CN103823061A - Au/Fe3O4免疫层析试纸条及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Au/Fe3O4免疫层析试纸条及其制备方法与应用。本发明提供的一种Au/Fe3O4免疫层析试纸条，包括支持板和放置在其上的样品垫、灌注有Au/Fe3O4标抗体的偶联垫、含有检测线T和质控线C的NC膜和吸水垫；所述Au/Fe3O4标抗体为Au/Fe3O4纳米粒子标记待测病毒的抗体。本发明的实验证明，本发明用一种Au/Fe3O4代替传统的胶体金和磁珠，构建新型的Au/Fe3O4免疫层析试纸条，该试纸条同时具备胶体金试纸条和磁性免疫层析试纸条两者的优点：易于标记，同时也具备借助磁性分离架实现快速分离洗涤的优点，并且具有潜在的借助相关弱磁信号阅读仪，实现对样品的定量。

Description

Au/Fe3O4免疫层析试纸条及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种Au/Fe3O4免疫层析试纸条及其制备方法与应用。 
背景技术
免疫层析技术是20世纪90年代初发展起来的一种新型免疫检测技术，是把免疫反应转移到了玻璃纤维和硝化纤维膜上进行，不需要进行结合标记物与自由标记物的分离。省去了繁琐的加样、洗涤步骤，因而操作简单，快速（20分钟内出结果），人员不用培训，不需或仅需简单的仪器，而且它保留了以前种种免疫检测技术中抗体抗原反应特异性的优点，非常适合现场检测，现在已经广泛地应用于医学、农业、畜牧兽医、环境、食品监管等各种检测领域。 
在传统的免疫层析系统中，用作可视或者被仪器检测的指示物通常包括胶体金，磁珠，胶体硒，乳胶颗粒和量子点等物质，其中以胶体金作为标记的胶体金免疫层析试纸条和以磁性纳米粒子作为标记的磁性免疫层析试纸条倍受广泛学者的青睐。因为胶体金免疫层析试纸条在制备过程中，胶体金具有很好的生物相容性，易于标记，在使用过程中具有快速，简捷，单人份操作，但是缺点是只能实现半定量。因此一些研究工作者通过用磁珠代替胶体金作为标记，构建磁性免疫层析试纸条，并借助相关弱磁信号阅读仪，实现对样品的定量快速检测，并且在标记过程中借助磁性分离架，可以实现快速分离洗涤，但是和胶体金试纸条做比较，磁性免疫层析试纸条的制备过程中，标记过程十分繁琐，需要对磁珠的表面进行修饰。 
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测待测病毒的Au/Fe3O4免疫层析试纸条。 
本发明提供的检测待测病毒的Au/Fe3O4免疫层析试纸条，包括支持板和放置在其上的样品垫、灌注有Au/Fe3O4标抗体的偶联垫、含有检测线T和质控线C的NC膜和吸水垫； 
所述Au/Fe3O4标抗体为Au/Fe3O4纳米粒子标记待测病毒的抗体。 
Au/Fe3O4表示Au包裹在Fe3O4上。 
上述试纸条中，所述Au/Fe3O4纳米粒子中的Fe3O4纳米粒子的粒径为40-50nm； 
所述待测病毒的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。 
上述试纸条中，所述待测病毒的抗体为单克隆抗体； 
所述检测线T由所述待测病毒的多克隆抗体形成； 
所述质控线C由鼠源抗lgG抗体形成。 
上述试纸条中，所述鼠源抗lgG抗体为兔抗鼠lgG； 
所述待测病毒为禽流感病毒； 
所述禽流感病毒具体为H7亚型禽流感病毒。 
本发明的另一个目的是提供一种制备上述的试纸条的方法。 
本发明提供的方法，包括如下步骤： 
1）先将标记物Au/Fe3O4纳米粒子悬浊液和待测病毒单克隆抗体混匀，反应，收集固体反应物，再将所述固体反应物经BSA封闭，即得到Au/Fe3O4标抗体； 
在所述步骤1）的所述封闭后，还包括如下步骤：将所述封闭的产物收集沉淀，再溶解，得到Au/Fe3O4标抗体。 
上述封闭采用的缓冲液为含有质量百分含量为1%的BSA的20mmol/L硼酸钠水溶液； 
所述溶解采用的缓冲液为含有1%BSA和0.1%叠氮钠的20mmol/L的硼酸钠水溶液。 
2）制备灌注有Au/Fe3O4标抗体的偶联垫和含有检测线T和质控线C的NC膜； 
所述灌注有Au/Fe3O4标抗体的偶联垫为将所述Au/Fe3O4标抗体灌注到玻璃纤维棉上、干燥，即得到偶联垫；上述干燥为真空冻干；用于灌注Au/Fe3O4标抗体的玻璃纤维棉为将玻璃纤维棉放入含5%BSA，2%蔗糖，0.8%NaCl和0.05%NaN3的PBS处理液中20min，37℃恒温烘干，得到。 
所述含有检测线T和质控线C的NC膜为将所述待测病毒的多克隆抗体和鼠源抗lgG抗体分别点射于NC膜上，形成含有检测线T和质控线C的NC膜； 
3）将所述NC膜、样品垫、所述偶联垫和吸水垫组装到支持板，得到Au/Fe3O4免疫层析试纸条。 
上述方法中， 
步骤1）中，所述标记物Au/Fe3O4纳米粒子和所述待测病毒单克隆抗体的质量比为260：1； 
所述反应为25℃搅拌30min； 
所述标记物Au/Fe3O4纳米粒子悬浊液的pH值为9.0； 
步骤2）中，所述鼠源抗lgG抗体为兔抗鼠lgG。 
上述方法中， 
所述标记物Au/Fe3O4纳米粒子悬浊液按照包括如下步骤的方法制备： 
将柠檬酸钠水溶液、Fe3O4纳米粒子悬浊液和四氯金酸水溶液混匀，反应，收集固体，分散在水中，得到标记物Au/Fe3O4纳米粒子悬浊液； 
所述柠檬酸钠水溶液的反应温度为99℃； 
所述Fe3O4纳米粒子的粒径为40-50nm； 
所述Fe3O4纳米粒子、所述柠檬酸钠和所述四氯金酸的质量比为2：299：2； 
所述Fe3O4纳米粒子悬浊液为将所述Fe3O4纳米粒子分散在水中得到； 
所述反应依次为A、B：A为99℃搅拌反应15min；B为25℃搅拌15min。 
上述方法中，所述待测病毒为禽流感病毒； 
所述禽流感病毒具体为H7亚型禽流感病毒。 
上述待测病毒单克隆抗体为H7亚型禽流感病毒单克隆抗体； 
上述待测病毒多克隆抗体为H7N2亚型禽流感病毒多克隆抗体。 
上述的Au/Fe3O4免疫层析试纸条在制备检测或辅助检测禽流感病毒的试剂盒中的应用也是本发明保护的范围。 
上述应用中，所述禽流感病毒为H7亚型禽流感病毒。 
本发明的实验证明，本发明用一种以Fe3O4磁性纳米粒子为核Au为壳的纳米粒子（Au/Fe3O4）代替传统的胶体金和磁珠，构建新型的Au/Fe3O4免疫层析试纸条，该试纸条同时具备胶体金试纸条和磁性免疫层析试纸条两者的优点：易于标记，同时也具备借助磁性分离架实现快速分离洗涤的优点，并且具有潜在的借助相关弱磁信号阅读仪，实现对样品的定量。 
附图说明
图1为试纸条结构示意图 
图2为试纸条结果判定 
(a)阴性；(b)阳性。 
图3为传感器特异性结果 
图4为传感器灵敏度检测结果 
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 
H7N2亚型禽流感病毒（Duck/HK/47/76H7N2）、H5N1亚型禽流感病毒（Chicken/Guangxi/1/04H5N1）、H1N3亚型禽流感病毒（Duck/HK/717/79-d1H1N3）、H9N2亚型禽流感病毒（Duck/Guangxi/1/00H9N2）均记载在：A multiplex RT-PCR for detection of type A infl uenza virus and differentiation of avian H5,H7,and H9hemagglutinin subtypes；Zhixun Xiea,*,Yao-shan Panga,Jiabo Liua,Xianwen Denga,Xiaofei Tanga,Jianhua Suna,Mazhar I.Khanb,1,*；Molecular and Cellular Probes20(2006)245–249中；公众可均从广西壮族自治区兽医研究所获得。 
NDV毒株GX1/00记载在文献：陈安莉,谢芝勋,周辰瑜,等.新城疫病毒强弱毒株LAMP鉴别检测方法的建立[J].中国兽医科学,2011,41(09):917-922；公众可从广西壮 族自治区兽医研究所获得。 
IBV毒株Massachussetts41记载在文献：谢志勤,谢芝勋,吕华刚.等.30株鸡传染性支气管炎病毒标准株与分离株S1基因的克隆及序列分析[J].西南农业学报,2008,21(6):1733-1736；公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。 
其中，H7N2亚型禽流感病毒（Duck/HK/47/76H7N2）病毒含量为27HA unit/50ul； 
H1亚型禽流感病毒含量为28HA unit/50ul 
H5亚型禽流感病毒含量为29HA unit/50ul 
H9亚型禽流感病毒含量为29HA unit/50ul 
NDV毒株GX1/00病毒含量为27HA unit/50ul 
IBV毒株Massachussetts41病毒含量为105.7EID50/ml。 
实施例1、Au/Fe3O4免疫层析试纸条的制备 
1、标记物Au/Fe3O4纳米粒子的获得 
1）Fe3O4纳米粒子 
Fe3O4纳米粒子可以商业购买，也可以按照如下常规的方法制备，保证其粒径为40-50nm。 
Fe3O4纳米粒子的制备：4.64g FeCl3·6H2O和1.71g FeSO4·7H2O加入到250mL的去离子水中，然后加入2mL0.2mol/L的硫酸水溶液用于阻止溶液中的Fe2+被氧化；再加入25%的氨水直到pH达到9.0-9.5，在室温下搅拌30min，氨基化之后；加热到80℃下继续搅拌30min，生成黑色悬浊液后超声10min；用磁铁分离，收集沉淀，并用热水反复洗涤沉淀，直到上清液变澄清；收集沉淀即为Fe3O4纳米粒子。 
将Fe3O4纳米粒子加入250ml水，得到Fe3O4纳米粒子悬浊液；保存在容量瓶中。 
2）标记物Au/Fe3O4纳米粒子的制备 
0.229g柠檬酸钠溶解在100mL去离子水中，磁性搅拌下加热到99℃，得到热的柠檬酸钠水溶液，再向其中加入1mL上述1）制备的Fe3O4纳米粒子悬浊液，然后加入5mL10mmol/L四氯金酸水溶液，混匀得到混合液（其中，柠檬酸钠、Fe3O4纳米粒子、四氯金酸的质量比为229：2：2）；99℃下反应15min；移走热源，在室温（25℃）下继续搅拌15min；当酒红色悬浊液冷却至室温后，再次用磁铁分离，收集固体分散到20mL去离子水中，得到Au/Fe3O4纳米粒子悬浊液，置于4℃下保持备用。 
2、Au/Fe3O4标抗体的制备 
用0.1mol/L K2CO3溶液调节10mL浓度为1.3mg/mL Au/Fe3O4悬浊液至pH值为9.0； 
向10ml pH值为9.0浓度为1.3mg/mL Au/Fe3O4悬浊液加入50μL浓度为1mg/mL的H7亚型禽流感病毒单克隆抗体，混匀得到混合液（其中，Au/Fe3O4与H7亚型禽流 感病毒单克隆抗体的质量比为260：1），常温25℃搅拌30min，用磁铁磁性分离，收集沉淀；再向沉淀中加入10mL含有质量百分含量为1%的BSA的20mmol/L硼酸钠水溶液，25℃搅拌30min进行封闭；再次用磁铁磁性分离，收集沉淀；将沉淀分散在1ml含有1%BSA和0.1%叠氮钠的20mmol/L的硼酸钠水溶液中，使Au/Fe3O4标抗体恢复至原体积的1/10，放置在4℃冰箱保存备用，得到Au/Fe3O4标抗体。 
H7亚型禽流感病毒单克隆抗体购自abcam公司，产品代码：ab82458,产品链接网址：http://www.abcam.cn/Influenza-A-Virus-Hemagglutinin-H7-antibody-1H11-ab82458-references.html。 
3、Au/Fe3O4免疫层析试纸条的研制 
H7亚型禽流感病毒多克隆抗体为H7亚型禽流感鸡阳性血清：购自哈尔滨维科生物技术开发公司，经血凝抑制试验方法鉴定呈阳性，浓度为0.2mg/mL。 
试纸条主要由NC膜(NC-a101Millipore135，孔径为8μm，2.5cm×30cm，有背衬，Millipore)、样品垫(BT50，厚度0.52mm，吸水量53mg/cm2，上海金标生物科技有限公司)、偶联垫(SB08，厚度0.33mm，吸水量63.1mg/cm2，上海金标生物科技有限公司)、吸水垫(CH27，厚度0.69mm，吸水速度65.8s/4cm，吸水量62.5mg/cm2，上海金标生物科技有限公司)和支持板（PVC胶板）等五部分构成。 
将NC膜置于BIODOT XYZ喷点系统(XYZ3200)平台上展平压紧，200μL0.2mg/mL H7亚型禽流感病毒多克隆抗体放于A池，200μL1mg/mL兔抗鼠lgG放于B池，开机后将H7亚型禽流感病毒多克隆抗体和兔抗鼠lgG（产品编号BA1048，博士德生物）分别点射于NC膜上，形成检测线（T）和质控线（C）。室温25℃自然晾干后，将其浸泡入封闭液（1%BSA的PBS缓冲液，pH=7.4）中30min，37℃烘干后，加入干燥剂，4℃密封保存，得到含有检测线（T）和质控线（C）NC膜； 
将玻璃纤维棉裁成10mm的细条，放入含5%BSA，2%蔗糖，0.8%NaCl和0.05%NaN3的PBS处理液中20min，37℃恒温烘干，然后将由上述2制备的Au/Fe3O4标抗体灌注在已处理好的玻璃纤维棉上，真空冻干4h，即为偶联垫； 
样品垫要用含2%BSA，1%蔗糖，0.5%硼酸钠和0.1%NaN3的PBS处理后，37℃干燥备用； 
在支持板上，将NC膜、样品垫、偶联垫、吸水垫等按如下工艺组装在一起（如图1所示）：NC膜的底面粘贴在支持板上面，在该NC膜的两端上分别粘贴偶联垫和吸水垫在该玻璃纤维膜的另一端粘贴样品垫，叠压宽度为2mm。用切割机制成3.5mm宽的试纸条，放入带干燥剂的密闭容器中储存，得到Au/Fe3O4免疫层析试纸条试纸条。 
试纸条的检测原理：试纸条根据“抗体-抗原-抗体”夹心免疫层析原理设计。滴 加样品后，在NC膜的毛细作用下，样品溶液向上迁移，达到偶联垫时，Au/Fe3O4标抗体将被溶解。当样品中为H7亚型禽流感病毒阳性时，H7亚型禽流感病毒将和Au/Fe3O4标抗体结合，并一起向上迁移，达到固定有H7亚型禽流感病毒多克隆抗体的检测线T时，形成“H7亚型禽流感病毒多克隆抗体-H7亚型禽流感病毒-Au/Fe3O4标抗体”复合物，最终形成一条棕红色沉淀线，而未被固定的Au/Fe3O4标抗体继续上行至兔抗鼠lgG处，形成“Au/Fe3O4标抗体-兔抗鼠lgG”复合物，形成红棕红色沉淀线，此线为质控线C。当样品为H7亚型禽流感病毒阴性时，Au/Fe3O4标抗溶解在样品中，并一起向上迁移，达到固定有H7亚型禽流感病毒多克隆抗体的检测线T时，不能被固定，检测线T处不出现棕红色条带，未被固定的Au/Fe3O4标抗体继续上行至兔抗鼠lgG处，形成“Au/Fe3O4标抗体-兔抗鼠lgG”复合物，形成棕红色沉淀线，此线为质控线C。试纸条的阴性和阳性结果如图2所示。 
实施例2、Au/Fe3O4免疫层析试纸条的特异性和灵敏度检测 
1、特异性检测 
以下灭活的禽流感病毒为37℃下用0.1%甲醛振荡灭活对应亚型禽流感病毒毒株4小时得到。 
以灭活H7N2亚型禽流感病毒(阳性对照，H7)、灭活H5N1亚型禽流感病毒（H5）、灭活H1N3亚型禽流感病毒（H1）、灭活H9N2亚型禽流感病毒（H9）、新城疫病毒(NDV)GX1/00和传染性支气管炎病毒(IBV)Massachussetts41为待测样品，用由实施例1制备的Au/Fe3O4免疫层析试纸条进行检测，检测方法如下：将待测样品用PBS溶液（pH=7.4,含0.8%NaCl）稀释10倍，即10μL待测样品加入90μL PBS溶液，混合均匀，滴加到试纸条的样品孔（S）中，任其沿着试纸条自由扩散，15min内观察结果。 
结果如图3所示，灭活H7N2亚型禽流感病毒在T线和C线位置同时出现两条棕红色反应带，结果判定为阳性；灭活H5N1亚型禽流感病毒（H5）、H1N3亚型禽流感病毒、H9N2亚型禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒只在C线位置出现一条棕红色反应带，结果判定为阴性。 
2、灵敏度检测 
SPF鸡泄殖腔棉试纸样品（健康鸡）作为阴性对照，以PBS缓冲溶液将H7N2亚型禽流感病毒（Duck/HK/47/76H7N2）分别稀释10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍，用由实施例1制备的Au/Fe3O4免疫层析试纸条按照如下步骤的方法进行检测。 
结果如图4所示，10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍在T线和C线位置同时出现两条棕红色反应带，结果判定为阳性，600倍、700倍的样品只在C线位置出现一条棕红色反应带，结果判定为阴性。结果说明该试纸条的灵敏度为 1∶500。 
因此，用上述试纸条检测或辅助检测待测样品是否含有H7亚型禽流感病毒， 
若检测线T处和质控线C处均出现两条棕红色反应带，结果判定为阳性，待测样品含有或候选含有H7亚型禽流感病毒； 
若仅有质控线C处出现1条棕红色反应带，结果判定为阴性；待测样品不含有或候选不含有H7亚型禽流感病毒； 
其他情况，均为无效试纸条。 
3、对照常规方法检测 
用Dot-ELYSA检测，具体方法以PBS缓冲溶液将H7N2亚型禽流感病毒（Duck/HK/47/76H7N2）分别稀释10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍，分别取5μL点样于硝酸纤维素膜（ＮＣ膜，孔径0.45μｍ，浙江黄岩人民化工厂产品）光面，37℃干燥后，于5％脱脂奶中封闭1ｈ，取出ＮＣ膜，ＰＢＳＴ洗涤3次，每次10ｍｉｎ；加1∶200稀释的H7单克隆抗体37℃孵育1ｈ，ＰＢＳＴ洗涤3次后，再加1∶200稀释的HPR标记的兔抗鼠lgG，37℃孵育1ｈ，ＰＢＳＴ洗涤3次后于ＤＡＢ中显色15ｍｉｎ，ＰＢＳＴ洗涤ＮＣ膜，膜上出现棕色斑点者判为阳性。 
结果显示，10倍、50倍、100倍、200倍、300倍出现棕色斑点，400倍、500倍、600倍、700倍的样品没有出现棕色斑点，Dot-ELYSA检测灵敏度为1∶300。 
因此，本发明的方法灵敏度高。 

Claims (10)

1.一种用于检测待测病毒的Au/Fe3O4免疫层析试纸条，包括支持板和放置在其上的样品垫、灌注有Au/Fe3O4标抗体的偶联垫、含有检测线T和质控线C的NC膜和吸水垫；
所述Au/Fe3O4标抗体为Au/Fe3O4纳米粒子标记待测病毒的抗体。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：
所述Au/Fe3O4纳米粒子中的Fe3O4纳米粒子的粒径为40-50nm；
所述待测病毒的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
3.根据权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于：
所述待测病毒的抗体为单克隆抗体；
所述检测线T由所述待测病毒的多克隆抗体形成；
所述质控线C由鼠源抗lgG抗体形成。
4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于：
所述鼠源抗lgG抗体为兔抗鼠lgG；
所述待测病毒为禽流感病毒；
所述禽流感病毒具体为H7亚型禽流感病毒。
5.一种制备权利要求1-4中任一所述的试纸条的方法，包括如下步骤：
1）先将标记物Au/Fe3O4纳米粒子悬浊液和待测病毒单克隆抗体混匀，反应，收集固体反应物，再将所述固体反应物经BSA封闭，即得到Au/Fe3O4标抗体；
2）制备灌注有Au/Fe3O4标抗体的偶联垫和含有检测线T和质控线C的NC膜；
所述灌注有Au/Fe3O4标抗体的偶联垫为将所述Au/Fe3O4标抗体灌注到玻璃纤维棉上、干燥，即得到偶联垫；
所述含有检测线T和质控线C的NC膜为将所述待测病毒的多克隆抗体和鼠源抗lgG抗体分别点射于NC膜上，形成含有检测线T和质控线C的NC膜；
3）将所述NC膜、样品垫、所述偶联垫和吸水垫组装到支持板，得到Au/Fe3O4免疫层析试纸条。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
步骤1）中，所述标记物Au/Fe3O4纳米粒子和所述待测病毒单克隆抗体的质量比为260：1；
所述反应为25℃搅拌30min；
所述标记物Au/Fe3O4纳米粒子悬浊液的pH值为9.0；
步骤2）中，所述鼠源抗lgG抗体为兔抗鼠lgG。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述标记物Au/Fe3O4纳米粒子悬浊液按照包括如下步骤的方法制备：
将柠檬酸钠水溶液、Fe3O4纳米粒子悬浊液和四氯金酸水溶液混匀，反应，收集固体，分散在水中，得到标记物Au/Fe3O4纳米粒子悬浊液；
所述柠檬酸钠水溶液的反应温度为99℃；
所述Fe3O4纳米粒子的粒径为40-50nm；
所述Fe3O4纳米粒子、所述柠檬酸钠和所述四氯金酸的质量比为2：299：2；
所述反应依次为A、B：A为99℃搅拌反应15min；B为25℃搅拌15min。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：
所述待测病毒为禽流感病毒；
所述禽流感病毒具体为H7亚型禽流感病毒。
9.权利要求1-4所述的Au/Fe3O4免疫层析试纸条在制备检测或辅助检测禽流感病毒的试剂盒中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述禽流感病毒为H7亚型禽流感病毒。
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