CN117233388A - 一种用于尿液中梅毒螺旋体抗体检测的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于尿液中梅毒螺旋体抗体检测技术领域，具体涉及一种用于尿液中梅毒螺旋体抗体检测的试剂盒及其制备方法。本发明在试剂盒中的试纸条上沿样品流动方向依次设置第一结合垫与第二结合垫，第一结合垫为包被有重组金黄色葡萄球菌蛋白A‑硅芯金壳胶体金标记物的玻璃纤维膜，第二结合垫为包被有阻断剂抗体‑硅芯金壳胶体金标记物的聚酯纤维膜。本发明以硅芯金壳大粒径胶体金替代传统胶体金，并在捕获抗原与被检抗体免疫反应的基础上再引入金标阻断剂抗体与SPA的反应产生二次信号，不仅能增强信号的强度，降低假阴性发生概率，而且引入的阻断剂也可特异性结合嗜异性抗体，减少假阳性的情况，增加了检测的特异性，使检测灵敏度提高2~5倍。
Description
技术领域
本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种尿液中梅毒螺旋体抗体检测的试剂盒及其制备方法。
背景技术
梅毒是由梅毒螺旋体感染所致的一种性传播慢性疾病，主要通过性接触直接传播，也可以通过接吻、手术、哺乳、输血、接触污染物等方式传播，一旦被传染可导致多系统多脏器的损伤。
目前，梅毒的实验室诊断方法主要有分子生物学诊断、病原学诊断和血清学诊断三大类，因前两种方法的实验条件要求高，仅限于科研单位和教学机构使用，所以血清学诊断是现阶段梅毒在临床上广泛使用的检测方法，比如，各大医院较常用的是RPR（快速血浆反应素环状卡片试验）和TPHA（梅毒螺旋体血球凝集试验）。其中，RPR是非特异性梅毒血清学试验，常用于早期诊断梅毒，但对潜伏期梅毒、神经梅毒不敏感；TPHA检测血清中特异性梅毒螺旋体抗体，有较高的敏感性和特异性。
事实上，梅毒的临床症状复杂，极易被漏诊和误诊，并且涉及到个人隐私的问题，若是能够提供一种简单、易测、灵敏度较高的梅毒自测试剂盒，则在一定程度上有利于人们对这一病毒的提前预防和限制传播。
一般来讲，感染梅毒螺旋体的人的皮损分泌物、血液中含大量梅毒螺旋体，因此，采用血液样本对梅毒螺旋体抗体的检测灵敏度相对较高，比如专利CN101825636A就提供了一种可用于全血、全血清、血浆及脑脊液等标本中的梅毒特异性IgM抗体和特异性抗体总抗体的检测试剂盒，但是，在实际自测过程中，血清取样繁琐、有创伤，且因为病毒含量较高导致血液取样的感染风险较大。
尿液中梅毒螺旋体抗体含量很低，若是能够将尿液用于梅毒螺旋体抗体的自测过程中，则能够极大地降低感染风险，但是，采用尿液作为检测样本检测梅毒螺旋体抗体时，试剂盒检测的灵敏度又难达到检测水平，因而，现阶段，关于尿液中梅毒螺旋体抗体检测的试剂盒很少。
经检索发现，专利CN111638331A提供了一种通过浓缩介质对尿液进行浓缩之后再将尿液用于梅毒螺旋体抗体的检测，但是该专利忽略了一个问题，即采用浓缩介质虽然可以对尿液进行浓缩，使得尿液中可能存在的梅毒螺旋体抗体的浓度提高，从而有利于提高检测信号的强度，但是其对尿液进行浓缩的同时，尿液中所含有的其他大分子蛋白等杂质成分也会被同步浓缩，而这些蛋白的含量远高于梅毒螺旋体病毒极易对梅毒螺旋体病毒产生一定的荫蔽效应和干扰效应，导致假阴性和假阳性，从而使得检测的准确性受到影响，况且通过介质浓缩增加了检测操作的难度，提高梅毒螺旋体浓度的同时也提高了梅毒感染的可能性。
此外，对于梅毒螺旋体抗体检测的试剂盒大都是用于血液样本的检测，不适用于自测，参考性并不强。
当然，现有技术中提高胶体金检测灵敏度的方法众多，比如调节胶体金粒径大小、加入信号增强试剂、添加拉曼探针等等，如以下的专利中所披露的：
专利CN116539886A通过利用“生物素-链霉亲和素放大系统”来提高检测的灵敏度，但是该技术是用于检测血清、血浆和/或全血样本，并且生物素链霉亲和素放大系统应用于梅螺旋体的检测时具有试剂盒的制作过程极为繁琐、原料的成本高以及不能实现对假阳性的消减等缺点。
此外，专利CN115792213、CN116087512A等均通过调整胶体金的粒径大小来提高检测的灵敏度，但是由于其检测对象均为一些常见病毒，这些病毒在体内的含量相对较高，因此调整后胶体金粒径后的检测灵敏度有所提高，但是对于梅毒螺旋体抗体而言，其在人体尿液中的含量远远低于普通流感病毒，因而，仅通过调整胶体金的粒径大小对于尿液中梅毒抗体的检测灵敏度的改善还是不够的。
当然，为了进一步提高试剂盒的检测灵敏度，不少研究开始对胶体金进行改性，因二氧化硅-胶体金复合微球的制备工艺极为复杂，难以用于工业化生产，比如专利CN115837255A、CN113533231A中均是采用了较为复杂的方法制备出纳米胶体金-二氧化硅复合微球，即先对二氧化硅、胶体金微粒表面进行修饰之后，再通过偶联剂使得二氧化硅与胶体金微粒之间通过化学键进行偶联，得到纳米胶体金-二氧化硅复合微球，制备工艺极为繁琐。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种尿液中梅毒螺旋体抗体检测的试剂盒及其制备方法。
本发明的目的之一是：提供一种用于尿液中梅毒螺旋体抗体检测的试剂盒。
所述的试剂盒包括检测试纸条，所述的检测试纸条上依次设置有样品垫、结合垫、包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜以及吸水纸。
需要说明的是，以上的试纸条结构比较常规，不再赘述，本申请的创新在于对结合垫进行改进。
本发明中所述的结合垫，包括第一结合垫与第二结合垫，第一结合垫的一端搭接样品垫，另一端搭接在第二结合垫上且搭接长度为1.5~2 mm，第一结合垫为包被有重组金黄色葡萄球菌蛋白A-硅芯金壳胶体金标记物的玻璃纤维膜，第二结合垫为包被有阻断剂抗体-硅芯金壳胶体金标记物的聚酯纤维膜，检测线上包被有梅毒螺旋体重组抗原，质控线上包被有兔抗重组金黄色葡萄球菌蛋白A抗体，所述的阻断剂为鼠抗兔IgG。
本发明在试纸条上设置两种结合垫，即第一结合垫与第二结合垫，且在第一结合垫上包被重组金黄色葡萄球菌蛋白A-硅芯金壳胶体金标记物，第二结合垫上包被阻断剂抗体-硅芯金壳胶体金标记物，极大地提高了梅毒螺旋体抗体的检测灵敏度以及准确性，主要的原理在于：
一方面，当尿液中含有的梅毒螺旋体抗体经样品垫到达第一结合垫时，该梅毒抗体首先会与第一结合垫中的重组金黄色葡萄球菌蛋白A-硅芯金壳胶体金标记物结合，形成梅毒螺旋体抗体-SPA-Au复合物，并在毛细作用下移动至检测线，在检测线上梅毒抗体-SPA-Au复合物被梅毒螺旋体重组抗原捕获产生第一次信号聚集；并且，由于第二结合垫采用致密的聚酯纤维膜作为固相载体，其在释放结合垫上包被的阻断剂抗体-硅芯金壳标记物时会滞后于第一结合垫，因此，随后而来的阻断剂抗体-硅芯金壳标记物会与在检测线上被捕获的梅毒抗体-SPA-Au复合物发生结合，从而反应产生二次信号，这一操作实现了对梅毒螺旋体抗体检测信号的强化，避免了假阴性的情况发生，在一定程度上提高了检测的灵敏度。
另一方面，尿液中携带的其他可能引起交叉反应的抗体在第二结合垫上也会与阻断剂反应，从而能够避免这些干扰抗体与捕获抗原的结合，因此，第二结合垫上阻断剂的引入同时也有利于减少嗜异性抗体引起的假阳性情况的发生。
除此之外，本发明中还采用硅芯金壳胶体金来替代传统的胶体金作为标记物，相对于传统的实心胶体金标记物而言，硅芯金壳胶体金的粒径更大，在同等程度下，标记物的信号的强度更大，并且硅芯的存在有利于减小金颗粒的密度，从而使硅芯金壳胶体金相较于同粒径的胶体金具有较小的质量，可自由灵活地通过毛细作用向前层析。
本发明的目的之二是：提供了一种硅芯金壳胶体金溶液的制备方法。
所述的硅芯金壳胶体金溶液，采用以下的方式制备：
快速搅拌下，将质量分数为8~10%的醋酸溶液加入到质量分数为2.5~5%的硅酸钠溶液中，直到溶液由透明清液变为白色浊液，停止搅拌，获得90±10nm粒径的二氧化硅胶体，硅酸钠溶液与醋酸溶液的质量比为2.84：1.2~3.6；然后先于1500~3000 rpm下低速离心，弃除大颗粒沉淀，再于8000~12000 rpm下高速离心，弃去上清液，得到二氧化硅胶体沉淀，将二氧化硅胶体沉淀用去离子水洗至中性，然后加入去离子水，超声分散均匀，在硅胶溶液中加入质量分数为0.8~1.5%的氯金酸使其在溶液的最终质量分数为0.01%，在磁力搅拌器上加热到155~160℃，并于930~950 rpm的转速下加入质量分数为0.5~1.5%的柠檬酸三钠溶液，持续保温10~15min，在二氧化硅胶核上生成金壳，制备成130~180 nm的硅芯金壳胶体金溶液。
优选的，醋酸溶液的质量分数为10%，硅酸钠溶液的质量分数为3%。
优选的，硅芯金壳胶体金的粒径为150 nm。
本发明人研究发现，硅芯金壳胶体金的粒径能够直接影响试剂盒对于尿液中梅毒螺旋体病毒检测的灵敏性与准确性。当硅芯金壳胶体金的粒径较大时，约大于180 nm时，胶体金的粒径、体积、质量均较大，层析速率极慢，难以实现正常的检测过程；此外，若是其粒径过小，硅芯外层包被的金层较薄，用于检测时的信号强度会受到影响，导致灵敏性减弱。
本发明的目的之三是：提供了一种上述结合垫的制备方法。
所述的第一结合垫与第二结合垫，通过以下的步骤制备获得：
步骤S1，采用上述的方法制备硅芯金壳胶体金溶液；
步骤S2，制备硅芯金壳标记物：向步骤S1中制备的硅芯金壳胶体金溶液中加入15~50 μL 0.2M的K2CO3溶液，混匀，然后分别将重组金黄色葡萄球菌蛋白A、阻断剂抗体加入到混合溶液中，缓慢搅拌20~30min，再加入质量分数为8~10%的牛血清白蛋白溶液缓慢搅拌20~30min，离心去除未标记的蛋白，分别获得重组金黄色葡萄球菌蛋白A-硅芯金壳胶体金标记物、阻断剂抗体-硅芯金壳胶体金标记物；
步骤S3，制备第一结合垫与第二结合垫：将玻璃纤维膜浸泡于步骤S2中制备的重组金黄色葡萄球菌蛋白A-硅芯金壳胶体金标记物中10~30 min，取出并干燥，制得第一结合垫；将聚酯纤维膜浸泡于步骤S2中制备的阻断剂抗体-硅芯金壳胶体金标记物中10~30min，取出并干燥，制得第二结合垫。
优选的，步骤S2中重组金黄色葡萄球菌蛋白A与硅芯金壳胶体金溶液的质量体积比为8~10 μg：1 mL，阻断剂与硅芯金壳胶体金溶液的质量体积比为8~10 μg：1 mL，牛血清白蛋白溶液与硅芯金壳胶体金溶液的体积比为0.08~0.12：5。
优选的，步骤S2中硅芯金壳胶体金标记物的制备，具体操作如下：取5mL步骤S1中制备的硅芯金壳胶体金溶液，加入15~50 μL 0.2M的K2CO3溶液混匀，分别将50μg重组金黄色葡萄球菌蛋白A、阻断剂抗体加入到硅芯金壳胶体金溶液中，缓慢搅拌30min，再加入100ug酪蛋白，缓慢搅拌30min，5000 rpm离心，弃上清，沉淀加入适量免疫金复溶液4℃保存备用。
优选的，步骤S3中于35~38℃，真空度0.06~0.08 MPa下，对结合垫干燥18~20h。
本发明的目的之四在于：提供了一种用于尿液中梅毒螺旋抗体检测的试剂盒的制备方法，具体包括以下的步骤：
（1）第一结合垫与第二结合垫的制备：
先制备出硅芯金壳胶体金溶液，然后分别将重组金黄色葡萄球菌蛋白A、阻断剂抗体加入到硅芯金壳胶体金溶液中获得相应的标记物，并分别包被于第一、第二结合垫上，制备出第一、第二结合垫；
（2）样品垫的制备：配制50~100mM，PH=8.0的K2CO3-HAC缓冲液，以缓冲液的质量计，在缓冲液中添加0.6~2%的聚乙二醇，0.1~1.5%的吐温-20，1.0~3.0%的牛血清白蛋白配制成样品垫处理液，用样品垫处理液浸泡玻璃纤维膜10~30min后，取出玻璃纤维膜，沥干溶液，直到没有溶液滴出，于35~38℃，真空度0.05~0.08 MPa下，对样品垫干燥18~20h；
（3）TP重组抗原与兔抗SPA抗体包被：分别将梅毒螺旋体重组抗原、兔抗SPA抗体分别溶解于混合溶液中配制成0.5~0.9 mg/mL检测线、质控线包被液，用划膜仪在硝酸纤维素膜上以1 μL/cm喷量进行划线，将检测线、质控线包被于硝酸纤维素膜上，其中，所述的混合溶液为15mM的pH 7.0~8.0磷酸盐缓冲液与质量分数为2%的海藻糖稀释液的混合液；
（4）试剂盒的制备：将样品垫、第一结合垫和第二结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次固定在PVC底板上，并组装成试剂盒。
此外，采用本发明的方法所制备的试剂盒对尿液中梅毒螺旋体抗体检测的灵敏度很高，即在对尿液中含量较低的梅毒螺旋体病毒成分进行检测时，可通过采用硅芯金壳胶体金溶液+二次信号放大的方式来实现检测灵敏度的提高，这也为本领域技术人员提供了一种提高体液中病毒检测试剂盒灵敏度方法的技术参考。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明的梅毒螺旋体抗体检测试剂盒以尿液为检测样本，和血清相比，具有取样无创、方便、安全、易得的优势；
（2）本发明提供了一种硅芯金壳胶体金以及其制备方法，所制备的硅芯金壳胶体金在具有较大的粒径的同时还具有较小的质量，用于免疫层析中能够呈现出较适宜的移动速度，粒径的增大有利于增强显示信号的强度，此外硅芯金壳胶体金的制备方法简单，成本低，易于实现工业化生产；
（3）本发明通过引入硅芯金壳胶体金并设置两种结合垫，并且分别在第一结合垫上包被重组金黄色葡萄球菌蛋白A-硅芯金壳胶体金标记物，第二结合垫包被阻断剂抗体-硅芯金壳胶体金标记物，不仅有利于实现对梅毒螺旋体抗体检测信号的强化，避免假阴性情况的发生，而且第二结合垫上包被的阻断剂也能够阻断尿液中携带的其他可能引起交叉反应的抗体，有利于减少嗜异性抗体引起的假阳性情况的发生，可使检测的灵敏度提高2~5倍，有效解决了尿液中梅毒抗体含量低，一般试剂无法有效检出或者准确率低的难题；
（4）本发明所采用的第一结合垫材料为玻璃纤维膜，第二结合垫的材料为聚酯纤维膜，两种材料的差异，使得第一结合垫与第二结合垫释放免疫金的速度产生差异，恰好适应了第一信号和第二信号反应的时间差。
附图说明
图1为本发明实施例1中设置有两种结合垫的试纸条结构示意图；
图1中，1-样品垫，2-第一结合垫，3-第二结合垫，4-硝酸纤维素膜，5-检测线，6-质控线，7-吸水纸，8-PVC板；
图2为本发明实施例1中试剂盒的检测结果情况；
图3为本发明实施例2中试剂盒的检测结果情况；
图4为本发明实施例3中试剂盒的检测结果情况；
图5为本发明对比例1中试剂盒的检测结果情况。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。
实施例1
（1）第一结合垫与第二结合垫的制备
步骤S1，制备硅芯金壳胶体金溶液：配制质量分数为3%的硅酸钠溶液和质量分数为10%的醋酸溶液，在快速搅拌的条件下，将醋酸溶液快速入硅酸钠溶液中，直至溶液由透明清液变为白色浊液，得到约90nm粒径的二氧化硅胶体，硅酸钠和醋酸的质量比为2.84：1.8；然后于1500 rpm下低速离心，弃除大颗粒沉淀，再于8000rpm下高速离心，弃去上清液，得到二氧化硅胶体沉淀，将二氧化硅胶体沉淀用去离子水洗至中性，然后加去离子水恢复到原来的体积，超声分散均匀，然后在硅胶溶液中加入质量分数为1%的氯金酸溶液使胶体溶液最终的质量分数为0.01%，在磁力搅拌器上加热到158℃，并于950rpm下滴入质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液，持续保温10~15min，在二氧化硅胶核上生成金壳，制备成约150nm的硅芯金壳胶体金；
步骤S2，制备硅芯金壳标记物：取5mL步骤S1中制备的硅芯金壳胶体金溶液，加入15μL 0.2M的K2CO3溶液，混匀，再加入50μg重组金黄色葡萄球菌蛋白A，缓慢搅拌30min，再加入100μg酪蛋白，缓慢搅拌30min，5000 rpm离心，弃上清，沉淀加入适量免疫金复溶液，获得重组金黄色葡萄球菌蛋白A-硅芯金壳胶体金标记物，4℃保存备用；
另外，取5mL步骤S1中制备的硅芯金壳胶体金溶液，加入50μL 0.2M的K2CO3溶液，混匀，再加入50μg阻断剂抗体，缓慢搅拌30min，再加入100μg酪蛋白，缓慢搅拌30min，5000rpm离心，弃上清，沉淀加入适量免疫金复溶液，获得阻断剂抗体-硅芯金壳胶体金标记物，4℃保存备用；
步骤S3，制备结合垫：用步骤S2中制备的重组金黄色葡萄球菌蛋白A-硅芯金壳胶体金标记物浸泡玻璃纤维膜10 min，然后于37℃，真空度0.08MPa下，干燥20 h，制得第一结合垫；将步骤S2中制备的阻断剂抗体-硅芯金壳胶体金标记物浸泡聚酯纤维膜10 min，然后于37℃，真空度0.08MMPa，干燥20h，制得第二结合垫；
（2）样品垫的制备：配制80mM，pH=8.5的K2CO3-HAC缓冲液，以缓冲液的质量计，缓冲液内含1.5%的PEG，1%的吐温-20，2%的牛血清白蛋白样品垫处理液，用样品垫处理液浸泡玻璃纤维膜10min，捞出玻璃纤维膜，沥干溶液，直到没有溶液滴出，37℃，真空度0.08MPa，干燥18h；
（3）TP重组抗原和兔抗SPA包被：分别将梅毒螺旋体重组抗原、兔抗SPA抗体溶解于混合溶液中配制成0.5 mg/mL检测线、质控线包被液，用划膜仪在硝酸纤维素膜上以1 μL/cm喷量进行划线，将检测线、质控线包被于硝酸纤维素膜上，其中，所述的包被液为15mM的pH 7.0的磷酸盐缓冲液与质量分数为2%的海藻糖稀释液的混合溶液；
（4）将制备好的硝酸纤维素膜、胶体金垫、样品垫及吸水纸分别粘附在PVC大板上，切条后以铝箔袋内加入适量干燥剂包装。
本实施例所制备的试剂盒中具有两种结合垫的试纸条结构示意图如附图1所示，图1中：1-样品垫，2-第一结合垫，3-第二结合垫，4-硝酸纤维素膜，5-检测线，6-质控线，7-吸水纸，8-PVC板。
图1的试纸条结构显示，本发明中所制备的试纸条中，各结构的连接顺序，按照样品的流动方向来看，依次设置为：样品垫、第一结合垫、第二结合垫、硝酸纤维素膜（膜上依次设置有检测线、质控线）、吸水纸。
实施例2
与实施例1不同的是，硅芯金壳胶体金溶液的制备，其余操作均同实施例1。
本实施例中硅芯金壳胶体金溶液的具体制备操作如下：
配制质量分数为5%的硅酸钠溶液和质量分数为10%的醋酸溶液，在搅拌条件下，将醋酸钠溶液加入硅酸钠溶液中，直至溶液由透明清液变为白色浊液，制出约80 nm粒径的二氧化硅胶体，硅酸钠溶液与醋酸溶液的质量比为2.84：2.9；然后先于3000rpm下低速离心，弃除大颗粒沉淀，再于10000rpm下高速离心，弃去上清液，得到二氧化硅胶体沉淀，将二氧化硅胶体沉淀用去离子水洗至中性，然后加去离子水恢复到原来的体积，超声分散均匀，然后在硅胶溶液中加入质量分数为0.8%的氯金酸溶液使硅胶溶液的最终质量分数为0.01%，在磁力搅拌器上加热到158℃，并于930rpm下快速滴入质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液，持续保温10min，在二氧化硅胶核上生成金壳，制备成约130nm的硅芯金壳胶体金。
实施例3
与实施例1不同的是，硅芯金壳胶体金溶液的制备，其余操作均同实施例1。
本实施例中硅芯金壳胶体金溶液的具体制备操作如下：
步骤S1，制备硅芯金壳胶体金溶液：配制质量分数为2.5%的硅酸钠溶液和质量分数为8%的醋酸溶液，搅拌条件下，将醋酸溶液加入硅酸钠溶液中，直至溶液由透明清液变为白色浊液，得约100 nm粒径的二氧化硅胶体，硅酸钠溶液与醋酸溶液的质量比为2.84：1.2；然后先于2000rpm下低速离心，弃除大颗粒沉淀，再于80000rpm下高速离心，弃去上清液，得到二氧化硅胶体沉淀，将二氧化硅胶体沉淀用去离子水洗至中性，然后加去离子水恢复到原来的体积，超声分散均匀，然后在硅胶溶液中加入质量分数为1%的浓度氯金酸溶液使硅胶溶液的最终质量分数为0.01%，在磁力搅拌器上加热到160℃，并于950rpm下滴入1%的柠檬酸三钠溶液，持续保温15 min，在二氧化硅胶核上生成金壳，制备成约180nm的硅芯金壳胶体金。
对比例1
本对比例中试剂盒的制备步骤（2）~（4）均同实施例1，与实施例1不同的是，本对比例中仅设置一种结合垫，其余步骤及操作均同实施例1。
本对比例中结合垫的制备方法如下：
按照实施例1中的方法制备出重组金黄色葡萄球菌蛋白A-硅芯金壳胶体金标记物，然后用重组金黄色葡萄球菌蛋白A-硅芯金壳胶体金标记物浸泡玻璃纤维膜10 min，于37℃，真空度0.08 MPa下，干燥18~20 h，制得结合垫。
对比例2
本对比例中试剂盒的制备步骤（2）~（4）均同实施例1，与实施例1不同的是，步骤（1）中采用传统的方式制备胶体金溶液替代硅芯金壳胶体金，结合垫的具体制备方法如下：
步骤S1，胶体金的制备：配制质量分数为1%的氯金酸溶液，于158℃，磁力搅拌器950rpm的转速下快速加入适当质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液持续保温10~15min，制备成50nm左右的胶体金溶液；
步骤S2，重组金黄色葡萄球菌蛋白A标记物的制备：取5mL步骤S1中制备的胶体金溶液，加入50μL 0.2M的K2CO3溶液混匀，加入60μg重组金黄色葡萄球菌蛋白A，缓慢搅拌30min，再加入100μg酪蛋白，缓慢搅拌30min，8000 rpm下离心，弃去上清液，沉淀加入适量免疫金复溶液4℃保存备用；
阻断剂抗体-胶体金标记物的制备：取5 mL步骤S1中制备的胶体金，加入50 μL0.2M的K2CO3溶液混匀，加入60 μg阻断剂抗体，缓慢搅拌30min：再加入100μg酪蛋白，缓慢搅拌30 min，5000rpm离心，弃上清，沉淀加入适量免疫金复溶液4℃保存备用；
步骤S3，将重组金黄色葡萄球菌蛋白A-胶体金标记物浸泡玻璃纤维膜10 min，然后于37℃，真空度0.08MPa下，干燥20h，制得第一结合垫；将步骤S2中制备的阻断剂抗体-胶体金标记物浸泡聚酯纤维膜10 min，然后于37℃，真空度0.08MPa，干燥18~20h，制得第二结合垫。
其余的步骤及操作均同实施例1。
对比例3
本对比例与对比例2不同的是结合垫的制备，即步骤（1）中仅设置一种结合垫，结合垫的具体制备方法如下：
按照对比例2中的方法制备获得重组金黄色葡萄球菌蛋白A-胶体金标记物，然后将重组金黄色葡萄球菌蛋白A-胶体金标记物浸泡玻璃纤维膜10 min，然后于37℃，真空度0.08MPa下，干燥20h，制得结合垫。
试验例1
配制系列梯度梅毒螺旋体抗体标准溶液，并将抗体溶液稀释，稀释梯度分别为原抗体溶液的1/5000、1/10000、1/15000、1/20000、1/25000、1/30000、1/35000、1/40000、0（未加抗体），分别取60 μL上述各梯度的梅毒螺旋体抗体标准溶液，将其滴加于上述实施例及对比例所制备试剂盒的加样孔中，15 min后，观察实验结果。
实施例1~3以及对比例1~3中检测结果对照统计表见表1。
另外，实施例1~3所制备的试剂盒用于尿液中梅毒螺旋体抗体检测的结果情况分别见附图2~4，对比例1的检测结果见附图5，附图2~5中，自左向右的试剂盒所检测的梅毒螺旋体抗体标准溶液稀释倍数逐渐增大。
表1 各实施例及对比例试剂盒的检测结果情况
| 样本 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 |
| 0 | - | - | - | - | - | - |
| 1/5000 | + | + | + | + | + | + |
| 1/10000 | + | + | + | + | + | + |
| 1/15000 | + | + | + | + | + | +- |
| 1/20000 | + | + | + | + | + | - |
| 1/25000 | + | + | + | + | + | - |
| 1/30000 | + | + | + | +- | +- | - |
| 1/35000 | + | +- | + | - | - | - |
| 1/40000 | +- | - | - | - | - | - |
表1中，“+”表示较强的信号，“+-”表示较弱信号，“-”表示没有信号。
结合附图2中显示，随着梅毒螺旋体抗体标准溶液的稀释倍数的增大，实施例1中的方法制备的试剂盒中检测线的信号强度逐渐降低，即便如此，在将梅毒螺旋体抗体标准液稀释至1/35000时，在照片中仍能够肉眼清晰识别出检测线上的信号，当将梅毒螺旋体抗体标准液稀释至1/40000时，检测信号的强度不再明显，但依旧能够隐约识别出检测限的痕迹，即在此浓度的条件下，试剂盒表现出极弱的信号强度。
另外，从附图3结合表1中的信号强度结果可以看出，实施例2中，将硅芯金壳胶体金的粒径调整为130 nm左右时，梅毒螺旋体抗体标准液稀释至1/35000时，已经呈现出了较弱的信号强度，这可能是由于硅芯金壳胶体金的粒径减小之后，硅芯的外层所包被的金层较薄，使得检测时胶体金的富集量少，导致灵敏度降低。
此外，附图4中显示，实施例3中虽然具有同实施例1中相同的检测信号灵敏度，但是检测过程中，胶体金的跑板速度很慢，15 min后背景颜色较深，30 min后结合垫上仍然有金标物残留，可见粒径较大的硅芯金壳胶体金虽然确实有利于灵敏度的提高，但是检测速率大大降低，并且也在一定程度上提高了检测的成本。
附图5中为本发明的对比例1中，仅采用了一种结合垫所制备出的试剂盒对于不同浓度梯度梅毒螺旋体抗体的检测情况，从附图5中可以看出，当梅毒螺旋体抗体标准液稀释至1/25000时，检测信号的强度还是肉眼可见的，但是当梅毒螺旋体抗体标准液稀释至1/30000时，检测信号的强度几乎是难以识别的，即已经表现出了极弱的信号强度，可见其检测的灵敏度远低于实施例1中制备的试剂盒。
通过上述的实施例1~3以及对比例1可以看出，本发明中采用两种结合垫的结构设置有利于在原有的基础上再一次放大信号，实现信号的二次强化，即当含量较低的梅毒螺旋体抗体与第一结合垫中的重组金黄色葡萄球菌蛋白A-硅芯金壳胶体金标记物结合形成的梅毒螺旋体抗体-SPA-Au复合物在检测线上被捕获产生第一次信号聚集的基础上，第二结合垫释放的阻断剂抗体-硅芯金壳标记物再次与在检测线上被捕获的梅毒抗体-SPA-Au复合物发生结合，从而反应产生二次信号，这一操作实现了对梅毒螺旋体抗体检测信号的强化，有利于避免假阴性的情况发生，同时也提高了检测的灵敏度，降低了梅毒螺旋体抗体的检测限。
另外，对比例2~3中均采用传统的方法制备胶体金，并将其制成试剂盒，从表1中的检测结果中看来，对比例2、对比例3中试剂盒的灵敏度远低于实施例1中的试剂盒，特别是对比例3中，采用一种结合垫，在抗体稀释浓度为1/15000时，检测信号的强度已并不明显，而当稀释倍数进一步增大时，该试剂盒根本无法再实现检测了，可见采用传统的胶体金作为检测标记物，且没有二次信号强化的试剂盒，其检测信号的灵敏度远不如本发明中采用硅芯金壳胶体金溶液制备的试剂盒的灵敏度高。
Claims (7)
1.一种用于尿液中梅毒螺旋体抗体检测的试剂盒，所述的试剂盒包括检测试纸条，所述检测试纸条上依次设置有样品垫、结合垫、包被检测线和质控线的硝酸纤维素膜以及吸水纸，其特征在于，所述的结合垫包括第一结合垫与第二结合垫；第一结合垫的一端搭接样品垫，另一端搭接在第二结合垫上且搭接长度为1.5~2 mm，第一结合垫为包被有重组金黄色葡萄球菌蛋白A-硅芯金壳胶体金标记物的玻璃纤维膜，第二结合垫为包被有阻断剂-硅芯金壳胶体金标记物的聚酯纤维膜，检测线上包被有梅毒螺旋体重组抗原，质控线上包被有兔抗重组金黄色葡萄球菌蛋白A抗体，所述的阻断剂为鼠抗兔IgG。
2.如权利要求1所述的一种用于尿液中梅毒螺旋体抗体检测的试剂盒，其特征在于，所述的第一结合垫与第二结合垫通过以下的方法制备获得：
步骤S1，制备硅芯金壳胶体金溶液；
步骤S2，制备硅芯金壳标记物：向步骤S1中制备的硅芯金壳胶体金溶液中加入15~50 μL 0.2M的K2CO3溶液，混匀，然后分别将重组金黄色葡萄球菌蛋白A、阻断剂加入到混合溶液中，缓慢搅拌20~30min，再加入质量分数为8~10%的牛血清白蛋白溶液缓慢搅拌20~30min，离心去除未标记的蛋白，分别获得重组金黄色葡萄球菌蛋白A-硅芯金壳胶体金标记物、阻断剂-硅芯金壳胶体金标记物；
步骤S3，制备第一结合垫与第二结合垫：将玻璃纤维膜浸泡于步骤S2中制备的重组金黄色葡萄球菌蛋白A-硅芯金壳胶体金标记物中10~30 min，取出并干燥，制得第一结合垫；将聚酯纤维膜浸泡于步骤S2中制备的阻断剂抗体-硅芯金壳胶体金标记物中10~30 min，取出并干燥，制得第二结合垫。
3.如权利要求2所述的一种用于尿液中梅毒螺旋体抗体检测的试剂盒，其特征在于，步骤S1中，硅芯金壳胶体金溶液的制备方法如下：
快速搅拌下，将质量分数为8~10%的醋酸溶液加入到质量分数为2.5~5%的硅酸钠溶液中，直至溶液由透明清液变为白色浊液，停止搅拌，获得90±10nm粒径的二氧化硅胶体，硅酸钠溶液与醋酸溶液的质量比为2.84：1.2~3.6；然后先于1500~3000 rpm下低速离心，弃除大颗粒沉淀，再于8000~12000 rpm下高速离心，弃去上清液，得到二氧化硅胶体沉淀，将二氧化硅胶体沉淀用去离子水洗至中性，然后加入去离子水，超声分散均匀，在硅胶溶液中加入质量分数为0.8~1.5%的氯金酸使硅胶溶液最终的质量分数为0.01%，在磁力搅拌器上加热到155~160℃，并于930~950 rpm的转速下加入质量分数为0.5~1.5%的柠檬酸三钠溶液，持续保温10~15min，在二氧化硅胶核上生成金壳，制备成130~180 nm的硅芯金壳胶体金溶液。
4.如权利要求2所述的一种用于尿液中梅毒螺旋体抗体检测的试剂盒，其特征在于，步骤S2中，重组金黄色葡萄球菌蛋白A与硅芯金壳胶体金溶液的质量体积比为8~10 μg：1 mL，阻断剂与硅芯金壳胶体金溶液的质量体积比为8~10 μg：1 mL，牛血清白蛋白溶液与硅芯金壳胶体金溶液的体积比为0.08~0.12：5。
5.如权利要求2所述的一种用于尿液中梅毒螺旋体抗体检测的试剂盒，其特征在于，步骤S3中于35~38℃，真空度0.06~0.08MPa下，对结合垫干燥18~20h。
6.如权利要求1所述的一种用于尿液中梅毒螺旋体抗体检测的试剂盒，其特征在于，所述样品垫的制备方法如下：配制50~100mM，pH=8.0的K2CO3-HAC缓冲液，以缓冲液的质量计，在缓冲液中添加0.6~2%的聚乙二醇，0.1~1.5%的吐温-20，1.0~3.0%的牛血清白蛋白配制成样品垫处理液，用样品垫处理液浸泡玻璃纤维膜10~30min后，取出玻璃纤维膜，沥干溶液，直到没有溶液滴出，于35~38℃，真空度0.05~0.08MPa下，对样品垫干燥18~20h。
7.一种用于尿液中梅毒螺旋体抗体检测的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下的步骤：
（1）第一、第二结合垫的制备：先制备出硅芯金壳胶体金溶液，然后分别将重组金黄色葡萄球菌蛋白A、阻断剂抗体加入硅芯金壳胶体金溶液中获得相应的标记物，并将重组金黄色葡萄球菌蛋白A标记物包被于第一结合垫上，将阻断剂抗体-硅芯金壳胶体金标记物包被于第二结合垫上，制备出第一、第二结合垫；
（2）样品垫的制备：配制50~100mM，pH=8.0的K2CO3-HAC缓冲液，以缓冲液的质量计，在缓冲液中添加0.6~2%的聚乙二醇，0.1~1.5%的吐温-20，1.0~3.0%的牛血清白蛋白配制成样品垫处理液，用样品垫处理液浸泡玻璃纤维膜10~30min后，取出玻璃纤维膜，沥干溶液，直到没有溶液滴出，于35~38℃，真空度0.05~0.08MPa下，对样品垫干燥18~20h；
（3）TP重组抗原和兔抗SPA抗体包被：分别将梅毒螺旋体重组抗原、兔抗SPA抗体溶解于混合溶液中配制成0.5~0.9 mg/mL检测线、质控线包被液，用划膜仪在硝酸纤维素膜上以1μL/cm喷量进行划线，将检测线、质控线包被于硝酸纤维素膜上，其中，所述的混合溶液为15mM的pH 7.0~8.0磷酸盐缓冲液与质量分数为2%的海藻糖稀释液的混合液；
（4）试剂盒的制备：将样品垫、第一结合垫和第二结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次固定在PVC底板上，并组装成试剂盒。
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