CN104678098A - 心肌肌钙蛋白i和心型脂肪酸结合蛋白联检试纸制备方法 - Google Patents

心肌肌钙蛋白i和心型脂肪酸结合蛋白联检试纸制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种心肌肌钙蛋白I（cTnI）和心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）联检试纸的制备方法，包括步骤为：通过点膜喷金设备用cTnI 标记抗体和H-FABP 标记抗体标记的混合液对金垫喷金得到金垫，用cTnI检测线包被液、H-FABP检测线包被液和对照线包被液分别在粘有硝酸纤维素膜的聚氯乙烯底板上划线，得到点膜的聚氯乙烯底板；将样品垫、金垫、点膜的聚氯乙烯底板和吸水纸组装在一起，切割成检测试纸。通过上述方式，本发明得到的检测试纸基于免疫侧向流层析技术，能够通过手工操作、肉眼读取判断血液样本中是否含有心肌肌钙蛋白I、心型脂肪酸结合蛋白，诊断快速且结果准确，不会对受检者身体造成伤害。

Description

心肌肌钙蛋白I和心型脂肪酸结合蛋白联检试纸制备方法
技术领域
本发明涉及生物应用技术领域，特别是涉及一种心肌肌钙蛋白I和心型脂肪酸结合蛋白联检试纸的制备方法。
背景技术
急性心肌梗塞（AMI）是中老年人的常见急症，AMI的急救时间是降低死亡率的关键，AMI致死的重要原因是不能早期诊断而延误了治疗时机。因此，研制高灵敏度、高特异性的早期诊断试剂是目前提高AMI诊断率与治疗效果、降低病死率的迫切需要。传统的AMI的诊断依靠胸痛的体征、心电图特征和血清标志物。但是，胸痛并不是典型的症状, 心电图也不是特异性的。因此,心肌标志物的早期检查具有重要的临床应用价值。
近年来有关研究报道cTnI是目前公认的反映心肌坏死的“金标准”,可以检测到微小心肌损害。cTnI仅存于心房肌和心室肌中,且胎儿、新生儿和成年人cTnI均相同,因此,cTnI具100%的心肌特异性,使cTnI成为极好的诊断心肌损伤和区分CK-MB假性升高病人的良好指标。AMI发病后4h血清cTnI可升高, 14～18h达到峰值, 5～10d恢复正常,其灵敏度和特异度均明显高于CK-MB, 其特异性甚至可达100%,敏感性在96.6%以上。其变化有助于观察有无再梗死或梗死再扩展,是心肌梗死经过治疗后判断血管再通与否的最佳指标。
研究表明，在急性心肌梗死患者发病极早期，胞浆中的H-FABP会迅速释放到血浆中，能够直接提示心脏患者的发病情况，故可作为早期诊断心肌梗死程度的有效标志物；且由于其准确性、敏感性和特异性，目前还没有更优越的AMI标志物以取代它的位置。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种心肌肌钙蛋白I和心型脂肪酸结合蛋白联检试纸的制备方法，该制备方法得到的试纸诊断快速且结果准确。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种心肌肌钙蛋白I和心型脂肪酸结合蛋白联检试纸的制备方法，包括步骤为：（1）将三羟甲基氨基甲烷、蔗糖、海藻糖和牛血清白蛋白溶于水并定容，调节pH值至8-9，得到金标稀释液，用0.01M磷酸二氢钠溶液调节0.01M磷酸氢二钠溶液的pH值至7-8，得到包被缓冲液；
（2）往搅拌的胶体金中加入0.2M碳酸钾，调节pH，加入待标记物并搅拌，再加入0.1g/mL牛血清白蛋白溶液，离心得到沉淀，所述沉淀用所述金标稀释液重悬至离心前体积的1/10，其中所述待标记物为cTnI 标记抗体时得到cTnI免疫金，所述待标记物为H-FABP 标记抗体时得到H-FABP免疫金；
（3）用包被缓冲液稀释cTnI 包被抗体和H-FABP包被抗体分别得到cTnI检测线包被液、H-FABP检测线包被液，用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG多抗得到对照线包被液；
（4）通过点膜喷金设备用cTnI 标记抗体和H-FABP 标记抗体标记的混合液对金垫喷金得到喷金的金垫，其中所述cTnI 标记抗体和H-FABP 标记抗体标记的混合液是由所述cTnI免疫金和所述H-FABP免疫金混合得到的，用所述cTnI检测线包被液、H-FABP检测线包被液和所述对照线包被液分别在粘有硝酸纤维素膜的聚氯乙烯底板上划线，得到点膜的聚氯乙烯底板；
（5）将样品垫、喷金的金垫、点膜的聚氯乙烯底板和吸水纸组装在一起，切割成人体免疫缺陷病毒抗体检测试纸。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述三羟甲基氨基甲烷、所述蔗糖、所述海藻糖、所述牛血清白蛋白和定容总体积的比例为0.24g：10g：5g：1g：100mL。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述金标稀释液的pH值用1M盐酸调节至8.5，所述包被缓冲液的pH值调节至7.4。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（2）中所述胶体金是过滤过的，所述搅拌是置于磁力搅拌器上，往搅拌的胶体金中加入0.2M碳酸钾，调节pH并搅拌5min，加入待标记物并搅拌40min，再加入0.1g/mL牛血清白蛋白溶液，搅拌20min，在4℃、转速为10000r/min的条件下离心40分钟，沉淀用所述金标稀释液重悬至离心前体积的1/10，得到标记物。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（2）中所述0.2M碳酸钾和所述cTnI标记抗体的比例为4uL/mL:12μg/mL，所述0.2M碳酸钾和所述H-FABP标记抗体的比例为3uL/mL:10μg/mL，所述牛血清白蛋白的加入量占总质量的1%。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（3）中所述检测线包被液中所述cTnI包被抗体的浓度为1.8mg/mL，所述H-FABP包被抗体的浓度为1.4mg/mL，所述对照线包被液中所述羊抗鼠IgG多抗的浓度为3mg/mL。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（4）中所述金垫采用聚酯纤维膜，在喷金前用金垫处理液浸泡10min后干燥，其中所述金垫处理液是Brij-35加入水中定容得到，所述Brij-35和定容总体积的比例为1g：100mL。
在本发明一个较佳实施例中，步骤（5）中所述样品垫采用玻璃纤维膜，在使用前用样品垫处理液浸泡10min后干燥，其中所述样品垫处理液是将比例为0.2g：1.21g：0.2g：0.5mL：25mg的酪蛋白、三羟甲基氨基甲烷、聚乙二醇20000、吐温80和鼠抗人红细胞抗体溶于水中定容。
本发明的有益效果是：本发明的心肌肌钙蛋白I和心型脂肪酸结合蛋白联检试纸的制备方法，得到的检测试纸基于免疫侧向流层析技术，能够通过手工操作、肉眼读取判断血液样本中是否含有心肌肌钙蛋白I、心型脂肪酸结合蛋白，诊断快速且结果准确，不会对受检者身体造成伤害。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
（一）容器及材料
容器设备：烧杯、量筒、容量瓶、玻璃棒、磁力搅拌器、电子天平、移液枪、点膜喷金设备、裁切机、切条机、封口机、压壳机、pH计、鼓风干燥箱。
试剂辅料：氯金酸、柠檬酸三钠、KCl、K2CO3、Tris（三羟甲基氨基甲烷）、HCl、BSA（牛血清白蛋白）、PEG20000（聚乙二醇20000）、酪蛋白、T-80、Brij-35（十二烷基聚乙二醇醚）、蔗糖、海藻糖、叠氮钠、鼠抗人红细胞抗体。
物料：玻璃纤维膜、聚酯纤维膜、NC膜、底板、吸水纸、干燥剂、铝箔袋、塑料卡、聚乙烯与聚酯合成材料。
环境：洁净、室温、湿度60%以下，水质：工艺用水。
（二）制备过程
1、胶体金的制备：采用柠檬酸三钠还原法
100 mL 1%氯金酸溶液配制：称取1 g氯金酸溶于工艺用水中，容量瓶定容至100 mL，4℃保存备用。
100 mL 1%柠檬酸三钠溶液配制：称取1 g柠檬酸三钠溶于工艺用水中，容量瓶定容至100 mL，用0.22 μm滤头过滤，现配现用。
胶体金制备方法：在洁净烧杯中加入工艺用水，于磁力搅拌器上加热至煮沸，然后加入1%柠檬酸三钠溶液，充分混匀2min，加入1%氯金酸溶液，维持加热10min，冷却后恢复体积，4℃保存备用。
各组份加入体积：
。
2、样品垫、金垫的预处理：
1L样品垫处理液配制：称取2g酪蛋白、12.1g Tris、2g PEG20000、5mL T-80和0.25g鼠抗人红细胞抗体溶于工艺用水中，容量瓶定容至1L，室温保存备用。
100 mL金垫处理液配制：称取1g Brij-35溶于工艺用水中，容量瓶定容至100 mL，4℃保存备用。
将材料为聚酯纤维膜VL78的金垫在金垫处理液中浸润，浸泡10min后取出，在温度设置为37℃的鼓风干燥箱中完全干燥，裁去边缘防止边缘效应，铝箔袋室温保存备用。
将材料为玻璃纤维膜RB65的样品垫在样品垫处理液中浸润，浸泡10min，取出，在温度设置为37℃的真空干燥箱中完全干燥，裁去边缘防止边缘效应，铝箔袋室温保存备用。
3、金标稀释液、包被缓冲液配制
100mL 1M盐酸配制：量取8.59 mL浓盐酸溶于工艺用水中，容量瓶定容至100 mL，室温保存备用。
100mL金标稀释液配制：称取0.24g Tris、10g蔗糖、5g海藻糖和1g BSA溶于工艺用水，在100mL容量瓶中定容，用1M盐酸调pH为8.5，用0.22μm滤头过滤，4℃保存备用。
包被缓冲液配制：称取0.12 g磷酸氢二钠溶于工艺用水，容量瓶定容至100 mL，即为0.01M磷酸氢二钠溶液；称取0.14 g磷酸二氢钠溶于工艺用水，容量瓶定容至100 mL，即为0.01M磷酸二氢钠溶液；用0.01 M磷酸二氢钠溶液调节0.01 M磷酸氢二钠溶液的pH至7.4，即为0.01M、pH=7.4的包被缓冲液，用0.22 μm滤头过滤，4℃保存备用。
4、免疫金标记
100 mL 0.2 M碳酸钾溶液配制：称取2.76 g碳酸钾溶于工艺用水，容量瓶定容至100 mL，用0.22 μm滤头过滤，室温保存备用。
100 mL 10％BSA溶液配制：称取10 g BSA溶于工艺用水中，100 mL容量瓶定容至100 mL，0.22 μm滤头过滤备用。
标记cTnI 标记抗体：取烧杯，加入已滤过的胶体金，置磁力搅拌器上搅拌，加入4uL/mL的0.2M碳酸钾，调节pH并搅拌5min，缓慢加入12μg/mL的cTnI 标记抗体，搅拌40 min，缓慢加入10% BSA保护剂，至终浓度1%，搅拌20 min，在4℃下转速为10000 r/min的条件下离心40分钟，弃去上清液，沉淀用金标稀释液重悬至原体积的1/10，4℃保存备用。
标记H-FABP标记抗体：取烧杯，加入已滤过的胶体金，置磁力搅拌器上搅拌，加入3uL/mL的0.2M碳酸钾，调节pH并搅拌5min，缓慢加入10μg/mL 的H-FABP标记抗体，搅拌40 min，缓慢加入10% BSA保护剂，至终浓度1%，搅拌20 min，在4℃下转速为10000 r/min的条件下离心40分钟，弃去上清液，沉淀用金标稀释液重悬至原体积的1/10，4℃保存备用。
5、点膜喷金操作
喷金：打开点膜喷金设备，将喷金模块压下去，划线模块抬上来，防止划线头碰触到板面，打开真空泵至0.5个大气压。
按[运行]进入运行画面，选择[程序]转换到喷金工作模式。进入程序数据画面后选择好程序号，编辑好‘长度’、‘浓度’、‘速度’、‘原点X、Y、Z’等参数，修改好参数后，按[保存]保存数据，按[永久保存]将永久保存数据。
按[手动]进入手动画面，将2号泵（喷金模式）样品管道插入工艺用水试管中，管道末端准备接水的器皿。选择[清洗]使用工艺用水清洗3遍。待拿走接水的器皿后，选择[排液]直至管道内无水分。此时将2号泵样品管道插入试管中，按[加液]直至管道内充满cTnI标记抗体和H-FABP标记抗体标记的混合液。将处理好的金垫放在板面上的合适位置，按[运行]进入运行画面，按[开始]进行喷金。
喷金完毕，将2号泵样品管道插入工艺用水试管中，管道末端准备接水的器皿。选择[清洗]使用工艺用水清洗3遍。按[主菜单]的[气操作]开气至气压为零。
喷金处理后的金垫于鼓风干燥箱中在37℃下真空干燥60min至完全干燥。干燥处理后的结金垫置于铝箔袋中，加干燥剂室温保存备用。
配制检测线、对照线包被液：用包被缓冲液稀释cTnI包被抗体至终浓度为1.8 mg/mL，稀释H-FABP包被抗体至终浓度为1.4 mg/mL，分别将两种T线工作液4℃保存备用。
用包被缓冲液将羊抗鼠IgG多抗稀释至终浓度为3 mg/mL，得到对照线包被液即C线工作液，4℃保存备用。
点膜：将划线模块压下去，将喷金模块抬上来，形成一定的落差，防止喷金头触碰板面。
按[运行]进入运行画面，选择[程序]转换到划线工作模式。进入程序数据画面后选择好程序号，编辑好‘长度’、‘浓度’、‘速度’、‘原点X、Y、Z’等参数，其中‘速度’不可太快，为100 mm/s，修改好参数后，按[保存]保存数据，按[永久保存]将永久保存数据。
按[手动]进入手动画面，将1、3号泵（划线模式）样品管道插入工艺用水试管中，管道末端准备接水的器皿。选择[清洗]使用工艺用水清洗3遍。待拿走接水的器皿后，选择[排液]直至管道内无水分。此时将1号泵（划线模式）样品管道插入cTnI检测线包被液中，将3号泵（划线模式）样品管道插入H-FABP检测线包被液中，按[加液]直至管道内充满包被液。将准备好的粘贴有硝酸纤维素膜的PVC底板放在板面上的合适位置，按[运行]进入运行画面，按[开始]进行划线。
划线操作完毕，将1、3号泵样品管道插入工艺用水试管中，管道末端准备接水的器皿。选择[清洗]使用工艺用水清洗3遍。关闭3号泵。将1号泵（划线模式）样品管道插入对照线包被液中，按[加液]直至管道内充满包被液。将准备好的粘贴有硝酸纤维素膜的PVC底板放在板面上的合适位置，按[运行]进入运行画面，按[开始]进行划线。划线操作完毕，将1号泵样品管道插入工艺用水试管中，管道末端准备接水的器皿。选择[清洗]使用工艺用水清洗3遍。关闭点膜喷金仪。
划线完成后将粘有硝酸纤维素膜的聚氯乙烯底板置于干燥箱中，在37℃下干燥3小时至完全干燥。干燥完成后将所述聚氯乙烯底板置于铝箔袋中，加干燥剂室温保存备用。
6、组装切割、装配、包装
将样品垫、金垫、点膜的PVC底板和吸水膜组装在一起，使用自动斩切机切割成6mm试纸条。每张试纸条装配至塑料卡中，使用压壳机压紧。加入一个干燥剂后装入铝箔袋中保存，即为成品。
所述人体免疫缺陷病毒抗体检测试纸在硝酸纤维素膜的检测区固定了cTnI包被抗体、H-FABP包被抗体，在对照区固定了羊抗鼠IgG片断多抗，在聚酯纤维膜上预包被cTnI标记抗体和H-FABP标记抗体-胶体金。测试时，滴加120uL血清、血浆或全血（全血需再滴加一滴全血缓冲液）。水平放置，金垫上的cTnI标记抗体和H-FABP标记抗体-胶体金会溶解，与样本中的cTnI或H-FABP抗原结合在一起，形成“抗原-抗体-金”复合物，复合物沿着试纸条向后方移动，首先到达包被了cTnI包被抗体的检测区。如果样本中含有cTnI的抗原，“抗原-抗体-金”复合物将同包被抗体结合，并在检测线上滞留下来，形成一条淡红色的线，这表示阳性结果。线条颜色的深浅同样本中的抗体数量没有比例关系。该区里如果没有带颜色的线条表示样本中不含cTnI的抗原或抗原浓度低于本试纸最低检出限，游离的“抗原-抗体-金”复合物继续向试纸后方移动，到达试纸H-FABP包被抗体的检测区。如果样本中含有H-FABP的抗原，“抗原-抗体-金”复合物将同包被抗体结合，并在检测线上滞留下来，形成一条淡红色的线，这表示阳性结果。线条颜色的深浅同样本中的抗体数量没有比例关系。该区里如果没有带颜色的线条表示样本中不含H-FABP的抗原或抗原浓度低于本试纸最低检出限，游离的“抗原-抗体-金”复合物继续向试纸后方移动，。对照区包被了羊抗鼠IgG片断，固定在试纸条的对照线上。“抗原-抗体-金”复合物将同羊抗鼠IgG片断结合在一起而富集在对照线上，形成一条淡红色的线。对照线的出现证明试纸条检测功能正常。无论样本中是否含有cTnI或H-FABP抗原，在有效试验中，试纸条的对照区都应当出现淡红至紫色的对照线。样本继续移动，通过对照区进入吸收区。吸收区的作用是吸附剩余的“抗原-抗体-金”及样本复合物，使其在试纸条内移动，并消除本底的颜色。自试纸条插入稀释后的样本混合液起计时，15~20分钟内方可读取结果。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种心肌肌钙蛋白I和心型脂肪酸结合蛋白联检试纸的制备方法，其特征在于，包括步骤为：（1）将三羟甲基氨基甲烷、蔗糖、海藻糖和牛血清白蛋白溶于水并定容，调节pH值至8-9，得到金标稀释液，用0.01M磷酸二氢钠溶液调节0.01M磷酸氢二钠溶液的pH值至7-8，得到包被缓冲液；
（2）往搅拌的胶体金中加入0.2M碳酸钾，调节pH，加入待标记物并搅拌，再加入0.1g/mL牛血清白蛋白溶液，离心得到沉淀，所述沉淀用所述金标稀释液重悬至离心前体积的1/10，其中所述待标记物为cTnI 标记抗体时得到cTnI免疫金，所述待标记物为H-FABP 标记抗体时得到H-FABP免疫金；
（3）用包被缓冲液稀释cTnI 包被抗体和H-FABP包被抗体分别得到cTnI检测线包被液、H-FABP检测线包被液，用包被缓冲液稀释羊抗鼠IgG多抗得到对照线包被液；
（4）通过点膜喷金设备用cTnI 标记抗体和H-FABP 标记抗体标记的混合液对金垫喷金得到喷金的金垫，其中所述cTnI 标记抗体和H-FABP 标记抗体标记的混合液是由所述cTnI免疫金和所述H-FABP免疫金混合得到的，用所述cTnI检测线包被液、H-FABP检测线包被液和所述对照线包被液分别在粘有硝酸纤维素膜的聚氯乙烯底板上划线，得到点膜的聚氯乙烯底板；
（5）将样品垫、喷金的金垫、点膜的聚氯乙烯底板和吸水纸组装在一起，切割成人体免疫缺陷病毒抗体检测试纸。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述三羟甲基氨基甲烷、所述蔗糖、所述海藻糖、所述牛血清白蛋白和定容总体积的比例为0.24g：10g：5g：1g：100mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述金标稀释液的pH值用1M盐酸调节至8.5，所述包被缓冲液的pH值调节至7.4。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述胶体金是过滤过的，所述搅拌是置于磁力搅拌器上，往搅拌的胶体金中加入0.2M碳酸钾，调节pH并搅拌5min，加入待标记物并搅拌40min，再加入0.1g/mL牛血清白蛋白溶液，搅拌20min，在4℃、转速为10000r/min的条件下离心40分钟，沉淀用所述金标稀释液重悬至离心前体积的1/10，得到标记物。
5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述0.2M碳酸钾和所述cTnI标记抗体的比例为4ug/mL:12μg/mL，所述0.2M碳酸钾和所述H-FABP标记抗体的比例为3uL/mL:10μg/mL，所述牛血清白蛋白的加入量占总质量的1%。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述检测线包被液中所述cTnI包被抗体的浓度为1.8mg/mL，所述H-FABP包被抗体的浓度为1.4mg/mL，所述对照线包被液中所述羊抗鼠IgG多抗的浓度为3mg/mL。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述金垫采用聚酯纤维膜，在喷金前用金垫处理液浸泡10min后干燥，其中所述金垫处理液是Brij-35（十二烷基聚乙二醇醚）加入水中定容得到，所述Brij-35和定容总体积的比例为1g：100mL。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述样品垫采用玻璃纤维膜，在使用前用样品垫处理液浸泡10min后干燥，其中所述样品垫处理液是将比例为0.2g：1.21g：0.2g：0.5mL：25mg的酪蛋白、三羟甲基氨基甲烷、聚乙二醇20000、吐温80和鼠抗人红细胞抗体溶于水中定容。
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