CN102778559A - 胶体金免疫层析检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胶体金免疫层析检测试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括具有盒底和盒盖的盒体，盒底包括试纸条，所述试纸条由样品垫、胶体金颗粒标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，还包括设置在所述盒体的盒盖内表面的加强液垫，当合上盒盖时，所述加强液垫位于所述胶体金颗粒标记垫和硝酸纤维素膜之间。本发明的胶体金免疫层析试纸盒采用加强液垫，无需对试纸条进行洗涤而完成对检测信号的加强，简化了加强步骤，缩短了加强所需时间，有效避免因胶体金标记垫中残留的金颗粒的影响而导致加强之后产生的假阳、背景差等现象，明显提高胶体金免疫层析检测大分子的灵敏度。

Description

胶体金免疫层析检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于医学检验领域，特别是涉及一种胶体金免疫层析检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

20世纪70年代，Faulk和Taylor首次将胶体金作为示踪物用于免疫电镜检测技术，后来该技术发展成了多种分析方法，如免疫渗滤试验和免疫层析试验等。胶体金免疫层析技术已经成为快速诊断的一个重要发展方向，随着纳米技术和单克隆抗体技术的完善、成熟，该技术也得到了迅速的发展，并在多个领域得到广泛地应用，如临床医学、农业应用、环境检测、兽医学应用、食品安全等。

目前虽然某些胶体金检测产品的灵敏度很高，达到使用要求，但是还是有很多产品因为灵敏度原因无法投入应用，使胶体金免疫层析技术应用受到限制。无疑灵敏度的提高能拓宽胶体金免疫层析检测法的应用范围。随着免疫分析技术的发展，人们对产品的性能要求也越来越高，高灵敏度也是胶体金免疫层析技术发展的一个趋势。

目前报道中常见的是免疫金银染色法加强技术对胶体金免疫层析试纸条检测信号进行加强，胶体金银染色法加强技术原理是利用胶体金免疫层析试纸条显色条带(T/C)中的金颗粒在还原剂(对苯二酚、抗坏血酸等)作用下可将银离子还原成银颗粒，被还原的银颗粒在金颗粒表面形成一层黑或灰色层“银壳”。但是该法使用的化学试剂性质极不稳定，不适合长期保存；而且经加强之后试纸条背景干扰大，影响结果判断；放大效果一般。

中国检验检疫科学研究院《胶体金免疫层析法的增敏检测方法及应用》(公开号CN101470114A)，该专利是关于采用金扩增技术对免疫层析法检测信号进行加强，但该专利中加强所需步骤繁琐、且需要洗涤过程，浪费时间和精力。

发明内容

基于此，本发明提供了一种胶体金免疫层析检测试剂盒，该试剂盒结构特殊，能加强胶体金免疫层析大分子检测产品信号。

一种胶体金免疫层析检测试剂盒，包括具有盒底和盒盖的盒体，盒底包括试纸条，所述试纸条由样品垫、胶体金颗粒标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，还包括设置在所述盒盖内表面的加强液垫，当合上盒盖时，所述加强液垫位于所述胶体金颗粒标记垫和硝酸纤维素膜之间。

在其中一个实施例中，所述盒盖设置有加强孔，所述加强孔对应所述加强液垫。

在其中一个实施例中，所述盒盖设置有观察孔，所述观察孔对应所述硝酸纤维素膜。

在其中一个实施例中，所述加强液垫的长度为1.5～2.5cm，宽度为2mm～5mm。

在其中一个实施例中，所述加强液垫为玻璃纤维或聚酯纤维。

本发明的胶体金免疫层析试纸盒在检测血清、尿液、分泌物时，对样品进行常规处理。待试纸条胶体金标记抗体层析完全，合上试纸盒的盒盖，从加强孔将加强液(由A液和B液混合而成，所述A液为质量百分浓度为0.2～1％的氯金酸溶液；所述B液为10mM～30mM的盐酸羟胺或质量百分浓度为0.3-0.9％的抗坏血酸溶液)加入加强液垫中，通过加强液垫可将加强液导入试纸条，加强液在加强液垫上层析至T、C线，对检测信号进行加强。

本发明还提供了上述胶体金免疫层析检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备胶体金溶液

将100ml氯金酸溶液加热至沸腾后，迅速加入0.8-1.5ml质量百分含量为1％的柠檬酸三钠溶液，待颜色稳定后继续煮沸5-20min，冷却，4℃保存备用；

(2)制备胶体金标记抗体

调节胶体金溶液至最佳pH，按最适标记蛋白量缓慢向胶体金溶液中添加标记抗体，磁力搅拌器混合均匀后，加入BSA溶液，使BSA终浓度为0.5％～2％，低速离心20-40min，再高速离心20-40min，加入含1％BSA的10mM的PB溶液复溶，高速离心重复2～3次，最终用含1％BSA的10mM的PB液复溶至约为原体积的1/10；即得胶体金标记抗体；

(3)制备试剂盒

将样品垫、胶体金颗粒标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上制备试纸条，所述胶体金颗粒标记垫上包被有与待检物质可以结合的胶体金标记抗体，所述硝酸纤维膜上包被有检测线和质控线；

在试剂盒的盒盖的内表面设置一个加强液垫，当合上盒盖时，所述加强液垫4位于所述胶体金颗粒标记垫和硝酸纤维素膜之间；在所述盒盖上表面设置有加强孔，所述加强孔对应所述加强液垫。

在其中一个实施例中，步骤(2)中所述最适蛋白标记量的确定方法为：用1％K₂CO₃调节胶体金溶液pH大约在8.2～9.2范围内，取若干离心管标序，依序加入不同蛋白量，使之成梯度变化，混匀静置2小时，加入10％NaCl溶液100ul，以颜色不变管的蛋白量为最小蛋白稳定量，在此基础上添加20％为最适蛋白标记量。

在其中一个实施例中，步骤(2)中所述最佳标记pH值的确定方法为：取若干离心管标序号，每管中加入1ml胶体金溶液，用1％K₂CO₃依次调节每个管号pH，使之成梯度变化，每个离心管中加入最适标记量蛋白，混匀静置2小时，加入10％NaCl溶液100ul，以颜色不变管pH值为最佳标记pH值。

在其中一个实施例中，步骤(3)中在所述盒盖上表面设置有观察孔，所述观察孔对应所述硝酸纤维素膜。

本发明的胶体金免疫层析试纸盒通过采用加强液垫的设计，无需对试纸条进行洗涤而完成对检测信号的加强，简化了加强步骤，缩短了加强所需时间。采用本发明的胶体金免疫层析试纸盒可以有效避免因胶体金标记垫中残留的金颗粒的影响而导致加强之后产生的假阳、背景差等现象，明显提高胶体金免疫层析检测大分子的灵敏度。

附图说明

图1为本发明试剂盒打开时的结构示意图；

图2为本发明试剂盒合上时的正视图；

附图标记：1、盒体；2、卡位；3、试纸条；31、底板；32、样品垫；33、胶体金颗粒标记垫；34、硝酸纤维素膜；35、吸水纸；4、加强液垫；5、加强孔；6、观察孔。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

实施例1人乙肝病毒表面抗原(HBsAg)胶体金免疫层析检测试剂盒

请参阅图1和图2，本发明一种胶体金免疫层析检测试剂盒，包括具有盒底和盒盖的盒体1，盒体1内主要有：试纸条3，所述试纸条3固定在卡位2内，所述试纸条由样品垫32、胶体金颗粒标记垫33、硝酸纤维素膜34、吸水纸35顺次搭接粘贴在底板31上构成，还包括设置在所述盒体1的盒盖内表面的加强液垫4，当合上盒盖时，所述加强液垫4位于所述胶体金颗粒标记垫33和硝酸纤维素膜34之间。所述加强液垫4为玻璃纤维或聚酯纤维，其长度为1.5～2.5cm，宽度为2mm～5mm。在所述盒盖上设置有加强孔5，所述加强孔5对应所述加强液垫4。在所述盒盖上还设置有观察孔6，所述观察孔6对应所述硝酸纤维素膜34。

在该实施例中，用胶体金标记小鼠抗HBsAg单抗，并使其吸附于胶体金颗粒标记垫33上，按照最适蛋白量12ug/ml，喷金参数为2.5ul/CM进行处理，约4mm宽的膜上包被量是1.2ng，硝酸纤维素膜34上分别包被针对待测样本中目标物的特异性多克隆或单克隆抗体形成检测线(该具体实施例中，所用到的是小鼠抗HBsAg单抗)，和羊抗鼠抗体形成质控线，所述检测线和质控线喷膜量分别为1.1ng和1.3ng。

该实施例中的试剂盒的制备方法如下：

1、器皿和试剂准备

所需玻璃器皿用重铬酸钾浓硫酸洗液浸泡48h后，取出，大量自来水冲洗，洗洁精洗涤，自来水冲洗10遍，蒸馏水冲洗3遍，蒸馏水浸泡24h后用去离子水冲洗三次，烘箱烘干后备用。

1％氯金酸溶液溶液：将1g氯金酸加入100ml超纯水中，4℃避光保存备用。

1％柠檬酸三钠溶液：称量1g柠檬酸三钠，溶于100ml超纯水中。

0.01％氯金酸溶液：在99ml超纯水中加入1ml 1％氯金酸溶液。

样品稀释液：10mM PB溶液(制备方法为：称0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄(或者1.44g Na₂HPO₄)和1.8g K₂HPO₄，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L)。

2、胶体金的制备

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，步骤如下：将100mL质量百分含量为0.01％的氯金酸溶液加热至沸腾后，迅速加入质量百分含量为1％的柠檬酸三钠溶液1.4mL，待颜色稳定后继续煮沸10min，冷却，4℃保存备用。

3、胶体金标记抗体的制备

3.1.最小标记量的确定

采用梯度试验法确定胶体金最小蛋白标记量，用1％K₂CO₃调节胶体金溶液pH大约在8.2～9.2范围内，取若干离心管标序，依序加入不同蛋白量，使之成梯度变化，混匀静置2小时，加入10％NaCl溶液100ul，以颜色不变管的蛋白量为最小蛋白稳定量，在此基础上添加20％为最适蛋白标记量(在该实施例中，最适蛋白标记量为12ug/ml)。

3.2最佳标记pH值的确定

取若干2ml离心管标序号，每管中加入1ml胶体金溶液，用1％K₂CO₃(质量百分比)依次调节每个管号pH，使之成梯度变化。每个离心管中加入最适标记量蛋白(3.1步骤确定的)，混匀静置2小时，加入10％NaCl溶液100ul，以颜色不变管pH值为最佳标记pH值(在该实施例中，最佳标记pH为8.7)。

3.3标记

取100ml胶体金溶液用1％K₂CO₃调节至最佳pH，缓慢加入最小蛋白量并在磁力搅拌器下混合10min后，加入BSA溶液，使终浓度为0.5％～2％，即得胶体金标记抗体，4℃过夜备用。

3.4离心纯化

首先将标记好的胶体金标记抗体溶液，2000r/min的转速离心30min，去除聚合凝集杂质，再置于10000r/min的转速离心30min，加入重悬液(含1％BSA的10mM的PB溶液)复溶，高速离心重复2～3次，最终用重悬液复溶至原体积的1/10，4℃备用。

4、制备试剂盒

硝酸纤维素NC膜34贴于PVC底板上，用喷膜仪于NC膜34上喷捕获线(T/C)试剂(在该实施例中，所述捕获线(T/C)试剂分别为抗HBsAg单抗和抗鼠抗体。喷金系数为1.2ul/cm)。用喷金仪将胶体金标记抗体溶液喷于玻璃纤维或聚酯纤维上得到胶体金颗粒标记垫33(按2.5ul/cm喷入，喷入量共为2.5ng)，干燥，样品垫32、胶体金颗粒标记垫33、硝酸纤维素膜34、吸水纸35顺次搭接粘贴在底板31上，按照4mm宽，8cm长的规格切条，再组装在试剂盒里。可以多条设置在一个大试剂盒中，也可以一条设置在一个小试剂盒中。

在试剂盒的盒盖的内表面设置一个加强液垫4，当合上盒盖时，所述加强液垫4位于所述胶体金颗粒标记垫33和硝酸纤维素膜34之间。加强液垫4为玻璃纤维或聚酯纤维，其长度为1.5～2.5cm，宽度为2mm～5mm。

在所述盒盖上表面设置有两个开孔：加强孔5，对应所述加强液垫4；观察孔6，对应所述硝酸纤维素膜34。

在试剂盒外配套试剂瓶，装有所需试剂，即加强液。所述加强液由A液和B液按体积比1∶1混合而成，所述A液为质量百分浓度为0.2％的氯金酸溶液；所述B液为10mM的盐酸羟胺溶液。

实施例2采用实施例1的试剂盒对血清/血浆中人乙肝病毒表面抗原进行检测

用稀释液(10mM的PB缓冲液，下同)将人乙肝病毒表面抗原阳性标品(广州市第八人民医院)逐级稀释至200×、400×、800×、1600×、3200×、6400×、12800×、25600×、51200×。用实施例1的胶体金免疫层析试剂盒分别进行检测，并以稀释液作为阴性对照。

没有加强前：

将各稀释样品分别滴加到样品垫(样品加入体积为60～80ul，约2-3滴)上进行免疫层析反应，反应结束后，观察结果，结果表明：当标品稀释倍数≤6400×时，试纸条检测T线均有红色条带，检验结果为阳性，而更高倍数稀释的标品试纸条检测T线无红色条带，判为阴性。

加强试验后：

将各稀释样品分别滴加到样品垫(样品加入体积为60～80ul)上进行免疫层析反应，层析完全后，合上试纸盒的盒盖，加强液垫位于胶体金标记垫和硝酸纤维膜之间，从加强孔将60～80ul加强液加入加强液垫中，通过加强液垫可将加强液导入试纸条，加强液在加强液垫上层析至T、C线，对检测信号进行加强。

观察结果，结果表明：经加强后检测51200×稀释标品试纸条T线信号为浅灰色，为阳性结果，阴性对照试纸条T线不显色。加强之后能检测的稀释倍数为未加强的8倍，加强背景很好。

实施例3甲型流感病毒胶体金免疫层析检测试剂盒

除了加强液是由A液和B液按体积比1∶2合而成，所述A液为质量百分浓度为0.5％的氯金酸溶液；所述B液为15mM的盐酸羟胺溶液。本实施例的试剂盒结构与实施例1的试剂盒结构相同。

在该实施例中，用胶体金标记小鼠抗甲型流感病毒单抗，并将其吸附于胶体金颗粒标记垫33上，其包被量是2.5ng，硝酸纤维素膜34上分别包被针对待测样本中目标物的特异性多克隆或单克隆抗体形成检测线(该具体实施例中，所用到的是小鼠抗甲型流感病毒单抗)，和羊抗鼠抗体形成质控线，所述检测线和质控线的喷膜量分别为1.2ng和1.3ng。

该实施例中的试剂盒的制备方法除了最适蛋白标记量为8ug/ml，最佳标记pH为8.5，其他操作步骤均与实施例1相同。

实施例4采用实施例2的试剂盒对鼻拭子中甲型流感病毒进行检测

采用常规技术，将甲型流感病毒接种鸡胚培养，用稀释液将病毒培养液逐级稀释至400×、800×、1600×、3200×、6400×、12800×、25600×。用实施例2的胶体金免疫层析试剂盒分别进行检测，并以稀释液作为阴性对照。

没有加强前：

将各稀释样品分别滴加到样品垫60～80ul上进行免疫层析反应，反应结束后，观察结果，结果表明：当标品稀释倍数≤1600×时，试纸条检测T线均有红色条带，检验结果为阳性，而更高倍数稀释的标品试纸条检测T线无红色条带，判为阴性。

加强试验后：

将各稀释样品分别滴加到样品垫(样品加入体积为60～80ul)上进行免疫层析反应，层析完全后，合上试纸盒的盒盖，加强液垫位于胶体金标记垫和硝酸纤维膜之间，从加强孔将60～80ul加强液加入加强液垫中，通过加强液垫可将加强液导入试纸条，加强液在加强液垫上层析至T、C线，对检测信号进行加强。

观察结果，结果表明：经加强后检测25600×稀释标品试纸条T线信号为浅灰色，为阳性结果，阴性对照试纸条T线不显色。加强之后能检测的稀释倍数为未加强的8倍，加强背景很好。

实施例5HCG(人绒毛膜促性腺激素)胶体金免疫层析检测试剂盒

除了加强液是由A液和B液按体积比1.5∶1混合而成，所述A液为质量百分浓度为1％的氯金酸溶液；所述B液为30mM的盐酸羟胺溶液。本实施例的试剂盒结构与实施例1的试剂盒结构相同。

在该实施例中，胶体金颗粒标记垫33上包被的抗体是人绒毛促性腺激素单克隆抗体，其包被量是1ng，硝酸纤维素膜34上分别包被针对待测样本中目标物的特异性多克隆或单克隆抗体形成检测线(该具体实施例中，所用包被的是小鼠抗人绒毛膜促性腺激素(HCG)单克隆抗体)，和羊抗鼠抗体形成质控线，所述检测线和质控线的喷膜量分别为1.2ng和1.3ng。

该实施例中的试剂盒的制备方法除了最适蛋白标记量为8.5ug/ml，最佳标记pH为8.0，其他操作步骤均与实施例1相同。

实施例6采用实施例3的试剂盒对尿样中的HCG(人绒毛膜促性腺激素)进行检测

将阳性尿样标品(广州妇科医院)逐级稀释至4×、8×、16×、32×、64×、128×、256×、512×、1024×。用实施例3的胶体金免疫层析试剂盒分别进行检测，并以稀释液作为阴性对照。

没有加强前：

将各稀释样品分别滴加到样品垫(样品加入体积为60～80ul)上进行免疫层析反应，反应结束后，观察结果，结果表明：当标品稀释倍数≤64×时，试纸条检测T线均有红色条带，检验结果为阳性，而更高倍数稀释的标品试纸条检测T线无红色条带，判为阴性。

加强试验后：

将各稀释样品分别滴加到样品垫(样品加入体积为60～80ul)上进行免疫层析反应，层析完全后，合上试纸盒的盒盖，加强液垫位于胶体金标记垫和硝酸纤维膜之间，从加强孔将60～80ul加强液加入加强液垫中，通过加强液垫可将加强液导入试纸条，加强液在加强液垫上层析至T、C线，对检测信号进行加强。

观察结果，结果表明：经加强后检测1024×稀释标品试纸条T线信号为浅灰色，为阳性结果，阴性对照试纸条T线不显色。加强之后能检测的稀释倍数为未加强的16倍，加强背景很好。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种胶体金免疫层析检测试剂盒，其特征在于，包括具有盒底和盒盖的盒体，盒底包括试纸条，所述试纸条由样品垫、胶体金颗粒标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上构成，还包括设置在所述盒盖内表面的加强液垫，当合上盒盖时，所述加强液垫位于所述胶体金颗粒标记垫和硝酸纤维素膜之间。

2.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述盒盖设置有加强孔，所述加强孔对应所述加强液垫。

3.根据权利要求1或2所述的胶体金免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述盒盖设置有观察孔，所述观察孔对应所述硝酸纤维素膜。

4.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述加强液垫的长度为1.5～2.5cm，宽度为2mm～5mm。

5.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述加强液垫为玻璃纤维或聚酯纤维。

6.一种制备权利要求1-5任一项所述的胶体金免疫层析检测试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备胶体金溶液

将氯金酸溶液加热至沸腾后，迅速加入质量百分含量为1％的柠檬酸三钠溶液，待颜色稳定后继续煮沸5-20min，冷却，4℃保存备用；

(2)制备胶体金标记抗体

调节胶体金溶液至最佳pH，按最适蛋白标记量缓慢加入标记抗体并在磁力搅拌器下混合后，加入BSA溶液，使BSA浓度为0.5％～2％，低速离心20-40min，再高速离心20-40min，加入含BSA的PB溶液复溶，高速离心重复2～3次，最终用含BSA的PB溶液复溶至约为原体积的1/10；即得胶体金标记抗体；

(3)制备试剂盒

将样品垫、胶体金颗粒标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸顺次搭接粘贴在底板上制备试纸条，所述胶体金颗粒标记垫上包被有胶体金标记抗体，所述硝酸纤维膜上包被有检测线和质控线；在试剂盒的盒盖的内表面设置一个加强液垫，当合上盒盖时，所述加强液垫位于所述胶体金颗粒标记垫和硝酸纤维素膜之间；在所述盒盖上表面设置有加强孔，所述加强孔对应所述加强液垫。

7.根据权利要求6所述的制备胶体金免疫层析检测试剂盒的方法，其特征在于，步骤(2)中所述最适蛋白标记量的确定方法为：用1％K₂CO₃调节胶体金溶液pH8.2～9.2，取若干离心管标序，依序加入不同蛋白量，使之成梯度变化，混匀静置2小时，加入10％NaCl溶液100ul，以颜色不变管的蛋白量为最小蛋白稳定量，在此基础上添加20％为最适蛋白标记量。

8.根据权利要求6所述的制备胶体金免疫层析检测试剂盒的方法，其特征在于，步骤(2)中所述最佳标记pH值的确定方法为：取若干离心管标序号，每管中加入1ml胶体金溶液，用1％K₂CO₃依次调节每个管号pH，使之成梯度变化，每个离心管中加入最适标记量蛋白，混匀静置2小时，加入10％NaCl溶液100ul，以颜色不变管pH值为最佳标记pH值。