon (registered trademark) Ultrafiltration unit manufactured by Merck is replaced. Immunochromatography was performed and evaluated according to the same procedure as in Example 1 described above, except that (molecular weight cut-off of ultrafiltration membrane: 10 kDa, 0.5 mL) was used. The results are shown in Table 1.
  • Example 3 In the concentration step, instead of the Mercon (registered trademark) Ultra ultrafiltration unit (molecular weight cut-off of the ultrafiltration membrane: 3 kDa, 0.5 mL), the Amicon (registered trademark) Ultrafiltration unit manufactured by Merck is replaced. Immunochromatography was performed and evaluated according to the same procedure as in Example 1 described above, except that (molecular weight cut-off of ultrafiltration membrane: 100 kDa, 0.5 mL) was used. The results are shown in Table 1.
  • Examples 1 to 3 concentrated by ultrafiltration showed higher detection sensitivity as compared with Comparative Example 1 which was not concentrated and Comparative Example 2 which was concentrated by freeze-drying. .. Among them, Examples 1 and 2 in which the fractional molecular weight of the ultrafiltration membrane used for the ultrafiltration was 1 kDa to 10 kDa showed higher detection sensitivity.

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Abstract

検出感度の高いイムノクロマトグラフィーを提供する。抗原を含み得る液を限外濾過によって濃縮して、抗原濃縮液を得る、濃縮工程と、　上記抗原濃縮液中の抗原と、上記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された粒子である修飾粒子との複合体である粒子複合体を形成させた状態で、上記抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する、展開工程と、　上記不溶性担体の反応部位において、上記粒子複合体を捕捉する、捕捉工程と、　上記捕捉工程で捕捉された粒子複合体の情報を増幅する、増幅工程と、を備える、イムノクロマトグラフィー。

Description

イムノクロマトグラフィー
　本発明は、イムノクロマトグラフィーに関する。
　イムノクロマトグラフィーは、操作が簡便であり短時間で測定可能であることから、昨今頻繁に利用されている。
　例えば、インフルエンザウイルス、リポアラビノマンナン（ＬＡＭ）等の抗原をイムノクロマトグラフィーで検出する場合、以下のような操作が行われる。
　まず、抗体で修飾された標識となる物質、例えば、金粒子を用いる場合には、修飾金粒子を用意し、抗原を含む試料と混合する。修飾金粒子は抗原と結合し、粒子複合体を形成する。この状態で、抗原と特異的に反応する抗体が塗布された検出ラインを有する不溶性担体に展開させると、粒子複合体は検出ライン（テストライン）上で抗体と反応して捕捉され、目視等により検出が確認される。
　このようなイムノクロマトグラフィーとしては、例えば、特許文献１に開示される方法が挙げられる。
特許第５７２８４５３号公報
　昨今、抗原の濃度が極めて薄い検体液にも適用可能な免疫診断法が望まれるなか、イムノクロマトグラフィーに対しても従来の方法（例えば、特許文献１に開示される方法）よりもさらに高感度な方法が求められている。
　そこで、本発明は、上記実情を鑑みて、検出感度の高いイムノクロマトグラフィーを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、検体液を限外濾過によって濃縮することで上記課題が解決できることを見出し、本発明に至った。
　すなわち、本発明者らは、以下の構成により上記課題が解決できることを見出した。
（１）　抗原を含み得る液を限外濾過によって濃縮して、抗原濃縮液を得る、濃縮工程と、
　上記抗原濃縮液中の抗原と、上記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された粒子である修飾粒子との複合体である粒子複合体を形成させた状態で、上記抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する、展開工程と、
　上記不溶性担体の反応部位において、上記粒子複合体を捕捉する、捕捉工程と、
　上記捕捉工程で捕捉された粒子複合体の情報を増幅する、増幅工程と、
を備える、イムノクロマトグラフィー。
（２）　上記限外濾過に用いられる限外濾過膜の分画分子量が、１ｋＤａ～１０ｋＤａである、上記（１）に記載のイムノクロマトグラフィー。
（３）　上記濃縮工程が、限界濾過器具に上記抗原を含み得る液を入れて遠心分離する工程である、上記（１）又は（２）に記載のイムノクロマトグラフィー。
（４）　上記濃縮工程が、限界濾過器具に上記抗原を含み得る液の一部を入れて遠心分離し、その後、上記限界濾過器具の濾過後の残液に残りの上記抗原を含み得る液の一部を入れてさらに遠心分離し、これを繰り返す工程である、上記（１）～（３）のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー。
（５）　上記抗原を含み得る液が、尿である、上記（１）～（４）のいずれかに記載のイムノクロマトグラフィー。
　以下に示すように、本発明によれば、検出感度の高いイムノクロマトグラフィーを提供することができる。
本発明の方法で使用される不溶性担体の一態様の模式図である。
　以下に、本発明のイムノクロマトグラフィーについて説明する。
　なお、本明細書において「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
　また、本明細書において各成分は、１種を単独で用いても、２種以上を併用して用いてもよい。ここで、各成分について２種以上を併用する場合、その成分について含有量とは、特段の断りが無い限り、合計の含有量を指す。
　また、本明細書において「検出感度及びＳ／Ｎ比（信号／ノイズ比）がより向上する」ことを「本発明の効果等がより優れる」とも言う。
　本発明のイムノクロマトグラフィー（以下、「本発明の方法」とも言う）は、
　抗原を含み得る液を限外濾過によって濃縮して、抗原濃縮液を得る、濃縮工程と、
　上記抗原濃縮液中の抗原と、上記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された粒子である修飾粒子との複合体である粒子複合体を形成させた状態で、上記抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する、展開工程と、
　上記不溶性担体の反応部位において、上記粒子複合体を捕捉する、捕捉工程と、
　上記捕捉工程で捕捉された粒子複合体の情報を増幅する、増幅工程と、を備える、イムノクロマトグラフィーである。
　本発明の方法はこのような構成をとるため、上述した効果が得られるものと推測される。その理由は明らかではないが、およそ以下のとおりと考えられる。
　上述のとおり、本発明の方法では、抗原を含み得る液（検体液）を限外濾過によって濃縮する。検体液を限外濾過によって濃縮した場合、検体液中の水は限外濾過膜を通過するのに対して、検体液中の抗原は、ある程度の分子量を有するため限外濾過膜を通過し難く、検体液中の抗原が濃縮され、検出感度の向上に繋がる。
　一方、検体液中には、通常、水に加えて低分子成分や塩等の夾雑物が含まれる。本発明者らの検討から、単に試料中の水を揮発させた場合、抗原と一緒にこれらの夾雑物が濃縮され、抗原抗体反応が阻害されて、検出感度が低下してしまうことが知見されている。すなわち、濃縮による検出感度の向上効果が十分に得られないことが分かっている。
　本発明の方法は上記知見等に基づくものである。すなわち、本発明の方法においては、限外濾過によって濃縮するため、これらの夾雑物は水と一緒に限外濾過膜を通過する。そのため、上述したような検出感度の低下が生じ難い。結果として、極めて高い検出感度が達成されるものと考えられる。
　以下、本発明の方法が備える各工程について説明する。
［濃縮工程］
　濃縮工程は、抗原を含み得る液（検体液）を限外濾過によって濃縮して、抗原濃縮液を得る工程である。
〔検体液〕
　濃縮工程で使用される検体液は、抗原を含み得る液であれば特に制限されない。そのような液としては、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）、うがい液等を挙げることができる。
　上記検体液は、本発明の効果等がより優れる理由から、尿であることが好ましい。
＜抗原＞
　抗原としては、例えば、菌、細菌（例えば、結核菌、結核菌に含まれるリポアラビノマンナン（ＬＡＭ））、バクテリア、ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）や、それらの核タンパク質等が挙げられる。なお、ＬＡＭは、結核における主要な抗原であり、細胞膜および細胞壁の主要構成成分である糖脂質である。
　抗原は、本発明の効果等がより優れる理由から、ウイルス（特に、インフルエンザウイルス）又はＬＡＭであることがより好ましく、ＬＡＭであることがさらに好ましい。
＜検体液の前処理＞
　上記検体液は、検体液をそのままで、又は、抗原を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、更には、抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。
　上記抽出用溶媒としては、通常の免疫学的分析法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液等）、あるいは、かかる溶媒で希釈することにより直接抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。
〔限外濾過膜〕
　上記限外濾過において使用される限外濾過膜は特に制限されない。
＜材質＞
　上記限外濾過膜の材質は特に制限されないが、具体例としては、セルロース、セルロースエステル、ポリスルホン、スルホン化ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、スルホン化ポリエーテルスルホン、塩素化ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリフッ化ビニリデン、ポリ４フッ化エチレン等の有機材料、ステンレス等の金属、又はセラミック等無機材料が挙げられる。
＜分画分子量＞
　上記限外濾過膜の分画分子量は上述した抗原の分子量よりも小さいことが好ましい。例えば、上述した抗原がＬＡＭ（分子量：約２０ｋＤａ）である場合、上記分画分子量は１０ｋＤａ以下であることが好ましく、５ｋＤａ以下であることがより好ましい。
　上記分画分子量の下限は特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、０．１ｋＤａ以上であることが好ましく、１ｋＤａ以上であることがより好ましく、３ｋＤａ以上であることがさらに好ましい。
　なお、分画分子量とは、日本膜学会編　膜学実験シリーズ　ＩＩＩ巻　人工膜編　編集委員／木村尚史・中尾真一・大矢晴彦・仲川勤（共立出版、１９９３年）９２頁に、「溶質の分子量を横軸に、阻止率を縦軸にとってデータをプロットしたものを分画分子量曲線とよんでいる。そして阻止率が９０％となる分子量を膜の分画分子量とよんでいる。」とあるように、限外濾過膜の膜性能を表す指標として当業者には周知のものである。
〔濃縮工程の手順〕
　濃縮工程の手順は特に制限されないが、例えば、限外濾過膜を有する限外濾過器具に検体液を入れて遠心分離して、残液（抗原濃縮液）を得る方法が挙げられる。なかでも、本発明の効果等がより優れる理由から、限界濾過器具に検体液の一部を入れて遠心分離し、その後、限界濾過器具の濾過後の残液に残りの検体液の一部を入れてさらに遠心分離し、これを繰り返すのが好ましい。
［展開工程］
　展開工程は、上述した濃縮工程で得られた抗原濃縮液中の抗原と、上記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された粒子（好ましくは後述する金粒子）である修飾粒子（好ましくは後述する修飾金粒子）との複合体である粒子複合体（好ましくは後述する金粒子複合体）を形成させた状態で、上記抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する（粒子複合体を展開する）工程である。
［捕捉工程］
　捕捉工程は、上記不溶性担体の反応部位において、上記粒子複合体を捕捉する工程である。
［増幅工程］
　増幅工程は、上記捕捉工程で捕捉された粒子複合体の情報を増幅する工程（好ましくは後述する銀増幅工程）である。
［検出工程の好適な態様］
　上記展開工程から上記増幅工程まで（以下、「検出工程」とも言う）は、本発明の効果等がより優れる理由から、
　上述した濃縮工程で得られた抗原濃縮液中の抗原と、上記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された金粒子である修飾金粒子との複合体である金粒子複合体を形成させた状態で、上記抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する、展開工程と、
　上記不溶性担体の反応部位において、上記金粒子複合体を捕捉する、捕捉工程と、
　上記捕捉工程で捕捉された金粒子複合体を銀増幅する、銀増幅工程と、を備えるのが好ましい。
　以下、上記好適な態様が備える各工程について説明する。
〔展開工程〕
　展開工程は、上述した濃縮工程で得られた抗原濃縮液中の抗原と、上記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された金粒子である修飾金粒子との複合体である金粒子複合体を形成させた状態で、上記抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する（金粒子複合体を展開する）工程である。
＜金粒子複合体＞
　上述のとおり、展開工程では、まず、上述した濃縮工程で得られた抗原濃縮液中の抗原と、上記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された金粒子である修飾金粒子との複合体である金粒子複合体を形成させる。
（修飾金粒子）
　修飾金粒子は、上記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された金粒子である。
（１）金粒子
　金粒子は特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、金コロイド粒子であることが好ましい。
　金粒子は、後述する銀増幅工程において銀イオンを還元する触媒として働く。
　上記金粒子の粒子径は、本発明の効果等がより優れる理由から、５００ｎｍ以下であることが好ましく、３００ｎｍ以下であることがより好ましく、２００ｎｍ以下であることがさらに好ましく、１５０ｎｍ以下であることが特に好ましい。
　上記金粒子の粒子径の下限は特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、５ｎｍ以上であることが好ましく、７ｎｍ以上であることがより好ましく、１０ｎｍ以上であることがさらに好ましい。
　なお、粒子径は、市販の粒度分布計等で計測することができる。粒度分布の測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。粒子径の測定方法としては、粒子径範囲および測定の容易さから、動的光散乱法を好ましく用いることができる。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックＵＰＡ（日機装（株））、動的光散乱式粒径分布測定装置ＬＢ－５５０（（株）堀場製作所）、濃厚系粒径アナライザーＦＰＡＲ－１０００（大塚電子（株））等が挙げられ、本発明においては、２５℃の測定温度で測定したメジアン径（ｄ＝５０）の値として求める。
（２）第１の結合物質
　第１の結合物質は上記抗原と結合し得るものであれば特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、タンパク質であることが好ましく、抗体（例えば、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体）であることがより好ましく、モノクローナル抗体であることがより高い検出感度を実現する観点でさらに好ましい。
　上記抗体は特に制限されないが、例えば、抗原によって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分を用いることが可能であり、また、抗原によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行うことができる。
　抗原がＬＡＭである場合の、第１の結合物質の一例としては、国際公開２０１７／１３９１５３号に記載のＡ１９４－０１抗体が挙げられる。Ａ１９４－０１抗体に関する国際公開２０１７／１３９１５３号に記載の内容はすべて本明細書の開示の一部として本明細書中に援用される。
　抗原がＬＡＭである場合の、第１の結合物質の別の一例としては、国際公開２０１３／１２９６３４号の段落番号［００８０］においてＭｏＡｂ１として記載される配列を有する抗体を挙げることができる。ＭｏＡｂ１抗体に関する国際公開２０１３／１２９６３４号に記載の内容はすべて本明細書の開示の一部として本明細書中に援用される。
（３）修飾金粒子の製造方法
　上記修飾金粒子を製造する方法は特に制限されず、公知の方法を用いることができる。
例えば、金とＳＨ基とが化学結合することを利用し、抗体上のＳＨ基が金粒子と接近するときにＳＨ結合が開裂してＡｕ表面上に生成するＡｕ－Ｓ結合で固定化させる等の化学的な結合方法が挙げられる。
＜不溶性担体＞
　上記不溶性担体は、上記抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化された反応部位（テストライン）を有する不溶性担体である。不溶性担体は、抗原の種類に合わせて複数のテストラインを有していてもよい（例えば、インフルエンザＡ型ウイルス用のテストラインとインフルエンザＢ型用のテストライン）。また、不溶性担体は、上記金粒子複合体の展開を確認するために、テストラインより下流側にコントロールラインを有していてもよい。また、後述する銀増幅工程において還元剤液を用いる場合には、還元剤液を検出するために、テストラインより下流側に発色試薬固定化ラインを有していてもよい。
　上記不溶性担体の具体的な態様としては、例えば、図１に示されるような、上流側から、金コロイド保持パッド１、テストライン２、コントロールライン３、発色試薬固定化ライン４を有するニトロセルロースメンブレン１００が挙げられる。ここで、金コロイド保持パッド１は第１の結合物質で修飾された金粒子（修飾金粒子）を保持するパッドであり、テストライン２は第２の結合物質が固定化されたラインであり、コントロールライン３は展開を確認するためのラインであり、発色試薬固定化ライン４は後述する還元剤液を検出するためのラインである。ここで上流側、下流側とは、金粒子複合体が展開する際、上流側から下流側に向けて展開することを意図した記載を意味する。
　上記不溶性担体（又はこれを有するイムノクロマトグラフキット）のより具体的な態様としては、例えば、特許第５７２８４５３号公報に記載の不溶性担体及びイムノクロマトグラフキットが挙げられ、不溶性担体及びイムノクロマトグラフキットに関する特許第５７２８４５３号公報に記載の内容はすべて本明細書の開示の一部として本明細書中に援用される。
（不溶性担体）
　不溶性担体は、多孔性担体が好ましい。特に、本発明の効果等がより優れる理由から、ニトロセルロース膜（ニトロセルロースメンブレン）、セルロース膜、アセチルセルロース膜、ポリスルホン膜、ポリエーテルスルホン膜、ナイロン膜、ガラス繊維、不織布、布、または糸等が好ましく、ニトロセルロース膜がより好ましい。
（第２の結合物質）
　第２の結合物質は上記抗原と結合し得るものであれば特に制限されない。
　第２の結合物質の具体例及び好適な態様は、上述した第１の結合物質と同じである。
　なお、上記第２の結合物質は上述した第１の結合物質と同じであっても異なってもよいが、本発明の効果等がより優れる理由から、異なる物質である態様が好ましい。
　また、第１の結合物質及び第２の結合物質が抗体である場合、第１の結合物質である抗体と第２の結合物質である抗体は、本発明の効果等がより優れる理由から、異なる態様が好ましい。
　また、第１の結合物質及び第２の結合物質が抗体である場合、第１の結合物質のエピトープ（第１の結合物質が認識する抗原の一部）と第２の結合物質のエピトープ（第２の結合物質が認識する抗原の一部）は、本発明の効果等がより優れる理由から、異なる態様が好ましい。抗体のエピトープが異なることは、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）によって確認することができる。
＜展開＞
　金粒子複合体を形成させた状態でテストラインを有する不溶性担体に展開する方法は特に制限されないが、例えば、上述した図１に示されるようなニトロセルロースメンブレン１００（又はこれを有するイムノクロマトグラフキット）を準備して、上述した濃縮工程で得られた抗原濃縮液を金コロイド保持パッドに滴下し、図１に示されるように上流側から下流側に毛細管現象を利用して移動させる方法等が挙げられる。
〔捕捉工程〕
　捕捉工程は、上記不溶性担体の反応部位において、上記金粒子複合体を捕捉する工程である。
　上述のとおり、不溶性担体の反応部位には抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化されているため、上記展開工程で不溶性担体に展開された金粒子複合体（抗原と修飾金粒子との複合体）は、不溶性担体の反応部位（テストライン）で捕捉される。
　なお、検体液が抗原を含まない場合には上記金粒子複合体が形成されないため、金粒子複合体は不溶性担体の反応部位で捕捉されない。
〔銀増幅工程〕
　銀増幅工程は、上記捕捉工程で捕捉された金粒子複合体を銀増幅する工程である。
　銀増幅工程は、上記捕捉工程後の不溶性担体に銀イオンを付与することで、不溶性担体の反応部位で捕捉された金粒子複合体に大きな銀粒子を形成する工程である。より詳細には、上記金粒子複合体の金粒子を触媒として銀イオンが還元され、銀粒子（例えば、直径１０μｍ以上）が形成される工程である。
　これにより、捕捉された金粒子複合体の検出感度が著しく向上する。
＜好適な態様＞
　上記捕捉工程後の不溶性担体に銀イオンを付与する方法は特に制限されないが、本発明の効果等がより優れる理由から、下記還元剤液及び下記銀増幅液を使用する方法が好ましい。
　また、還元剤液及び銀増幅液に加えて、特異的な結合反応以外で不溶性担体に残存している複合体を洗浄するために洗浄液を使用してもよい。上記還元液は洗浄液を兼ねていてもよい。
（還元剤液）
　上記還元剤液は、銀イオンを還元し得る還元剤を含有する。銀イオンを還元し得る還元剤は、銀イオンを銀に還元することができれば、無機・有機のいかなる材料、またはその混合物でも用いることができる。無機還元剤としては、Ｆｅ２＋、Ｖ２＋、Ｔｉ３＋、などの金属イオンで原子価の変化し得る還元性金属塩、還元性金属錯塩を好ましく挙げることができる。無機還元剤を用いる際には、酸化されたイオンを錯形成するか還元して、除去するか無害化する必要がある。例えば、Ｆｅ２＋を還元剤として用いる系では、クエン酸やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて酸化物であるＦｅ３＋の錯体を形成し、無害化することができる。本発明ではこのような無機還元剤を用いることが好ましい。本発明のより好ましい態様としては、Ｆｅ２＋の金属塩を還元剤として用いることが好ましい。
　なお、湿式のハロゲン化銀写真感光材料に用いられる現像主薬（例えばメチル没食子酸塩、ヒドロキノン、置換ヒドロキノン、３－ピラゾリドン類、ｐ－アミノフェノール類、ｐ－フェニレンジアミン類、ヒンダードフェノール類、アミドキシム類、アジン類、カテコール類、ピロガロール類、アスコルビン酸（またはその誘導体）、およびロイコ色素類）、および本分野での技術に熟練しているものにとって明らかなその他の材料、例えば米国特許第６，０２０，１１７号に記載されている材料も還元剤として用いることができる。
　還元剤としては、アスコルビン酸還元剤も好ましい。有用なアスコルビン酸還元剤は、アスコルビン酸とその類縁体、異性体とその誘導体を含み、例えば、Ｄ－またはＬ－アスコルビン酸とその糖誘導体（例えばγ－ラクトアスコルビン酸、グルコアスコルビン酸、フコアスコルビン酸、グルコヘプトアスコルビン酸、マルトアスコルビン酸）、アスコルビン酸のナトリウム塩、アスコルビン酸のカリウム塩、イソアスコルビン酸（又はＬ－エリスロアスコルビン酸）、その塩（例えばアルカリ金属塩、アンモニウム塩又は当技術分野において知られている塩）、エンジオールタイプのアスコルビン酸、エナミノールタイプのアスコルビン酸、チオエノ－ルタイプのアスコルビン酸等を好ましく挙げることができ、特にはＤ、ＬまたはＤ，Ｌ－アスコルビン酸（そして、そのアルカリ金属塩）若しくはイソアスコルビン酸（またはそのアルカリ金属塩）が好ましく、ナトリウム塩が好ましい塩である。必要に応じてこれらの還元剤の混合物を用いることができる。
　還元剤液は、本発明の効果等がより優れる理由から、展開工程における展開方向と還元剤液の展開方向との間の角度が０度～１５０度になるように流すのが好ましく、展開工程における展開方向と還元剤液の展開方向との間の角度が０度～１３５度になるように流すのがより好ましい。
　なお、展開工程における展開方向と還元剤液の展開方向との間の角度を調節する方法としては、例えば、特開２００９－１５０８６９号公報の実施例に記載の方法等が挙げられる。
（銀増幅液）
　上記銀増幅液は、銀イオンを含む化合物を含有する液である。銀イオンを含む化合物としては、例えば、有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体を用いることができる。好ましくは、水などの溶媒に対して溶解度の高い銀イオン含有化合物である、硝酸銀、酢酸銀、乳酸銀、酪酸銀、チオ硫酸銀などが挙げられる。特に好ましくは硝酸銀である。銀錯体としては、水酸基やスルホン基など水溶性基を有する配位子に配位された銀錯体が好ましく、ヒドロキシチオエーテル銀等が挙げられる。
　有機銀塩、無機銀塩、もしくは銀錯体は、銀として銀増幅液に０．００１ｍｏｌ／Ｌ～５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．００５ｍｏｌ／Ｌ～３ｍｏｌ／Ｌ、更には０．０１ｍｏｌ／Ｌ～１ｍｏｌ／Ｌの濃度で含有されることが好ましい。
　銀増幅液の助剤としては、緩衝剤、防腐剤、例えば酸化防止剤または有機安定剤、速度調節剤等が挙げられる。緩衝剤としては、例えば、酢酸、クエン酸、水酸化ナトリウムまたはこれらの塩のうちの一つ、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いた緩衝剤、その他一般的化学実験に用いられる緩衝剤を用いることができる。これら緩衝剤を適宜用いて、その増幅溶液に最適なｐＨに調整することができる。また、カブリ防止剤としてアルキルアミンを助剤として用いることができ、特に好ましくはドデシルアミンである。またこれら助剤の溶解性向上のため、界面活性剤を用いることができ、特に好ましくはＣ９Ｈ１９－Ｃ６Ｈ４－Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）５０Ｈである。
　銀増幅液は、本発明の効果等がより優れる理由から、上述した展開工程と逆方向から流すのが好ましく、展開工程における展開方向と還元剤液の展開方向との間の角度が４５度～１８０度になるように流すのがより好ましい。
　なお、展開工程における展開方向と銀増幅液の展開方向との間の角度を調節する方法としては、例えば、特開２００９－１５０８６９号公報の実施例に記載の方法等が挙げられる。
　また、銀増幅を短時間で行わせるために上部から不溶性担体上に滴下する供給態様も好ましい。
　以下、実施例により、本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［検体液の調製］
　健常人の尿検体（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社）をプールした尿検体に、結核菌より抽出されたリポアラビノマンナン（ＬＡＭ）（０２２４９－６１、ナカライテスク社）（抗原）を添加し、表１に記載のＬＡＭ濃度の検体液（抗原を含み得る液）を調製した。
［実施例１］
　以下のとおり、実施例１のイムノクロマトグラフィーを行った。
〔濃縮工程〕
　上述した検体液２ｍＬを限外濾過によって濃縮した。具体的には、メルク社製Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ限外濾過ユニット（限外濾過膜の分画分子量：３ｋＤａ、０．５ｍＬ）（限外濾過器具）に検体液の一部を入れて遠心分離し、その後、限外濾過器具の濾過後の残液（限外濾過器具の限外濾過膜を通っていない方）に残りの検体液の一部を入れてさらに遠心分離した。これを繰り返することで、上述した検体液２ｍＬ全てを限外濾過によって濃縮して、０．２ｍＬの残液（ＬＡＭ濃縮液）を得た。得られたＬＡＭ濃縮液について質量分析を行ったところ、ＬＡＭ濃度が１０倍に濃縮されていることが確認された。
〔展開工程〕
　図１に示されるように、上流側から、金コロイド保持パッド１、テストライン２、コントロールライン３、発色試薬固定化ライン４を有するニトロセルロースメンブレン１００を準備した。なお、金コロイド保持パッド１は、抗ＬＡＭモノクローナル抗体で修飾された金コロイド（修飾金粒子）を保持するパッドであり、テストライン２は、抗ＬＡＭモノクローナル抗体が固定化されたラインであり、コントロールライン３は、展開を確認するためのラインであり、発色試薬固定化ライン４は、後述する銀増幅工程の還元液を検出するためのラインである。
　上記ＬＡＭ濃縮液を金コロイド保持パッドに滴下した。これにより、液中のＬＡＭと抗ＬＡＭモノクローナル抗体で修飾された金コロイド粒子（修飾金粒子）との複合体である金粒子複合体が形成された。この状態で、上記ニトロセルロースメンブレンの上流側から下流側に向けて展開した。
〔捕捉工程〕
　展開工程で展開された金粒子複合体はテストラインで捕捉される。
〔銀増幅工程〕
　以下のとおり、銀増幅工程を実施した。
＜還元剤液の調製＞
　水２９０ｇに、硝酸鉄（ＩＩＩ）九水和物（富士フイルム和光純薬（株）社製）を水に溶解して作製した１ｍｏｌ／Ｌの硝酸鉄水溶液２３．６ｍＬ、及び、クエン酸（富士フイルム和光純薬（株）社製）１３．１ｇを溶解させた。全て溶解した後、スターラーで攪拌しながら硝酸（１０質量％）を３６ｍｌ加え、硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物（富士フイルム和光純薬（株）社製）を６０．８ｇ加え、これを還元剤液とした。
＜銀増幅液の調製＞
　水６６ｇに、硝酸銀溶液８ｍＬ（１０ｇの硝酸銀を含む）と１ｍｏｌ／Ｌの硝酸鉄水溶液２４ｍＬを加えた。さらに、この溶液と、硝酸（１０質量％）５．９ｍＬ、ドデシルアミン（富士フイルム和光純薬（株）社製）０．１ｇ、界面活性剤Ｃ１２Ｈ２５－Ｃ６Ｈ４－Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）５０Ｈ　０．１ｇをあらかじめ４７．６ｇの水に溶解した溶液を混合し、これを銀増幅液とした。
＜還元剤液の展開＞
　ニトロセルロースメンブレンにおいて、上述した展開工程と同じ方向から（より上流側から）、上述のとおり調製した還元剤液を流した。
＜銀増幅液の展開＞
　発色試薬固定化ラインが変色した後、展開工程における展開方向と逆方向から（下流側から）、上述のとおり調製した銀増幅液を流した。このようにして、テストラインで捕捉された金粒子複合体を銀増幅した。
〔評価〕
　テストラインの着色を目視により確認し、以下の基準で評価した。
　＋＋：明確に検出された。
　＋：うっすらと検出された。
　－：濃度上昇が検出されない。
　結果を表１に示す。＋＋又は＋と評価された検体液のＬＡＭ濃度のうち最も小さいＬＡＭ濃度（最小検出感度）が小さい程、検出感度が高いことを意味する。
［実施例２］
　濃縮工程において、メルク社製Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ限外濾過ユニット（限外濾過膜の分画分子量：３ｋＤａ、０．５ｍＬ）に代わりに、メルク社製Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ限外濾過ユニット（限外濾過膜の分画分子量：１０ｋＤａ、０．５ｍＬ）を用いた点以外は、上述した実施例１と同様の手順にしたがってイムノクロマトグラフィーを実施し、評価した。結果を表１に示す。
［実施例３］
　濃縮工程において、メルク社製Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ限外濾過ユニット（限外濾過膜の分画分子量：３ｋＤａ、０．５ｍＬ）に代わりに、メルク社製Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ限外濾過ユニット（限外濾過膜の分画分子量：１００ｋＤａ、０．５ｍＬ）を用いた点以外は、上述した実施例１と同様の手順にしたがって、イムノクロマトグラフィーを実施し、評価した。結果を表１に示す。
［比較例１］
　濃縮工程を行わずに、展開工程においてＬＡＭ濃縮液の代わりに上述した検体液自体を用いた点以外は、上述した実施例１と同様の手順にしたがって、イムノクロマトグラフィーを実施し、評価した。結果を表１に示す。
［比較例２］
　展開工程においてＬＡＭ濃縮液の代わりに下記ＬＡＭ濃縮液を用いた点以外は、上述した実施例１と同様の手順にしたがって、イムノクロマトグラフィーを実施し、評価した。結果を表１に示す。
〔比較例２で用いられたＬＡＭ濃縮液〕
　上述した検体液２ｍＬを凍結乾燥によって濃縮した。具体的には、上述した検体液２ｍＬを－８０℃で１０時間凍結させた後、小型凍結乾燥機ＦＤＳ－１０００（東京理科器械（株）社製）を用いて、２４時間凍結乾燥を行った。凍結乾燥後、ＬＡＭが含まれていない尿を０．２ｍＬ添加して、ＬＡＭ濃度が１０倍に濃縮されたＬＡＭ濃縮液を得た。なお、組成分析の結果、リン酸ナトリウム等の夾雑物が含まれていることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１から分かるように、濃縮を行わなかった比較例１、及び、凍結乾燥によって濃縮した比較例２と比較して、限外濾過によって濃縮した実施例１～３は、高い検出感度を示した。なかでも、限外濾過に用いられた限外濾過膜の分画分子量が１ｋＤａ～１０ｋＤａである実施例１～２は、より高い検出感度を示した。
　１　金コロイド保持パッド
　２　テストライン
　３　コントロールライン
　４　発色試薬固定化ライン
　１００　ニトロセルロースメンブレン

Claims (5)

  1. 　抗原を含み得る液を限外濾過によって濃縮して、抗原濃縮液を得る、濃縮工程と、
    　前記抗原濃縮液中の抗原と、前記抗原と結合し得る第１の結合物質で修飾された粒子である修飾粒子との複合体である粒子複合体を形成させた状態で、前記抗原と結合し得る第２の結合物質が固定化された反応部位を有する不溶性担体に展開する、展開工程と、
    　前記不溶性担体の反応部位において、前記粒子複合体を捕捉する、捕捉工程と、
    　前記捕捉工程で捕捉された粒子複合体の情報を増幅する、増幅工程と、
    を備える、イムノクロマトグラフィー。
  2. 　前記限外濾過に用いられる限外濾過膜の分画分子量が、１ｋＤａ～１０ｋＤａである、請求項１に記載のイムノクロマトグラフィー。
  3. 　前記濃縮工程が、限界濾過器具に前記抗原を含み得る液を入れて遠心分離する工程である、請求項１又は２に記載のイムノクロマトグラフィー。
  4. 　前記濃縮工程が、限界濾過器具に前記抗原を含み得る液の一部を入れて遠心分離し、その後、前記限界濾過器具の濾過後の残液に残りの前記抗原を含み得る液の一部を入れてさらに遠心分離し、これを繰り返す工程である、請求項１～３のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー。
  5. 　前記抗原を含み得る液が、尿である、請求項１～４のいずれか１項に記載のイムノクロマトグラフィー。
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