CN106706908A - 一种乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸的制备方法，包括步骤为：通过点膜喷金设备用抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（标记抗体）标记的免疫金对玻璃纤维素膜喷金得到金垫，用抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（包被抗体）检测线包被液和对照线包被液分别在粘有硝酸纤维素膜的聚氯乙烯底板上划线，得到点膜的聚氯乙烯底板；将样品垫、金垫、点膜的聚氯乙烯底板和吸水纸组装在一起，切割成检测试纸。通过上述方式，本发明得到的检测试纸基于免疫侧向流层析技术，能够通过手工操作、肉眼读取判断血液样本中是否含有乙肝表面抗原，诊断快速且结果准确，不会对受检者身体造成伤害。

Description

一种乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸的制备方法
技术领域
本发明属于生物应用技术领域，特别是涉及一种乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸的制备方法。
背景技术
乙型肝炎病毒简称乙肝病毒，是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科。根据目前所知，乙型肝炎病毒就只对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒性肝炎疾病，其是传染性疾病，不是遗传病。据世界卫生组织统计资料显示，在全球范围内，大约有二十多亿的人为乙肝病毒携带者，约占全世界总人口的百分之三十左右，是全世界范围内感染人数最多的一种慢性传染性疾病。因其传染性疾病的性质，患病者在婚情、入学、就业、社交等多种与人交往的活动中受到不同程度的歧视，同时其对人类健康有非常大的影响，因此受到人们的重视。
乙型病毒型肝炎的致病菌的重要血清学标志物为乙肝病毒表面抗原。乙肝表面抗原是健康查体必查项目。在临床检测中，乙肝病毒表面抗原测定是判断乙型病毒性肝炎病毒携带者或乙型病毒性肝炎患者的病情判断和临床状况分析的重要临床参考指标，乙型病毒性肝炎病毒的测定不仅对乙型肝炎的诊断和评价具有重要的临床意义，同时，为有效阻断乙型病毒性肝炎在人群间的广泛传播起到非常重要的作用。
在临床检测过程中，目前用于检测乙型病毒性肝炎表面抗原的方法主要有酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、胶体金免疫层析法（Colloidalgold immunochromatographic assay，GICA）、时间分辨荧光免疫法（Time resolvedfluoroisnmuno assay，TRFIA）以及微粒子酶免疫分析法（Microparticle enzymeimmunoassay，MEIA)和化学发光免疫分析法（Immunochemiluminometry assay，CLIA）等不同方式和不同作用原理的检测方式。现有的乙型病毒性肝炎表面抗原的检测方法存在一些缺点，有的检测方法得到结果的时间长，需要长时间等待，有的检测方法需要借助仪器，有的检测方法步骤繁琐，不能进行批量检测，这些检测方法不容易在基层门诊进行推广应用。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸的制备方法，该制备方法得到的检测试纸适用于急诊或者手术前急查HBV病毒的定性检查，诊断快速且结果准确，可单份或成批测定，不需任何仪器，是一种较好的快速初筛普查方法，适合于广大基层门诊推广。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸的制备方法，包括步骤为：
（1）制备重悬液：所述重悬液中包括聚乙烯吡咯烷酮PVP、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和三羟甲基氨基甲烷，将聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和三羟甲基氨基甲烷溶于水并定容，调节pH值至8-9，得到重悬液；制备包被基液：所述包被基液中包括海藻糖，用海藻糖溶于0.01M，pH值为7-8的磷酸缓冲溶液PB，得到包被基液；
（2）向胶体金中加入碳酸钾，调节pH，再依次加入抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（标记抗体）、牛血清白蛋白溶液混合，离心得到沉淀，所述沉淀用步骤（1）制备的重悬液重悬得到用抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（标记抗体）标记的免疫金；
（3）用步骤（1）制备的包被基液、无水乙醇稀释抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（包被抗体）得到检测线包被液，用步骤（1）制备的包被基液稀释羊抗鼠IgG多克隆抗体得到对照线包被液；
（4）用步骤（2）制备的用抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（标记抗体）标记的免疫金对金垫喷金得到免疫金垫，用步骤（3）制备的所述检测线包被液、所述对照线包被液分别在贴有硝酸纤维素膜的聚氯乙烯底板上划线，得到点膜的聚氯乙烯底板；
（5）将样品垫、免疫金垫、点膜的聚氯乙烯底板和吸水纸组装得到乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述聚乙烯吡咯烷酮、所述蔗糖、所述海藻糖、所述牛血清白蛋白、所述三羟甲基氨基甲烷和所述定容后总体积的比例为0.5g：10g：5g：1g：0.242g：100mL。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述重悬液的pH值是用1M盐酸调节至8.4；所述磷酸缓冲溶液是0.01M、pH值为7.4的磷酸缓冲溶液。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（2）的具体过程为：往搅拌的胶体金中加入碳酸钾，调节pH并搅拌10min，加入抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（标记抗体）并搅拌15min，再加入牛血清白蛋白溶液，搅拌15min，在4℃、转速为10000r/min的条件下离心3min，吸取得到第一沉淀，剩下上清液，将所述上清液继续在4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，吸取得到第二沉淀，将所述第一沉淀和所述第二沉淀合并，用所述重悬液重悬至离心前体积的1/10，得到用抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（标记抗体）标记的免疫金，其中所述搅拌是置于磁力搅拌器上实现的。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（2）中所述碳酸钾为0.2M碳酸钾，所述牛血清白蛋白溶液为质量分数为10%的牛血清白蛋白溶液；所述碳酸钾和所述抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（标记抗体）的比例为4uL/mL:14µg/mL；所述牛血清白蛋白溶液的加入体积为所述胶体金体积的1/10。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（3）中所述检测线包被液中所述抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（包被抗体）的浓度为0.45mg/mL，所述对照线包被液中所述羊抗鼠IgG抗体的浓度为1.5mg/mL。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（4）中所述喷金过程是通过点膜喷金设备实现的；所述金垫采用玻璃纤维膜；所述点膜的聚氯乙烯底板放入37℃±3℃、相对湿度≤30%的条件下烘干2h。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（5）中所述样品垫采用玻璃纤维膜；在使用前用样品垫处理液对所述样品垫浸泡10min后干燥，其中所述样品垫处理液是将比例为0.2g：1mL：20mg：1.21g的牛血清白蛋白、吐温80、鼠抗人红细胞抗体和三羟甲基氨基甲烷溶于水中定容至100 mL，pH值调节至8.0；所述乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸是组装后切割得到的。
本发明的有益效果是：本发明的乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸的制备方法，得到的检测试纸基于免疫侧向流层析技术，不需任何仪器设备，能够通过手工操作、肉眼读取判断血液样本中是否含有乙型肝炎病毒表面抗原，诊断快速且结果准确，不会对受检者身体造成伤害。所述检测试纸容易在基层门诊进行推广应用，不仅对乙型肝炎的诊断和评价具有重要的临床意义，同时，为有效阻断乙型病毒性肝炎在人群间的广泛传播起到非常重要的作用。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
（一）容器及材料
容器设备：烧杯、量筒、容量瓶、玻璃棒、磁力搅拌机、电子天平、移液枪、点膜喷金设备、裁切机、切条机、封口机、压壳机、pH计、鼓风干燥箱。
试剂辅料：氯金酸、柠檬酸三钠、K2CO3、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、无水乙醇、Tris（三羟甲基氨基甲烷）、HCl、BSA（牛血清白蛋白）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、Tween-80（吐温80）、蔗糖、海藻糖、鼠抗人红细胞抗体。
物料：玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、聚氯乙烯底板、吸水纸、塑料卡、干燥剂、一次性滴管、铝箔袋。
环境：洁净、室温、相对湿度干区≤30%，湿区45-65%，水质：高纯水。
（二）制备过程
1、胶体金的制备：采用柠檬酸三钠还原法
50 mL 2%氯金酸溶液配制：取1g/瓶的氯金酸溶于高纯水中，容量瓶定容至50 mL，2-8℃保存备用。
100 mL 5%柠檬酸三钠溶液配制：称取5.00g柠檬酸三钠溶于高纯水中，容量瓶定容至100 mL，用0.22 µm滤头过滤，现配现用。
胶体金制备方法：取两只洁净烧杯，分别加入400mL和200mL高纯水，前者加入2%氯金酸溶液，后者加入5%柠檬酸三钠溶液，于磁力搅拌机上加热至煮沸，待两种溶液都沸腾时，将柠檬酸三钠溶液快速倒入沸腾的氯金酸溶液中，继续煮沸30min，冷却后加高纯水稀释，2-8℃保存备用。
各组份加入体积：
2、样品垫的处理：
1L样品垫处理液配制：称取2g牛血清白蛋白、12.1g Tris和0.2g鼠抗人红细胞抗体，量取10mL Tween-80溶于高纯水中，容量瓶定容至1L，用1M盐酸调pH为8.0，2-8℃密闭保存备用。
将型号为RB45的玻璃纤维膜在样品垫处理液中浸润，浸泡10min，取出，相对湿度≤30%，风干4h，裁去边缘，防止边缘效应，装入铝箔袋中室温保存备用。
3、重悬液、包被基液、膜封闭液溶液配制
100mL 1M盐酸配制：量取8.59 mL浓盐酸溶于高纯水中，容量瓶定容至100 mL，室温保存备用。
100mL重悬液配制：称取0.5g聚乙烯吡咯烷酮、0.242g Tris、10g蔗糖、5g海藻糖和1g BSA溶于高纯水，在100mL容量瓶中定容，用1M盐酸调pH为8.4，用0.22µm滤头过滤，2-8℃密闭保存备用。
磷酸缓冲液（PB）配制：称取2.84g磷酸氢二钠溶于高纯水，容量瓶定容至100 mL，即为0.2M磷酸氢二钠溶液；称取2.40g磷酸二氢钠溶于高纯水，容量瓶定容至100 mL，即为0.2M磷酸二氢钠溶液；用0.22 µm滤头过滤，2-8℃保存备用。量取19 mL0.2M磷酸二氢钠溶液，81 mL0.2M磷酸氢二钠溶液，加入1900 mL高纯水，混匀，即为0.01M，pH=7.4的磷酸缓冲液（PB），2-8℃密闭保存备用。
包被基液配制：称取1.00g海藻糖溶于磷酸缓冲液（PB），容量瓶定容至100 mL，2-8℃密闭保存备用。
4、免疫金制备
100mL 0.2 M碳酸钾溶液配制：称取2.76 g碳酸钾溶于高纯水，容量瓶定容至100mL，用0.22 µm滤头过滤，2-8℃密闭保存备用。
100mL 10％BSA溶液配制：称取10 g BSA溶于高纯水中，容量瓶定容至100mL，0.22µm滤头过滤，2-8℃密闭保存备用。
标记：取烧杯，加入胶体金，置磁力搅拌机上搅拌，加入4uL/mL的0.2M碳酸钾，调节pH并搅拌10min，缓慢加入14µg/mL的抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（标记抗体），搅拌15min，缓慢加入10% BSA保护剂，至终浓度1%，搅拌15min，在4℃下转速为10000r/min的条件下离心3min，吸取沉淀，将上清液继续在4℃下转速为10000r/min的条件下离心10min，保留沉淀，向收集到的沉淀中用重悬液重悬至原体积的1/10，得到免疫金，2-8℃保存备用。
5、点膜喷金操作
喷金：打开点膜喷金设备，将喷金模块压下去，划线模块抬上来，防止划线头碰触到板面，打开真空泵至0.5个大气压。
按[运行]进入运行画面，选择[程序]转换到喷金工作模式。进入程序数据画面后选择好程序号，编辑好“长度”、“浓度”、“速度”、“原点X、Y、Z”等参数，修改好参数后，按[保存]保存数据，按[永久保存]将永久保存数据。
按[手动]进入手动画面，将2号泵（喷金模式）样品管道插入高纯水试管中，管道末端准备接水的器皿。选择[清洗]使用高纯水清洗5遍。待拿走高纯水试管后，选择[排液]直至管道内无水分。此时将2号泵样品管道插入试管中，按[加液]直至管道内充满免疫金。将金垫放在板面上的合适位置，按[运行]进入运行画面，按[开始]进行喷金。
喷金完毕，将2号泵样品管道插入高纯水试管中，管道末端准备接水的器皿。选择[清洗]使用高纯水清洗5遍。按[主菜单]的[气操作]开气至气压为零。
喷金处理后的金垫于相对湿度≤30%风干1h。干燥处理后的免疫金垫置于铝箔袋中，加干燥剂室温密封保存备用。
配制检测线包被液：用包被基液、无水乙醇稀释抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（包被抗体）至终浓度为0.45mg/mL，得到检测线包被液即T线工作液，2-8℃保存备用。
配制对照线包被液：用包被基液将羊抗鼠IgG多抗稀释至终浓度为1.5mg/mL，得到对照线包被液即C线工作液，2-8℃保存备用。
点膜：将划线模块压下去，将喷金模块抬上来，形成一定的落差，防止喷金头触碰板面。
按[运行]进入运行画面，选择[程序]转换到划线工作模式。进入程序数据画面后选择好程序号，编辑好“长度”、“浓度”、“速度”、“原点X、Y、Z”等参数，其中“速度”不可太快，为80mm/s，修改好参数后，按[保存]保存数据，按[永久保存]将永久保存数据。
按[手动]进入手动画面，将1、3号泵（划线模式）样品管道插入高纯水试管中，管道末端准备接水的器皿。选择[清洗]使用高纯水清洗5遍。待拿走高纯水试管后，选择[排液]直至管道内无水分。此时将1号泵（划线模式）样品管道插入C线工作液中，将3号泵（划线模式）样品管道插入T线工作液中，按[加液]直至管道内充满工作液。将准备好的的粘贴有硝酸纤维素膜的聚氯乙烯底板放在板面上的合适位置，按[运行]进入运行画面，按[开始]进行划线。
划线操作完毕，将1、3号泵样品管道插入高纯水试管中，管道末端准备接水的器皿。选择[清洗]使用高纯水清洗5遍。关闭点膜喷金仪。划线完成后的硝酸纤维素膜即反应膜，将粘有反应膜的聚氯乙烯底板置于干燥箱中，37℃±3℃，相对湿度≤30%，烘干2h。干燥完成后将所述聚氯乙烯底板置于铝箔袋中，加干燥剂室温密封保存备用。
6、组装切割、装配、包装
将样品垫、免疫金垫、粘有反应膜的聚氯乙烯底板和吸水纸组装在一起，使用自动斩切机切割成3.0/4.0mm试纸条。每张试纸条装配至塑料卡中，使用压壳机压紧。加入一个干燥剂、一个一次性滴管后装入铝箔袋中保存，即为成品。
所述乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸在硝酸纤维素膜的检测区固定了抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（包被抗体），在对照区固定了羊抗鼠IgG多抗，在玻璃纤维素膜上预包被抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（标记抗体）-胶体金。测试时，滴加50uL血清、血浆即可，如检测全血，还需再滴加一滴（约35µL）全血缓冲液（生理盐水），水平放置。免疫金垫上的抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（标记抗体）-胶体金会溶解，如样本中含有乙型肝炎病毒表面抗原，抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（标记抗体）-胶体金与样本中的乙型肝炎病毒表面抗原结合在一起，形成“抗原-抗体-金”复合物，复合物沿着试纸条向后方移动，首先到达包被了抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（包被抗体）的检测区，“抗原-抗体-金”复合物，将同抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体（包被抗体）结合，并在检测线上滞留下来，形成一条红色的线，这表示阳性结果。线条颜色的深浅同样本中的抗体数量没有比例关系。该区里如果没有带颜色的线条表示样本中不含乙型肝炎病毒表面抗原或乙型肝炎病毒表面抗原低于本试纸最低检出限。复合物继续移动，到达包被了羊抗鼠IgG多抗的对照区，游离的“抗体-金”复合物将同羊抗鼠IgG多抗结合在一起而富集在对照区，形成一条红色的线。对照线的出现证明试纸条检测功能正常。无论样本中是否含有乙型肝炎病毒表面抗原，在有效试验中，试纸条的对照区都应当出现淡红至紫红色的对照线。样本继续移动，通过对照区进入吸收区。吸收区的作用是吸附剩余的复合物，使其在试纸条内移动，并消除本底的颜色。自试纸条加入稀释后的样本混合液起计时，10~15分钟内方可读取结果。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸的制备方法，其特征在于，包括步骤为：
（1）制备重悬液：所述重悬液中包括聚乙烯吡咯烷酮PVP、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和三羟甲基氨基甲烷，将聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白和三羟甲基氨基甲烷溶于水并定容，调节pH值至8-9，得到重悬液；制备包被基液：所述包被基液中包括海藻糖，用海藻糖溶于0.01M，pH值为7-8的磷酸缓冲溶液PB，得到包被基液；
（2）向胶体金中加入碳酸钾，调节pH，再依次加入抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体、牛血清白蛋白溶液混合，离心得到沉淀，所述沉淀用步骤（1）制备的重悬液重悬得到用抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体标记的免疫金；
（3）用步骤（1）制备的包被基液、无水乙醇稀释抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体得到检测线包被液，用步骤（1）制备的包被基液稀释羊抗鼠IgG多克隆抗体得到对照线包被液；
（4）用步骤（2）制备的用抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体标记的免疫金对金垫喷金得到免疫金垫，用步骤（3）制备的所述检测线包被液、所述对照线包被液分别在粘贴有硝酸纤维素膜的聚氯乙烯底板上划线，得到点膜的聚氯乙烯底板；
（5）将样品垫、免疫金垫、点膜的聚氯乙烯底板和吸水纸组装得到乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述聚乙烯吡咯烷酮、所述蔗糖、所述海藻糖、所述牛血清白蛋白、所述三羟甲基氨基甲烷和所述定容后总体积的比例为0.5g：10g：5g：1g：0.242g：100mL。
3.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述重悬液的pH值是用1M盐酸调节至8.4；所述磷酸缓冲溶液是0.01M、pH值为7.4的磷酸缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤（2）的具体过程为：往搅拌的胶体金中加入碳酸钾，调节pH并搅拌10min，加入抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体并搅拌15min，再加入牛血清白蛋白溶液，搅拌15min，在4℃、转速为10000r/min的条件下离心3min，吸取得到第一沉淀，剩下上清液，将所述上清液继续在4℃、转速为10000r/min的条件下离心10min，吸取得到第二沉淀，将所述第一沉淀和所述第二沉淀合并，用所述重悬液重悬至离心前体积的1/10，得到用抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体标记的免疫金，其中所述搅拌是置于磁力搅拌器上实现的。
5.根据权利要求1或4所述的乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述碳酸钾为0.2M碳酸钾，所述牛血清白蛋白溶液为质量分数为10%的牛血清白蛋白溶液；所述碳酸钾和所述抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的比例为4uL/mL:14µg/mL；所述牛血清白蛋白溶液的加入体积为所述胶体金体积的1/10。
6.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述检测线包被液中所述抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的浓度为0.45mg/mL，所述对照线包被液中所述羊抗鼠IgG抗体的浓度为1.5mg/mL。
7.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述喷金过程是通过点膜喷金设备实现的；所述金垫采用玻璃纤维膜；所述点膜的聚氯乙烯底板放入37℃±3℃、相对湿度≤30%的条件下烘干2h。
8. 根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述样品垫采用玻璃纤维膜；在使用前用样品垫处理液对所述样品垫浸泡10min后干燥，其中所述样品垫处理液是将比例为0.2g：1mL：20mg：1.21g的牛血清白蛋白、吐温80、鼠抗人红细胞抗体和三羟甲基氨基甲烷溶于水中定容至100 mL，pH值调节至8.0；所述乙型肝炎病毒表面抗原检测试纸是组装后切割得到的。
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