CN106018798A - 一种免疫层析检测磁性颗粒及其制备方法 - Google Patents

一种免疫层析检测磁性颗粒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种免疫层析检测磁性颗粒及其制作方法，首先通过氧化还原反应制备大颗粒的磁流体，磁流体经低浓度的盐酸和硝酸混和液体处理后，形成颗粒更小的磁性胶体颗粒，胶体颗粒经清洗后重悬于双蒸水中。该颗粒可以通过静电结合抗体等功能蛋白，经封闭后可用于侧向层析检测，该功能磁性颗粒可在试纸条上显示红色的线条。可将适量的该功能磁性颗粒添加到被检测溶液中，经反应后，通过磁性富集功能磁性颗粒，最后将富集到的颗粒添加到试纸条上侧向层析，观察对应区域的颜色判读。

Description

一种免疫层析检测磁性颗粒及其制备方法
技术领域
本发明属于分子检测的领域，具体涉及一种食品、药品和化妆品等复杂样品中分子便捷分离检测的免疫层析检测磁性颗粒及其制备方法。
背景技术
免疫层析法是二十世纪八十年代兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗原或抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。现在市场上最常用的是胶体金免疫层析试纸，该类试纸条能在特定区域固定胶体金物质，从而显示红色的线条，裸眼快速判读结果。近年也兴起了一些荧光物质微球作为指示物质的试纸条，该类试纸条在灵敏度方面较胶体金试纸条有较大提升，但由于试纸条上样量有限，只能检测60-100ul样本体系，难以实现低丰度物质的大体系检测。采用磁性颗粒可实现大体积中靶标物的快速便捷富集，但常见的磁性颗粒较大，表面电荷少，难以在硝酸纤维素膜上实现层析。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种免疫层析检测磁性颗粒及其制备方法。
本发明通过以下的技术方案来实现：
一种免疫层析检测磁性颗粒，所述免疫层析检测磁性颗粒采用氧化还原法、水热法制备磁流体后，经低浓度的盐酸和硝酸混和液体处理后，再加入氯化钠破坏胶体后磁性回收，最后重悬于双蒸水中。
优选的，所述酸化溶液为盐酸、硝酸、硫酸、碳酸、磷酸、草酸、次氯酸或其混合溶液。
优选的，所述免疫层析检测磁性颗粒的表面通过静电包被有抗体、核酸适配体或亲和素特异结合靶标物，并通过牛血清蛋白、甘氨酸物质封闭表面裸露位点。
优选的，所述免疫层析检测磁性颗粒的表面通过静电包被代用功能基团的多聚物，经过清洗后再通过固定在表面的功能基团与功能物质结合。
优选的，所述免疫层析检测磁性颗粒的表面包裹有复合磁性颗粒。
优选的，所述复合磁性颗粒包括胶体金、带有负电荷的量子点、荧光颗粒或荧光上转换颗粒物。
一种免疫层析检测磁性颗粒制作方法，包括如下的步骤：
（1）在500ml烧杯中加入30ml的 0.8M的氯化亚铁溶液，20ml的 0.8M的氯化铁溶液，加入双蒸水至250ml， 300RPM/min搅拌；
（2）缓慢在溶液中加入1M 氢氧化钠溶液100ml，5-8分钟加完，持续搅拌30分钟；
（3）将所得的溶液70度处理30分钟；
（4）将（3）所得的磁流体磁性富集，去除溶液，加入300ml双蒸水清洗2次，用双蒸水定容与400ml；
（5）在（4）所得的溶液中加入0.1M 盐酸和0.05M硝酸配制的100m酸化溶液搅拌1小时；
（6）在（5）所得的溶液中加入20克的氯化钠，充分溶解；
（7）除掉液体成分，将产物定容于500ml双蒸水中；
（8）取100ul上步骤总所得溶液，用双蒸水稀释100倍待用；
（9）取1ml步骤（8）所得溶液，加入5ug抗体，混匀后，摇床混匀10分钟；
（10）在步骤（9）所得溶液中加入100ul 10%的牛血清蛋白，混匀后，摇床混匀10分钟；
（11）磁性富集颗粒，充分去除液体，制得磁性颗粒。
本发明揭示一种免疫层析检测磁性颗粒的制作方法，首先通过氧化还原反应制备大颗粒的磁流体，磁流体经低浓度的盐酸和硝酸混和液体处理后，形成颗粒更小的磁性胶体颗粒，胶体颗粒经清洗后重悬于双蒸水中。该颗粒可以通过静电结合抗体等功能蛋白，经封闭后可用于侧向层析检测，该功能磁性颗粒可在试纸条上显示红色的线条。可将适量的该功能磁性颗粒添加到被检测溶液中，经反应后，通过磁性富集功能磁性颗粒，最后将富集到的颗粒添加到试纸条上侧向层析，观察对应区域的颜色判读，实现了复杂体系中分子的便捷纯化和高敏检测，可应用于食品安全、分子诊断等领域，有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明中免疫层析检测磁性颗粒的制备和原理图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例 1
一种免疫层析检测磁性颗粒，所述免疫层析检测磁性颗粒采用氧化还原法、水热法制备磁流体后，经低浓度的盐酸和硝酸混和液体处理后，再加入氯化钠破坏胶体后磁性回收，最后重悬于双蒸水中；所述酸化溶液为盐酸、硝酸、硫酸、碳酸、磷酸、草酸、次氯酸或其混合溶液；所述免疫层析检测磁性颗粒的表面通过静电包被有抗体、核酸适配体或亲和素特异结合靶标物，并通过牛血清蛋白、甘氨酸物质封闭表面裸露位点；所述免疫层析检测磁性颗粒的表面通过静电包被代用功能基团的多聚物，经过清洗后再通过固定在表面的功能基团与功能物质结合；所述免疫层析检测磁性颗粒的表面包裹有复合磁性颗粒；所述复合磁性颗粒包括胶体金、带有负电荷的量子点、荧光颗粒或荧光上转换颗粒物。
实施例 2
一种免疫层析检测磁性颗粒制作方法，包括如下的步骤：
（1）在500ml烧杯中加入30ml的 0.8M的氯化亚铁溶液，20ml的 0.8M的氯化铁溶液，加入双蒸水至250ml， 300RPM/min搅拌；
（2）缓慢在溶液中加入1M 氢氧化钠溶液100ml，5-8分钟加完，持续搅拌30分钟；
（3）将所得的溶液70度处理30分钟；
（4）将（3）所得的磁流体磁性富集，去除溶液，加入300ml双蒸水清洗2次，用双蒸水定容与400ml；
（5）在（4）所得的溶液中加入0.1M 盐酸和0.05M硝酸配制的100m酸化溶液搅拌1小时；
（6）在（5）所得的溶液中加入20克的氯化钠，充分溶解；
（7）除掉液体成分，将产物定容于500ml双蒸水中；
（8）取100ul上步骤总所得溶液，用双蒸水稀释100倍待用；
（9）取1ml步骤（8）所得溶液，加入5ug抗体，混匀后，摇床混匀10分钟；
（10）在步骤（9）所得溶液中加入100ul 10%的牛血清蛋白（BSA），混匀后，摇床混匀10分钟；
（11）磁性富集颗粒，充分去除液体，制得磁性颗粒；将收集的颗粒物重悬与100ul 1%的BSA溶液中；
（12）取3ul步骤（11）所得莱克多巴胺抗体标记的磁性颗粒产物，放入1-2ml待检测样品中，混匀，反应5分钟后，磁性富集磁性颗粒；
检测试纸条的制备：用莱克多巴胺-BSA偶联产物（的抗体在硝酸纤维素膜上划线，该区域作为检测线（T线），用磁性纳米颗粒标记抗体的二抗在硝酸纤维素膜上划线，该区域作为质控线（C线），T线在硝酸纤维素膜离上样区的近端，C线在硝酸纤维素膜离上样区的远端；将步骤（12）所得的产物添加到试纸条的上样区，将试纸条平放于桌面，加入60ul含有0.5% triton x-100的1X PBS溶液；5分钟后观察结果判读：有明显的C线则为有效结果，若C，T现均显示，则样品中靶标物的含量不超过该试纸条的检测限，若只有C线，无T线，则样品中靶标物的含量超过该试纸条的检测限，所有无C线结果判读为无效。
需要指出的是，以上的两个实施例只是对本发明的解释，并非是对发明的限定，在不违背本发明的精神的情况下，本发明可以作任何形式的修改，例如简单的加热系统的更换或者反应釜的变化都应在本发明技术方案保护范围之内。

Claims (7)

1.一种免疫层析检测磁性颗粒，其特征在于：所述免疫层析检测磁性颗粒采用氧化还原法、水热法制备磁流体后，经酸化溶液处理后，再加入氯化钠破坏胶体后磁性回收，最后重悬于双蒸水中。
2.如权利要求1所述的免疫层析检测磁性颗粒，其特征在于：所述酸化溶液为盐酸、硝酸、硫酸、碳酸、磷酸、草酸、次氯酸或其混合溶液。
3.如权利要求2所述的免疫层析检测磁性颗粒，其特征在于：所述免疫层析检测磁性颗粒的表面通过静电包被有抗体、核酸适配体或亲和素特异结合靶标物，并通过牛血清蛋白、甘氨酸物质封闭表面裸露位点。
4.如权利要求3所述的免疫层析检测磁性颗粒，其特征在于：所述免疫层析检测磁性颗粒的表面通过静电包被代用功能基团的多聚物，经过清洗后再通过固定在表面的功能基团与功能物质结合。
5.如权利要求4所述的免疫层析检测磁性颗粒，其特征在于：所述免疫层析检测磁性颗粒的表面包裹有复合磁性颗粒。
6.如权利要求5所述的免疫层析检测磁性颗粒，其特征在于：所述复合磁性颗粒包括胶体金、带有负电荷的量子点、荧光颗粒或荧光上转换颗粒物。
7.一种制备权利要求1-6任一所述免疫层析检测磁性颗粒方法，包括如下的步骤：
（1）在500ml烧杯中加入30ml的 0.8M的氯化亚铁溶液，20ml的0.8M的氯化铁溶液，加入双蒸水至250ml，300RPM搅拌；
（2）缓慢在溶液中加入1M 氢氧化钠溶液100ml，5-8分钟加完，持续搅拌30分钟；
（3）将所得的溶液在70度条件下处理30分钟；
（4）将（3）所得的磁流体磁性富集，去除溶液，加入300ml双蒸水清洗2次，用双蒸水定容与400ml；
（5）在（4）所得的溶液中加入0.1M 盐酸和0.05M硝酸配制的100m酸化溶液搅拌1小时；
（6）在（5）所得的溶液中加入20克的氯化钠，充分溶解；
（7）除掉液体成分，将产物定容于500ml双蒸水中；
（8）取100ul上步骤总所得溶液，用双蒸水稀释100倍待用；
（9）取1ml步骤（8）所得溶液，加入5ug抗体，混匀后，摇床混匀10分钟；
（10）在步骤（9）所得溶液中加入100ul 10%的牛血清蛋白，混匀后，摇床混匀10分钟；
（11）磁性富集颗粒，充分去除液体，制得磁性颗粒。
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