JP5238190B2 - ヒアルロン酸存在下における免疫測定法及びそれに用いられる物 - Google Patents
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Description
免疫測定法では、従来、検出感度の向上を目的として、検体抽出液にポリエチレングリコール(PEG)などの増感剤を配合することが行われている。また、イムノクロマトグラフィー測定法では、非特異的凝集および非特異反応を防止するために、展開溶媒中にウシ血清アルブミン(BSA)やホスホリルコリン基を有する重合体を含有させることが提案されている(特許文献1参照)。
この検出法における免疫測定法としては、特に限定されるものではなく、例えば、上記した免疫測定法が全て含まれるが、そのうち、第一の抗体と第二の抗体との間に被験試料に含まれる検体をサンドイッチするサンドイッチ式免疫測定法、とりわけELISA(Enzyme−linked immunosorbent assay)法、イムノクロマトグラフィー測定法など、特にイムノクロマトグラフィー測定法において高い効果が得られる。
また、本発明の他の好ましい実施形態によれば、被験試料を、ヒアルロン酸が配置されたイムノクロマト法テストストリップに注入して該ヒアルロン酸とともにクロマト展開させることからなる免疫測定法、すなわち、イムノクロマトグラフィー測定法が提供される。
別法としては、ヒアルロン酸を膜担体に配置しておき、前記混合液又は前記被験試料が膜担体をクロマト展開する時に前記混合液又は前記被験試料とヒアルロン酸とが共存するようにしてもよい。
このキットにおいては、ヒアルロン酸を予め含浸部材に凍結乾燥状態で含浸させておき、該含浸部材を前記容器に配置して、前記混合液又は前記被験試料とヒアルロン酸を容器中で接触させて混合できるようにしてもよい。含浸部材は、容器中に直接投入してもよく、または、容器の排出口付近に設置して、容器の排出口から前記混合液又は前記被験試料を排出する時にヒアルロン酸と混合するようにしてもよい。
このイムノクロマト法テストストリップでは、被験試料は、クロマト展開と同時に、膜担体に配置されたヒアルロン酸と混合されるので、従来のイムノクロマト法テストストリップと同様の操作で本発明の測定法が実施できるので、好都合である。
さらに、本発明によれば、上記免疫測定法を実施するのに好適な他の物として、検体を希釈して免疫測定に供する被験試料を得るための抽出液調製キットであって、溶媒と、ヒアルロン酸を凍結乾燥状態で含浸した含浸部材とを備え、使用時に該溶媒に該含浸部材を接触させて抽出液を調製できるようにした、免疫測定用抽出液調製キットが提供される。
上記抽出液が、イムノクロマトグラフィー測定用展開溶媒としての組成を備えている場合は、該抽出液を用いて検体を希釈することにより、イムノクロマトグラフィー測定用の被験試料としてそのまま使用できる。
従来、気管スワブ、クロアカスワブ、鼻汁、血液等の生体から採取した試料をそのまま検体抽出液で希釈して被験試料として免疫測定に供した場合、免疫測定感度が低下することが問題とされていた。
本発明によれば、理論は明らかではないが、ヒアルロン酸により、上記生体試料中に含まれる細胞成分や粘膜成分などの生体成分による反応阻害が低下するため、免疫測定感度が向上するものと考えられる。
なお、該検体抽出液は、保存時におけるヒアルロン酸の失活を防止するために、凍結乾燥状態で含浸部材に含浸させておき、使用時に、溶媒と該含浸部材を接触させることで上記検体抽出液を調製できる免疫測定用抽出液調製キットの形態としてもよい。含浸部材としては、例えば、ガラス繊維不織布、セルロー類布(濾紙、ニトロセルロース膜等)、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類などが使用できる。
なお、このイムノクロマトグラフィー測定用展開溶媒は、保存時におけるヒアルロン酸の失活を防止するために、ヒアルロン酸を凍結乾燥状態で含浸部材に含浸させておき、使用時に、展開溶媒と該含浸部材とを接触させることで上記展開溶媒を調製できる免疫測定用展開溶媒調製キットの形態としてもよい。含浸部材としては、例えば、ガラス繊維不織布、セルロース類布(濾紙、ニトロセルロース膜等)、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類などが使用できる。
上記抽出液及び展開溶媒は、必要に応じ、界面活性剤、防腐剤、無機塩、特開2003-344406に記載の重合体等の各種添加剤を含有しても良い。
イムノクロマトグラフィー測定法は、公知のイムノクロマト法テストストリップの構成に準拠して容易に実施できる。
このイムノクロマト法テストストリップは、検体を希釈して前記膜担体にクロマト展開できるように被験試料を調製するための展開溶媒と、前記展開溶媒に混合するヒアルロン酸とをセットにしたイムノクロマトグラフィー測定用キットの形態で供給することもできる。この場合、ヒアルロン酸は、上記免疫測定用抽出液調製キットと同様の形態で用意されていてもよい。
検体が抗体である場合、第一の物質として抗原が使用され、第二の物質として検体に対して特異的反応性を有する抗体などの物質が使用される。
図示の例では、膜担体3は、幅5mm、長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターで作成されている。
該膜担体3には、そのクロマト展開始点側の末端から7.5mmの位置に、第一の抗体が固定され、検体の捕捉部位31が形成される。
図示の例では、膜担体3は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、被験試料に含まれる検体をクロマト展開可能で、かつ、上記捕捉部位31を形成する上記第一の物質を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
図示の例では、含浸部材2として、5mm×15mmの帯状のガラス繊維不織布を用いているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布(濾紙、ニトロセルロース膜等)、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用できる。
このうち、捕捉部位31での色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に判定できる点から、呈色標識物質を用いることが好ましい。
呈色標識物質としては、金コロイド、白金コロイド等の金属コロイドの他、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスや、天然ゴムラテックスなどのラテックスが挙げられ、このうち、金コロイドなどの金属コロイドが特に好ましい。
当該含浸部材2は、標識された第二の物質の懸濁液を前記ガラス繊維不織布等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させることなどによって作製できる。
さらに、必要に応じて、含浸部材2の上面に試料添加用部材5の下流側部分を載置するとともに、該試料添加用部材5の上流側部分を粘着シート1に貼着してもよく、また、膜担体3の下流側部分の上面に吸収用部材4の上流側部分を載置するとともに、該吸収用部材4の下流側部分を粘着シート1に貼着せしめることもできる。
吸収用部材4は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
その際、該混合液中に検体が存在すれば、抗原抗体反応により検体と第二の物質との複合体が形成される。
この複合体は、膜担体3中をクロマト展開されて捕捉部位31に到達し、そこに固定された第一の物質と抗原抗体反応して捕捉される。
このとき、標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が使用されていれば、当該呈色標識物質の集積により捕捉部位31が発色するので、直ちに、検体を定性的または定量的に測定することができる。
ヒアルロン酸を配置する箇所は、上記イムノクロマト法テストストリップの捕捉部位31よりも上流側であれば特に限定されないが、長い処理時間を確保するために、試料添加用部材5又は含浸部材2等のヒアルロン酸を含浸し得る部材又はその上などの近傍の箇所に配置しておくことが好ましい。
検体は、ヒアルロン酸と交差反応すること無く免疫測定法で検出可能なものであれば特に制限はなく、咽頭スワブに含まれる結核菌やO−157等の病原菌、インフルエンザウイルス、アデノウイルス等のウイルス、血液中に含まれるC反応性蛋白質などの抗原や各種抗体などの生体高分子の他、環境中に存在する環境ホルモン様物質などの微量物質が挙げられる。
(1)金コロイド溶液の調製
加熱によって沸騰させた超純水99mlに、1%(v/w)塩化金酸水溶液1mlを加え、さらに、その1分後に1%(v/w)クエン酸ナトリウム水溶液1.5mlを加えて加熱し5分間沸騰させた後、室温に放置して冷却した。次いで、この溶液に200mM炭酸カリウム水溶液を加えてpH9.0に調製し、これに超純水を加えて全量を100mlとして金コロイド溶液を得た。
インフルエンザウイルスH5亜型のヘマグルチニン蛋白に対して結合性を有する抗体(以下、抗H5抗体)を下記の手順でそれぞれ金コロイド標識した。
抗H5抗体の蛋白換算重量1μg(以下、抗体の蛋白換算重量を示すとき、単に、その精製蛋白質の重量分析による重量数値で示す)と上記(1)の金コロイド溶液1mlとを混合し、室温で2分間静置してこの抗体のことごとくを金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%となるように10%ウシ血清アルブミン(以下、「BSA」と記す)水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をことごとくこのBSAでブロックして、金コロイド標識抗H5抗体(以下、「金コロイド標識抗体」と記す)溶液を調製した。この溶液を遠心分離(5600×G、30分間)して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を10%サッカロース・1%BSA・0.5%トリトン(Triton)-X100を含有する50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)に懸濁して金コロイド標識抗体溶液を得た。
図1に示されるイムノクロマト法テストストリップを下記の手順で作成した。
幅5mm、長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース膜をクロマトグラフ媒体のクロマト展開用膜担体3として用意した。
抗H5抗体1.0mg/mlが含有されてなる溶液0.5μlを、このクロマト展開用膜担体3におけるクロマト展開開始点側の末端から7.5mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、インフルエンザウイルスH5亜型と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉部位31とした。
5mm×15mmの帯状のガラス繊維不織布に、金コロイド標識抗体溶液37.5μlを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて金コロイド標識抗体含浸部材2とした。
上記クロマト展開用膜担体3、上記標識抗体含浸部材2の他に、試料添加用部材5として綿布と、吸収用部材4として濾紙を用意した。そして、これらの部材を用いて、図1と同様のイムノクロマト法テストストリップを作成した。
400mMトリス緩衝液(pH7.5)に、分子量50〜100KDaのヒアルロン酸、ポリエチレングリコール(PEG)、又は、コンドロイチン硫酸を最終濃度0.2%となるように添加し、検体抽出液を調製した。対照として、何れの増感剤も添加していない400mMトリス緩衝液(pH7.5)からなる検体抽出液を用意した。
(臓器乳剤含有検体抽出液の調製方法)
インフルエンザウイルス感染陰性鳥より採取した気管に400mMトリス緩衝液(pH7.5)を添加し磨り潰すことで臓器乳剤を作製した。そして本乳剤を遠心分離し、遠心分離上清に分子量50〜100KDaのヒアルロン酸、ポリエチレングリコール(PEG)、又は、コンドロイチン硫酸を最終濃度0.2%になるように添加し検体抽出液とした。対照として、何れの増感剤も添加していない臓器乳剤含有検体抽出液のみからなる検体抽出液を用意した。
400mMトリス緩衝液(pH7.5)に、分子量6.55KDa、35KDa、50〜100KDa又は132KDa、660KDa、1000KDaのヒアルロン酸を最終濃度0.2%となるように添加し、検体抽出液を調製した。対照として、ヒアルロン酸を添加していない400mMトリス緩衝液(pH7.5)からなる検体抽出液を用意した。
400mMトリス緩衝液(pH7.5)に、分子量50〜100KDaのヒアルロン酸を最終濃度0.1、0.15、0.2又は0.25%となるように添加し、検体抽出液を調製した。対照として、ヒアルロン酸を添加していない400mMトリス緩衝液(pH7.5)からなる検体抽出液を用意した。
(臓器乳剤含有検体抽出液の調製方法)
インフルエンザウイルス感染陰性鳥より採取した気管に400mMトリス緩衝液(pH7.5)を添加し磨り潰すことで臓器乳剤を作製した。そして本乳剤を遠心分離し、遠心分離上清に分子量50〜100KDaのヒアルロン酸を最終濃度0.1、0.15、0.2又は0.25%となるように添加し検体抽出液とした。対照として、何れの増感剤も添加していない臓器乳剤含有検体抽出液のみからなる検体抽出液を用意した。
5×15mmのガラス繊維製パッドに、分子量50〜100KDaの0.5%ヒアルロン酸溶液20μlを含浸させた後、自然乾燥させ、ヒアルロン酸含浸パッドを作製した。その後、図2に示す検体抽出用容器の本体10に、400mMトリス緩衝液(pH7.5)200μlを入れた後、該含浸パッドを投入して該容器の側壁をもみつぶし、ヒアルロン酸を最終濃度0.2%で含有する検体抽出液を調製した。その後、インフルエンザウイルスであるA/Dk/Mong/54/01-Dk/Mong/47/01(H5N1)株を200ng/mlになるように該容器に添加して被験試料とした。そして、被験試料100μLを参考例1で作成したインフルエンザウイルスH5亜型抗原検出用イムノクロマト法テストストリップの試料添加用部材5上にマイクロピペットで滴下しクロマト展開させた。室温で30分放置後、捕捉部位31における捕捉量を肉眼およびイムノクロマトリーダーで観察した。また、ウイルスを添加せずに(Blank)同様の実験を行った。結果を表6に示す。
なお、図2の検体抽出用容器は、開口端11とそれに対向する閉止端12とを備えた柔軟なプラスチック材料で成形されたチューブ状の本体10と、該本体10の開口端11にネジ式に着脱可能に取り付けられるノズル20とからなり、ノズル20の内側に形成される排出経路21にはノズルフィルター22が配置されている。
5×15mmのガラス繊維製パッドの代わりに5×7.5mmのガラス繊維製パッドを用いた以外、上記(1)と同様にしてヒアルロン酸含浸パッドを作製した。この含浸パッドを、参考例1で作成したインフルエンザウイルスH5亜型抗原検出用イムノクロマト法テストストリップの試料添加用部材5上に配置した。なお、ヒアルロン酸は最終濃度0.2%で含有するよう調製している。400mMトリス緩衝液(pH7.5)に、インフルエンザウイルスであるA/Dk/Mong/54/01-Dk/Mong/47/01(H5N1)株を200ng/mlになるよう添加して被験試料とした。そして、被験試料100μLを上記インフルエンザウイルスH5亜型抗原検出用イムノクロマト法テストストリップのヒアルロン酸含浸パッド上にマイクロピペットで滴下しクロマト展開させた。室温で30分放置後、捕捉部位31における捕捉量を肉眼およびイムノクロマトリーダーで観察した。また、ウイルスを添加せずに(Blank)同様の実験を行った。結果を表6に示す。
5×15mmのガラス繊維製パッドの代わりに図2の検体抽出用容器のノズルフィルター22(ガラス繊維製)を用いた以外、上記(1)と同様にして0.25%ヒアルロン酸をフィルター40μl含浸させパッドを作製した。そして、この含浸パッドを、図2に示される容器ノズルのノズルフィルター22として配置した。なお、ヒアルロン酸は最終濃度0.2%で含有するよう調製している。そして、400mMトリス緩衝液(pH7.5)に、インフルエンザウイルスであるA/Dk/Mong/54/01-Dk/Mong/47/01(H5N1)株を200ng/mlになるよう添加した被験試料200μLを容器内に入れた後、該容器に該ノズルを装着した。そして、該容器の側壁を押圧することにより、被験試料100μLを参考例1で作成したインフルエンザウイルスH5亜型抗原検出用イムノクロマト法テストストリップの試料添加用部材5上に滴下しクロマト展開させた。室温で30分放置後、捕捉部位31における捕捉量を肉眼およびイムノクロマトリーダーで観察した。また、ウイルスを添加せずに(Blank)同様の実験を行った。結果を表6に示す。
(臓器乳剤の調製方法)
インフルエンザウイルス感染陰性鳥より採取した気管に400mMトリス緩衝液(pH7.5)を添加し磨り潰した後、遠心分離し、遠心分離上清を臓器乳剤として取得した。
2 含浸部材
3 膜担体
31 捕捉部位
4 吸収用部材
5 試料添加用部材
10 容器本体
11 開口端
12 閉止端
20 ノズル
21 排出経路
22 ノズルフィルター
Claims (24)
- 検体の第一の抗原決定基にて抗体抗原反応可能な第一の物質を予め所定位置に固定せしめて形成された捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記検体の第二の抗原決定基にて抗体抗原反応可能で且つ標識された第二の物質と所定量の被験試料との混合液を、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれる検体と前記第二の抗体とを備えた複合体を前記捕捉部位に捕捉させるイムノクロマトグラフィー測定法であって、クロマト展開の前またはクロマト展開と同時に、前記被験試料を分子量3万〜10万Daのヒアルロン酸と混合して前記被験試料中に濃度0.01〜0.25重量%のヒアルロン酸を存在せしめることを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法。
- 膜担体とは別体の容器中で前記混合液又は前記被験試料にヒアルロン酸を混合した後、これをクロマト展開せしめる、請求項1に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
- ヒアルロン酸は予め含浸部材に凍結乾燥状態で含浸されており、該含浸部材を前記容器に配置することにより、前記混合液又は前記被験試料をヒアルロン酸と混合する、請求項2に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
- ヒアルロン酸を膜担体に配置しておき、前記混合液又は前記被験試料をクロマト展開させた時に前記混合液又は前記被験試料とヒアルロン酸とが混合するようにした、請求項1に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
- 前記第二の物質は金属コロイドまたはラテックスで標識されている請求項1に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
- 前記膜担体がニトロセルロース膜である請求項5に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
- 検体がインフルエンザウイルスである請求項1乃至6の何れか1項に記載のイムノクロマトグラフィー測定法。
- 検体の第一の抗原決定基にて抗体抗原反応可能な第一の物質と、前記検体の第二の抗原決定基にて抗体抗原反応可能で且つ標識された第二の物質と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の物質は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の物質は前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように配置されてなるイムノクロマト法テストストリップと、検体を希釈して前記膜担体にクロマト展開できるように被験試料を調製するための展開溶媒とを少なくとも備えてなるイムノクロマトグラフィー測定用キットであって、さらに、前記展開溶媒に添加するための分子量3万〜10万Daのヒアルロン酸を前記被験試料中に濃度0.01〜0.25重量%で存在せしめるに十分な量だけ備えていることを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定用キット。
- ヒアルロン酸は予め含浸部材に凍結乾燥状態で含浸されており、展開溶媒を含有する容器中に該含浸部材を配置して用いられる、請求項8に記載のキット。
- 前記第二の物質は金属コロイドまたはラテックスで標識されている、請求項8に記載のキット。
- 前記膜担体がニトロセルロース膜である、請求項10に記載のキット。
- 検体がインフルエンザウイルスである請求項8乃至11の何れか1項に記載のキット。
- 検体の第一の抗原決定基にて抗体抗原反応可能な第一の物質と、前記検体の第二の抗原決定基にて抗体抗原反応可能で且つ標識された第二の物質と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の物質は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の物質は前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように配置されてなるイムノクロマト法テストストリップであって、被験試料中に濃度0.01〜0.25重量%で存在せしめるに十分な量の分子量3万〜10万Daのヒアルロン酸が、前記膜担体の前記第二の物質が配置されている箇所又はその近傍に配置されていることを特徴とする、イムノクロマト法テストストリップ。
- ヒアルロン酸は凍結乾燥状態で配置されている、請求項13に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
- ヒアルロン酸は含浸部材に含浸された状態で膜担体に配置されている、請求項14に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
- 前記第二の物質は金属コロイドまたはラテックスで標識されている請求項13に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
- 前記膜担体がニトロセルロース膜である請求項16に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
- 検体がインフルエンザウイルスである請求項13乃至17の何れか1項に記載のイムノクロマト法テストストリップ。
- 検体を希釈してイムノクロマトグラフィー測定に供する被験試料を得るための抽出液であって、前記被験試料中に濃度0.01〜0.25重量%で存在せしめるに十分な量の分子量3万〜10万Daのヒアルロン酸を含有することを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定用抽出液。
- イムノクロマトグラフィー展開溶媒として使用される請求項19に記載のイムノクロマトグラフィー測定用抽出液。
- 検体がインフルエンザウイルスである請求項19又は20に記載のイムノクロマトグラフィー測定用抽出液。
- 検体を希釈してイムノクロマトグラフィー測定に供する被験試料を得るための抽出液調製キットであって、溶媒と、前記被験試料中に濃度0.01〜0.25重量%で存在せしめるに十分な量の分子量3万〜10万Daのヒアルロン酸を凍結乾燥状態で含浸した含浸部材とを備え、使用時に該溶媒に該含浸部材を接触させて抽出液を調製できるようにした、イムノクロマトグラフィー測定用抽出液調製キット。
- イムノクロマトグラフィー展開溶媒として使用される請求項22に記載のイムノクロマトグラフィー測定用抽出液調製キット。
- 検体がインフルエンザウイルスである請求項22又は23に記載のイムノクロマトグラフィー測定用抽出液調製キット。
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