CN103823057B - 一种猪hev总抗体胶体金快速诊断试纸条及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪HEV总抗体胶体金快速诊断试纸条及其制备方法，该猪HEV总抗体胶体金快速诊断试纸条包括：吸水玻璃纤维层、硝酸纤维素膜层、吸水滤纸层和白色塑料垫板；该猪HEV总抗体胶体金快速诊断试纸条的制备方法包括以下步骤：制备HEV包被抗原、HEV标记抗原、HEV标记抗原-胶体金；组装胶体金快速诊断试纸条。本发明可以用于猪戊型肝炎病毒总抗体检测，诊断操作简单，检测时间短，携带方便；为戊型肝炎病毒流行病学大规模调查提供相应的研究基础和技术保障；采用双抗原夹心法原理，包被抗原与血清中抗体产生特异性结合，结合抗原抗体复合物与标记抗原再次产生抗原抗体反应，两个抗原结合不同的抗原结合位点，特异性好，灵敏度高。

Description

一种猪HEV总抗体胶体金快速诊断试纸条及其制备方法
技术领域
本发明属于戊型肝炎病毒的检测技术领域，尤其涉及一种猪HEV总抗体胶体金快速诊断试纸条及其制备方法。
背景技术
戊型肝炎（HepatitisE）是一种由戊型肝炎病毒（HepatitisEvirs，HEV）引起的经消化道传播的人畜共患传染病。该病在青少年中容易发展为暴发性肝炎，可以导致孕妇流产，病死率高达21%。HEV分布广泛，危害严重。
世界各国相继都有猪源HEV相关的报道，与人类HEV序列比对结果发现两者具有极高的同源性，随后又发现提取的病毒RNA可以感染黑猩猩和恒河猴。随后，相继的实验结果表明猪戊型肝炎是一种人畜共患病，猪作为戊型肝炎病毒的主要自然宿主，HEV平均感染率最高可达83.4%，许多携带戊肝病毒的猪群并不表现发病状态(MengXJetal.，1997)。猪是人类重要的肉食来源，同时作为人类器官移植的主要供体，有效控制戊型肝炎就必须切断人-猪传播途径。这就凸现了猪戊型肝炎病毒的检测诊断的意义。HEV具有遗传的不稳定性和变异的特性，不同毒株之间的抗原表位也不尽相同。
由于嗜肝病毒本身的生物学特性，目前还没有成熟的体外细胞培养系统可以大量增殖病毒粒子，加上病毒本身对外界环境抵抗力弱，至今还没有开发出令人满意的戊型肝炎诊断试剂盒和疫苗。
HEV为RNA病毒，对HEVRNA的检测主要为采用PCR方法进行，但是由于各地所用引物不尽相同，检测结果不尽人意；而且由于病毒RNA在血液中存在时间较短，病毒含量低，RNA易于降解等因素，使得检测HEVRNA存在一定的困难。因此，目前对HEV的诊断主要通过检测血清中抗HEVIgG和抗HEVIgM来进行诊断。
目前，免疫学检测方法特异性高，敏感性强，简便快速等优点，成为HEV血清学检测最常用的方法，现在随着生物学技术的不断发展，可以采用基因工程方法表达相关蛋白来建立一系列血清学检测方法。本发明采用双抗原夹心法建立的猪戊型肝炎病毒总抗体胶体金检测试纸条，旨在快速准确高效的对猪血清中戊型肝炎病毒总抗体进行检测，从而建立一种灵敏度好、特异性高的免疫学检测方法，用于检测和评估猪群的HEV抗体水平，对于猪群戊型肝炎病毒的临床诊断和预防控制具有重要意义。
目前市场上戊型肝炎病毒的检测主要采用血清学ELISA检测法，此产品主要应用于人血清抗体的检测，还没有相关产品用于猪HEV抗体的检测，猪作为戊型肝炎病毒的主要自然宿主，由于缺乏相关可行的检测产品，暂时也没有猪群HEV抗体水平的检测报告。猪源HEV与人类HEV序列具有极高的同源性，且其病毒RNA还可以感染黑猩猩和恒河猴等其它动物，为了弥补这一技术空白，开发了猪源HEV总抗体胶体金快速诊断试纸条。克服了现有试剂盒只能特异性检测人戊型肝炎病毒的不足，该产品为第一个专门用于检测动物戊型肝炎总抗体的免疫产品系列。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种猪HEV总抗体胶体金快速诊断试纸条及其制备方法，旨在解决现有戊型肝炎病毒的试剂盒只能特异性检测人戊型肝炎病毒，而不能检测猪源的戊型肝炎病毒的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种猪HEV总抗体胶体金快速诊断试纸条的制备方法，该猪HEV总抗体胶体金快速诊断试纸条的制备方法包括以下步骤：
第一步，HEV包被抗原的制备：
首先PCR扩增猪源swCH189株HEVORF2基因部分的两个片段，上下游引物分别带有BamHⅠ和NotⅠ酶切位点；FS为S片段上游引物，带有BamHⅠ酶切位点，RS为片段下游引物，带有NotⅠ酶切位点；FP12为P12片段上游引物，带有BamHⅠ酶切位点，RP12为片段下游引物，带有NotⅠ酶切位点；
PCR片段扩增后回收，采用BamHⅠ和NotⅠ双酶切，连接到pMD18-T载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子，小提质粒，用BamHⅠ和NotⅠ酶切鉴定，鉴定阳性克隆分别命名为T-S和T-P12；
将pET32a（+）与鉴定的克隆质粒分别以BamHⅠ/NotⅠ进行消化，进行琼脂糖电泳，胶回收目的片段后进行连接，构建可在大肠杆菌中表达的重组质粒，命名pET-S和pET-P12，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子，小提质粒，用BamHⅠ和NotⅠ限制性内切酶进行酶切鉴定；
阳性重组质粒pET-S和pET-P12转化Rossetta(DE3)感受态细胞，挑选单克隆菌落于氨苄西林钠LB培养液中培养10h，菌液以1:100的比例加入到1L含100μg/ml氨苄西林钠的LB培养基37℃振荡培养至OD600=0.8，加入的终浓度为0.5mmol/L的IPTG，25℃诱导5h，4℃6000r/min离心15分钟收集菌体，菌体采用20ml1%TritonX-100的PBS悬浮，超声波破碎，4℃12000r/min离心30分钟，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，分析确定表达产物在大肠杆菌的存在形式，结果发现重组蛋白以包涵体的形式存在。
目的蛋白进行SDS-PAGE，命名为S蛋白，纯化的S蛋白为包被抗原；
第二步，HEV标记抗原的制备：
将阳性克隆pET-P12于Amp+LB培养液中培养10h，菌液以1:100的比例加入到1L含100μg/ml氨苄西林钠的LB培养基37℃振荡培养至OD600=0.8，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，25℃诱导5h，4℃6000r/min离心15分钟收集菌体，菌体采用20ml1%TritonX-100的PBS悬浮，超声波破碎，4℃12000r/min离心30分钟，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，确定表达产物以包涵体的形式存在于沉淀，通过蛋白的纯化得到的蛋白命名为P12蛋白，为标记蛋白；
第三步，胶体金的制备，具体包括以下步骤：
首先将HauC14先配制成0.01％水溶液，取100ml于磁力加热搅拌器上加热至沸腾，加入1ml1%柠檬酸三钠水溶液，边加热边搅拌，继续加热煮沸15min，观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色，全过程2～3min，冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积；
第四步，HEV抗原-胶体金标记物的制备，具体包括以下步骤：
首先采用紫外分光光度计在OD595测定标记抗原P12的蛋白浓度；
取10ml胶体金，边搅拌边缓慢加入100μl的0.1MCBpH10调节pH至7.6，继续搅拌至完全混匀；标记抗原P12按10μg/ml进行标记，继续搅拌至完全混匀，静置20min；加入0.5ml封闭液，室温下封闭15分钟，封闭液为0.5%BSA，20mMPB，150MmNaCl，0.1%稳定剂T，0.01%Proclin300，；12000r/min离心20分钟，吸出上清，收集沉淀；沉淀中加入1/2体积的金标洗液，超声混匀；12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀，金标洗液为20mMPB，150mMNaCl，1%BSA，0.01%NaN3；超声混匀三次，最后收集的沉淀采用pH7.4的胶体金悬浮液，超声混匀后于4℃保存，胶体金悬浮液为20mMPB，150mMNaCl，1%BSA，2%Twee-20，0.2%Sucrose，0.01%Proclin300；
第五步，试纸条的组装：
胶体金悬浮液将金标抗原标记物6倍稀释，均匀的铺于普通无纺布，加入入量以加入液体开始向外流出为止，于55度烘箱干燥2小时后4℃存放；
金标悬浮液将S抗原稀释至1.2mg/ml，将对照抗体稀释至0.6mg/ml后用喷膜机喷涂在NC膜上形成检测线和控制线，置37℃烘箱烘烤20～30min。
进一步，在第一步中，蛋白纯化采用Invitrogeneclonetech蛋白纯化柱，具体步骤如下：
步骤一，准备1L表达菌体细胞，取5ml菌液12000r/min离心2min，弃去上清，加入1mmol/LPH7.4的PBS充分悬浮，4℃6000r/min离心15min，保留沉淀，如此反复离心3次；
步骤二，沉淀于-70℃放置5min，之后取出溶化；如此反复冻融循环3～5次，以实现最大的裂解；
步骤三，加入100μl的1×FastBreakTMcellLysisReagent溶液于沉淀中，充分悬浮；
步骤四，加入1μl的DNaseⅠ，室温下200r/min摇震30min；
步骤五，加入30μl的Ni-Particles或加入0.03g的NaCl固体；
步骤六，采用移液器反复吸吹混合10次后，室温静置孵育30min；
步骤七，将EP管放入碳磁力架上30s，镍柱被吸附到靠近磁力架的一边，用移液器将剩余的液体吸出来；
步骤八，加入150μl的Bind/WashBuffer，反复吸吹混合10次，室温静置孵育10min，之后放入磁力架30s，将剩余的液体吸出来，采用同样的液体反复洗两遍，最后一次的液体务必吸干净，不要有残留；
步骤九，加入100μl的ElutionBuffer，多次混合吹打后于磁力架上作用30s后保留不同菌体蛋白的液体并分别标号，同时将纯化的蛋白和各自的镍柱进行蛋白电泳分析结果。
本发明实施例的另一目的在于提供一种硝酸纤维素膜、检测线、质控线、样本垫、吸水垫、金标垫、PVC板；
检测线和质控线设置在硝酸纤维素膜的左右两侧，吸水垫和金标垫设置在硝酸纤维素膜上方的两侧，样本垫设置在金标垫上，PVC板设置在硝酸纤维素膜的下方。
进一步，该猪HEV总抗体胶体金快速诊断试纸条的使用方法：
首先在样本垫上的反应孔处加入10μl的全血、血清或血浆，让样品完全吸收融入圆孔里的样品垫内，在方孔上方1cm处垂直地拿着缓冲瓶，在试剂盒底部的方孔内加入2滴缓冲液，加缓冲液15分钟内读结果，在测试区域内出现粉红色线的痕迹就表明阳性结果，超过15分钟后读取的结果将认为是无效的，必须要重做。
进一步，该猪HEV总抗体胶体金快速诊断试纸条检测300份猪血清，灵敏度为98.1%，特异性为98.5%，准确率为96.6%。
本发明提供的猪HEV总抗体胶体金快速诊断试纸条及其制备方法，采用双抗原夹心法来检测猪血清中的HEV总抗体，利用连接于固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子上两个抗原结合位点结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原免疫复合物，由于反应系统中固相抗原和酶标抗原的量相对于待测抗体是过量的，因此复合物的形成量与待测抗体的含量成正比(在方法可检测范围内)，测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗体含量。本发明可以用于猪戊型肝炎病毒总抗体的检测，诊断操作简单，检测时间短，携带方便；为戊型肝炎病毒流行病学大规模调查提供相应的研究基础和一定的技术保障，更好的预防和控制HEV疾病的流行；采用双抗原夹心法原理，包被抗原与血清中抗体产生特异性结合，结合抗原抗体复合物与标记抗原再次产生抗原抗体反应，两个抗原结合不同的抗原结合位点，特异性好，灵敏度高。
附图说明
图1是本发明实施例提供的猪HEV总抗体胶体金快速诊断试纸条的结构示意图；
图中：1、硝酸纤维素膜；2、检测线；3、质控线；4、样本垫；5、吸水垫；6、金标垫；7、PVC板；
图2是本发明实施例提供的猪HEV总抗体胶体金快速诊断试纸条的制备方法流程图；
图3是本发明实施例提供的S基因的PCR扩增示意图；
图中：M:DL2000marker；1:S基因扩增片段；
图4是本发明实施例提供的P12基因的PCR扩增示意图；
图中：M:λ-EcoT14Ⅰdigestmarker；1:P12基因扩增片段；
图5是本发明实施例提供的S基因的酶切鉴定示意图；
图中：M:DL2000marker；1:S基因酶切鉴定片段；
图6是本发明实施例提供的P12基因的酶切鉴定示意图；
图中：M:DL2000marker；1:P12基因酶切鉴定片段；
图7是本发明实施例提供的His-S蛋白的SDS-PAGE分析示意图；
图8是本发明实施例提供的His-S蛋白纯化示意图；
图9是本发明实施例提供的His-P12蛋白的SDS-PAGE分析示意图；
图10是本发明实施例提供的His-P12蛋白纯化示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
如图1所示，本发明实施例的猪HEV总抗体胶体金快速诊断试纸条主要由吸水玻璃纤维层、硝酸纤维素膜层、吸水滤纸层和白色塑料垫板组成；硝酸纤维素膜1、检测线2、质控线3、样本垫4、吸水垫5、金标垫6、PVC板7组成；
检测线2和质控线3设置在硝酸纤维素膜1的左右两侧，吸水垫5和金标垫6设置在硝酸纤维素膜1上方的两侧，样本垫4设置在金标垫6上，PVC板7设置在硝酸纤维素膜1的下方；
P12抗原和阳性样本包被硝酸纤维素膜产生的T线（检测线）和C线（质控线）；硝酸纤维素膜上方为抗原标金后铺布的无纺布，即金标垫，金标垫上方为样本垫；硝酸纤维素膜下方为吸水垫，从左至右样本垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫紧密的排列在PVC板上；
本发明的使用方法：
首先在样本垫上的反应孔处加入10μl的全血、血清或血浆，让样品完全吸收融入圆孔里的样品垫内，在方孔上方1cm处垂直地拿着缓冲瓶，在试剂盒底部的方孔内加入2滴缓冲液，加缓冲液15分钟内读结果，在测试区域内出现粉红色线的痕迹就表明阳性结果，超过15分钟后读取的结果将认为是无效的，必须要重做。
检测结果判断：
阳性：反应板孔中质控线端出现粉红色线，检测线端出现粉红色线，为猪HEV总抗体阳性；
阴性：反应板孔中质控线端出现粉红色线，检测线端不出现粉红色线，为猪HEV总抗体阴性。
失效：反应板孔中质控线端不出现粉红色线，或质控线端、检测线端均不出现粉红色线，为试剂盒失效。
如图2所示，本发明实施例的猪HEV总抗体胶体金快速诊断试纸条的制备方法包括以下步骤：
S101：制备HEV包被抗原；
S102：制备HEV标记抗原；
S103：制备胶体金；
S104：HEV抗原-胶体金标记物的制备；
S105：组装胶体金快速诊断试纸条。
以下结合本发明的具体实施例对本发明做进一步的说明：
第一步，HEV包被抗原的制备：
首先PCR扩增猪源swCH189株HEVORF2（兰州兽医研究所传染病室保存)基因部分的两个片段，上下游引物设计如表1和表2所示，分别带有BamHⅠ和NotⅠ酶切位点；
表1：swCH189株S片段设计引物为：
FS为S片段上游引物，带有BamHⅠ酶切位点，RS为片段下游引物，带有NotⅠ酶切位点；
表2：swCH189株P12片段为328aa-End，设计引物为：
FP12为P12片段上游引物，带有BamHⅠ酶切位点，RP12为片段下游引物，带有NotⅠ酶切位点；
PCR片段扩增后回收，采用BamHⅠ和NotⅠ双酶切，连接到pMD18-T载体（大连宝生物，货号D103A），将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子，小提质粒，用BamHⅠ和NotⅠ酶切鉴定，鉴定合适的阳性克隆分别命名为T-S和T-P12；如图3和图4所示；
将pET32a（+）（兰州兽医研究所传染病室保存）与鉴定合适的克隆质粒分别以BamHⅠ/NotⅠ进行消化，进行琼脂糖电泳，胶回收目的片段后进行连接，构建可在大肠杆菌中表达的重组质粒，命名pET-S和pET-P12，将连接产物转化大肠杆菌DH5α（大连宝生物，货号9027），挑取转化子，小提质粒，用BamHⅠ（大连宝生物，货号1605）和NotⅠ限制性内切酶（大连宝生物，货号1166A）进行酶切鉴定，如图5和图6所示；
阳性重组质粒pET-S和pET-P12转化Rossetta(DE3)感受态细胞（北京康为世纪生物，货号CW0811A），挑选单克隆菌落于氨苄西林钠(上海生工生物工程技术服务有限公司，货号A0339)LB培养液中培养10h，菌液以1:100的比例加入到1L含100μg/ml氨苄西林钠的LB培养基37℃振荡培养至OD600=0.8左右，加入的终浓度为0.5mmol/L的IPTG(invitrogen，货号AM9464)，25℃诱导5h，4℃6000r/min离心15分钟收集菌体，菌体采用20ml1%TritonX-100的PBS悬浮，超声波破碎，4℃12000r/min离心30分钟，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，分析确定表达产物在大肠杆菌的存在形式，结果发现重组蛋白主要以包涵体的形式存在；
蛋白纯化采用Invitrogeneclonetech蛋白纯化柱，纯化步骤如下：
1)准备1L表达菌体细胞，取5ml菌液12000r/min离心2min，弃去上清，加入1mmol/LPH7.4的PBS充分悬浮，4℃6000r/min离心15min，保留沉淀，如此反复离心3次；
(2)沉淀于-70℃放置5min，之后取出溶化；
如此反复冻融循环3～5次，以实现最大的裂解；
(3)加入100μl的1×FastBreakTMcellLysisReagent溶液于沉淀中，使其充分悬浮；
(4)加入1μl的DNaseⅠ，室温下200r/min摇震30min；
(5)加入30μl的Ni-Particles，根据实验需要可以适当多加入一些，同时为了提高镍柱的结合能力，也可以加入0.03g的NaCl固体；
(6)采用移液器反复吸吹混合大约10次后，室温静置孵育30min；
(7)将EP管放入碳磁力架上大约30s，可以清楚的看到镍柱被吸附到靠近磁力架的一边，用移液器将剩余的液体吸出来；
(8)加入150μl的Bind/WashBuffer，反复吸吹混合约10次，室温静置孵育10min，之后放入磁力架30s，将剩余的液体吸出来，采用同样的液体反复洗两遍，最后一次的液体务必吸干净，不要有残留；
(9)加入100μl的ElutionBuffer，多次混合吹打后于磁力架上作用30s后保留不同菌体蛋白的液体并分别标号，同时将纯化的蛋白和各自的镍柱进行蛋白电泳分析结果；
目的蛋白进行SDS-PAGE，条带与预期大小相一致，命名为S蛋白，S蛋白为本发明的包被抗原，如图7和图8所示；
第二步，HEV标记抗原的制备：
将阳性克隆pET-P12于Amp+LB培养液中培养10h，菌液以1:100的比例加入到1L含100μg/ml氨苄西林钠的LB培养基37℃振荡培养至OD600=0.8左右，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，25℃诱导5h，4℃6000r/min离心15分钟收集菌体，菌体采用20ml1%TritonX-100的PBS悬浮，超声波破碎，4℃12000r/min离心30分钟，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，确定表达产物主要以包涵体的形式存在于沉淀，后续纯化步骤与pET-S一样，纯化得到的蛋白命名为P12蛋白，为本发明的标记蛋白，如图9和图10所示；
第三步，胶体金的制备，具体包括以下步骤：
首先将HauC14先配制成0.01％水溶液，取100ml于磁力加热搅拌器上加热至沸腾，加入1ml1%柠檬酸三钠水溶液，边加热边搅拌，继续加热煮沸15min，观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色，全过程约2～3min，冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积；
第四步，HEV抗原-胶体金标记物的制备，具体包括以下步骤：
首先采用紫外分光光度计测定在OD595测定标记抗原P12的蛋白浓度；
取10ml胶体金，边搅拌边缓慢加入100μl的0.1MCBpH10调节pH至7.6，继续搅拌至完全混匀；标记抗原P12按10μg/ml进行标记，继续搅拌至完全混匀，静置20min；加入0.5ml封闭液（0.5%BSA，20mMPB，150mMNaCl，0.1%稳定剂T，0.01%Proclin300)室温下封闭15分钟；12000r/min离心20分钟，吸出上清，收集沉淀；沉淀中加入1/2体积的金标洗液（20mMPB，150mMNaCl，1%BSA，0.01%NaN3），超声混匀；12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀；超声混匀三次，最后收集的沉淀采用pH7.4的胶体金悬浮液(20mMPB，150mMNaCl，1%BSA，2%Twee-20，0.2%Sucrose，0.01%Proclin300)，超声混匀后于4℃保存；
第五步，试纸条的组装：
胶体金悬浮液将金标抗原标记物6倍稀释，均匀的铺于普通无纺布，加入量以加入液体开始向外流出为止，于55度烘箱干燥2小时后4℃存放；
金标悬浮液将S抗原稀释至1.2mg/ml，将对照抗体稀释至0.6mg/ml后用喷膜机喷涂在NC膜上形成检测线和控制线，置37℃烘箱烘烤20～30min；
整个检测条由1层吸水玻璃纤维、1层硝酸纤维素膜、吸水滤纸及白色塑料垫板组成。
本发明检测300份猪血清，其灵敏度为98.1%，特异性为98.5%，准确率为96.6%。
本发明的胶体金快速诊断试纸条产品可以用于猪戊型肝炎病毒总抗体的检测；胶体金诊断操作简单，检测时间短，携带方便。为戊型肝炎病毒流行病学大规模调查提供相应的研究基础和一定的技术保障，更好的预防和控制HEV疾病的流行；采用双抗原夹心法原理，包被抗原与血清中抗体产生特异性结合，结合抗原抗体复合物与标记抗原再次产生抗原抗体反应，两个抗原结合不同的抗原结合位点，特异性好，灵敏度高。
本发明涉及双抗原夹心免疫检测法，免疫检测方法为目前生物学检测方法中用途最为广泛的方法之一。具有特异性好，灵敏度高的特点。通过抗原抗体反应的特异性从而检测待检样本中的抗原或抗体，常用的方法有间接法、夹心法(包括双抗原夹心法和双抗体夹心法)、捕获法、竞争法等。
本发明猪HEV总抗体胶体金快速诊断试纸条，采用双抗原夹心法来检测猪血清中的HEV总抗体。双抗原夹心法是利用连接于固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子上两个抗原结合位点结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原免疫复合物。由于反应系统中固相抗原和酶标抗原的量相对于待测抗体是过量的，因此复合物的形成量与待测抗体的含量成正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗体含量。
标记颗粒除胶体金外，还有胶体硒、乳胶颗粒及纳米磁珠等，胶体金类试剂组成部分还包括硝酸纤维素膜、上样垫、吸样垫和支撑物(PVC板)等。检测时，血清样本滴入上样垫中，样本扩散到干燥胶体金垫上，若样本中含有猪HEV抗体，则猪HEV抗体即与标记于胶体金上的HEVP12抗原反应形成抗原抗体复合物，并在NC膜上层析，当层析到包被抗原处时，膜上的HEVS抗原会和复合物再次发生抗原抗体反应，使复合物聚集在包被线上，当聚集到一定数量时，即形成肉眼可见的聚集线。若样本中不含有抗HEV抗体，则不能形成复合物，也不能被包被线上抗原所捕获，不能形成肉眼可见的T线。除此之外，检测试剂还包被有质控线(C线)。C线作为产品的内控标准，阳性和阴性样本检测时均会出现，作为判断试剂是否有效的标志。此方法检测待测样品具有简单快速，稳定性好，成本低等优势。
本发明根据猪源HEVORF2蛋白结构信息，将猪源HEVORF2进行两个抗原片段原核表达，S结构域蛋白和P12结构域蛋白。胶体金试纸条中，S蛋白纯化后作为包被抗原，P12蛋白纯化后进行胶体金标记作为标记抗原。
目前市场上已有人戊型肝炎病毒的相关的试剂盒，但是本发明与其不同之处在于，采用猪源swCH189株HEV毒株（兰州兽医研究生传染病室提供），根据HEV病毒蛋白结构现有的研究成果，通过采用相关生物学软件分析其衣壳蛋白结构，并成功表达不同的衣壳蛋白片段。经过不同实验方法的研究及探索，筛选出最佳实验方法及抗原组合，建立了一种快速高效检测猪HEV总抗体胶体金快速诊断方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种猪戊型肝炎病毒总抗体胶体金快速诊断试纸条的制备方法，其特征在于，该猪戊型肝炎病毒总抗体胶体金快速诊断试纸条的制备方法包括以下步骤：
第一步，戊型肝炎病毒包被抗原的制备：
首先PCR扩增猪源swCH189株戊型肝炎病毒ORF2基因部分的两个片段，上下游引物分别带有BamHⅠ和NotⅠ酶切位点；FS为S片段上游引物，带有BamHⅠ酶切位点，RS为片段下游引物，带有NotⅠ酶切位点；FP12为P12片段上游引物，带有BamHⅠ酶切位点，RP12为片段下游引物，带有NotⅠ酶切位点；
FS的序列为5'-CGCGGATCCGACACTGCACCCGTA-3'，132-146；RS的序列为5'-ATTTGCGGCCGCTAGGTGTCAAGTT-3'，316-327；FP12的序列为5'-CGCGGATCCGGTAATACTAAT-3'，328-340；RP12的序列为5'-ATTTGCGGCCGCTATACTCCCGGGTTTT-3'，665-674；
PCR片段扩增后回收，采用BamHⅠ和NotⅠ双酶切，连接到pMD18-T载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子，小提质粒，用BamHⅠ和NotⅠ酶切鉴定，鉴定阳性克隆分别命名为T-S和T-P12；
将pET32a(+)与鉴定的克隆质粒分别以BamHⅠ/NotⅠ进行消化，进行琼脂糖电泳，胶回收目的片段后进行连接，构建可在大肠杆菌中表达的重组质粒，命名pET-S和pET-P12，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子，小提质粒，用BamHⅠ和NotⅠ限制性内切酶进行酶切鉴定；
阳性重组质粒pET-S和pET-P12转化Rossetta(DE3)感受态细胞，挑选单克隆菌落于氨苄西林钠LB培养液中培养10h，菌液以1:100的比例加入到1L含100μg/ml氨苄西林钠的LB培养基37℃振荡培养至OD600＝0.8，加入的终浓度为0.5mmol/L的IPTG，25℃诱导5h，4℃6000r/min离心15分钟收集菌体，菌体采用20ml1％Triton-X-100的PBS悬浮，超声波破碎，4℃12000r/min离心30分钟，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，分析确定表达产物在大肠杆菌的存在形式，结果发现重组蛋白以包涵体的形式存在；
目的蛋白进行SDS-PAGE，命名为S蛋白，纯化的S蛋白为包被抗原；
第二步，戊型肝炎病毒标记抗原的制备：
将阳性克隆pET-P12于Amp+LB培养液中培养10h，菌液以1:100的比例加入到1L含100μg/ml氨苄西林钠的LB培养基37℃振荡培养至OD600＝0.8，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，25℃诱导5h，4℃6000r/min离心15分钟收集菌体，菌体采用20ml1％TritonX-100的PBS悬浮，超声波破碎，4℃12000r/min离心30分钟，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE，确定表达产物以包涵体的形式存在于沉淀，通过蛋白的纯化得到的蛋白命名为P12蛋白，为标记蛋白；
第三步，胶体金的制备，具体包括以下步骤：
首先将HauCl4先配制成0.01％水溶液，取100ml于磁力加热搅拌器上加热至沸腾，加入1ml1％柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液，边加热边搅拌，继续加热煮沸15min，观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色，全过程2～3min，冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积；
第四步，戊型肝炎病毒抗原-胶体金标记物的制备，具体包括以下步骤：
首先采用紫外分光光度计在OD595测定标记抗原P12的蛋白浓度；
取10ml胶体金，边搅拌边缓慢加入100μl的0.1MCBpH10调节pH至7.6，继续搅拌至完全混匀；标记抗原P12按10μg/ml进行标记，继续搅拌至完全混匀，静置20min；加入0.5ml封闭液，室温下封闭15分钟，封闭液为0.5％BSA，20mMPB，150MmNaCl，0.1％稳定剂T，0.01％Proclin300，12000r/min离心20分钟，吸出上清，收集沉淀；沉淀中加入1/2体积的金标洗液，超声混匀；12000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀，金标洗液为20mMPB，150mMNaCl，1％BSA，0.01％NaN3；超声混匀三次，最后收集的沉淀采用pH7.4的胶体金悬浮液悬浮，超声混匀后于4℃保存，胶体金悬浮液为20mMPB，150mMNaCl，1％BSA，2％Tween-20，0.2％Sucrose，0.01％Proclin300；
第五步，试纸条的组装：
胶体金悬浮液将金标P12抗原标记物6倍稀释，均匀的铺于普通无纺布，加入量以加入液体开始向外流出为止，于55度烘箱干燥2小时后4℃存放；
金标悬浮液将S抗原稀释至1.2mg/ml，将对照抗体稀释至0.6mg/ml后用喷膜机喷涂在NC膜上形成检测线和控制线，置37℃烘箱烘烤20～30min。
2.如权利要求1所述的猪戊型肝炎病毒总抗体胶体金快速诊断试纸条的制备方法，其特征在于，在第一步中，蛋白纯化采用Invitrogeneclonetech蛋白纯化柱，具体步骤如下：
步骤一，准备1L表达菌体细胞，取5ml菌液12000r/min离心2min，弃去上清，加入1mmol/LpH7.4的PBS充分悬浮，4℃6000r/min离心15min，保留沉淀，如此反复离心3次；
步骤二，沉淀于-70℃放置5min，之后取出溶化；如此反复冻融循环3～5次，以实现最大的裂解；
步骤三，加入100μl的1×FastBreakTMcellLysisReagent溶液于沉淀中，充分悬浮；
步骤四，加入1μl的DNaseⅠ，室温下200r/min/min摇震30min；
步骤五，加入30μl的Ni-Particles或加入0.03g的NaCl固体；
步骤六，采用移液器反复吸吹混合10次后，室温静置孵育30min；
步骤七，加EP管放入碳磁力架上30s，镍柱被吸附到靠近磁力架的一边，用移液器将剩余的液体吸出来；
步骤八，加入150μl的Bind/WashBuffer，反复吸吹混合10次，室温静置孵育10min，之后放入磁力架30s，将剩余的液体吸出来，采用同样的液体反复洗两遍，最后一次的液体务必吸干净，不要有残留；
步骤九，加入100μl的ElutionBuffer，多次混合吹打后于磁力架上作用30s后保留不同菌体蛋白的液体并分别标号，同时将纯化的蛋白和各自的镍柱进行蛋白电泳分析结果。
3.一种如权利要求书1所述猪戊型肝炎病毒总抗体胶体金快速诊断试纸条的制备方法的猪戊型肝炎病毒总抗体胶体金快速诊断试纸条，其特征在于，该猪戊型肝炎病毒总抗体胶体金快速诊断试纸条包括：硝酸纤维素膜、检测线、质控线、样本垫、吸水垫、金标垫、PVC板；
检测线和质控线设置在硝酸纤维素膜的左右两侧，吸水垫和金标垫设置在硝酸纤维素膜上方的两侧，样本垫设置在金标垫上，PVC板设置在硝酸纤维素膜的下方。
4.如权利要求3所述的猪戊型肝炎病毒总抗体胶体金快速诊断试纸条，其特征在于，该猪戊型肝炎病毒总抗体胶体金快速诊断试纸条检测300份猪血清，灵敏度为98.1％，特异性为98.5％，准确率为96.6％。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104101706B (zh) * 2014-07-28 2016-05-18 国家纳米科学中心 一种检测甲流抗原的胶体金免疫层析试纸条及检测甲流抗原的方法
CN104391118B (zh) * 2014-11-12 2017-03-15 深圳市锦瑞生物科技有限公司 降钙素原的检测装置、以及检测材料的制备方法
CN108318683B (zh) * 2018-03-27 2019-04-16 中国农业科学院蜜蜂研究所 一种快速诊断以色列急性麻痹病毒试纸及其应用
CN110927374A (zh) * 2019-12-02 2020-03-27 昆明理工大学 检测戊型肝炎病毒IgG抗体的胶体金试纸条及其制备方法
CN111875677A (zh) * 2020-07-07 2020-11-03 杭州傲锐生物医药科技有限公司 一种犬细小病毒vp2蛋白重组抗原、其编码基因及其表达和应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1000168A2 (en) * 1997-07-18 2000-05-17 The United States of America, as represented by the Secretary Department of Health and Human Services A swine hepatitis e virus and uses thereof
WO2002089733A2 (en) * 2001-05-07 2002-11-14 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant orf2 proteins of the swine hepatitis e virus and their use as a vaccine and as a diagnostic reagent for medical and veterinary applications
CN101034090A (zh) * 2006-03-08 2007-09-12 中国药品生物制品检定所 戊型肝炎病毒抗体以及利用所述抗体检测戊型肝炎病毒的方法和试剂盒
CN101216492A (zh) * 2008-01-10 2008-07-09 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 快速检测猪伪狂犬抗体的试纸条及其制备方法
CN101587122A (zh) * 2009-06-24 2009-11-25 吉林大学 一种猪血凝性脑脊髓炎病毒胶体金抗原检测试纸条及其制备方法
CN101620230A (zh) * 2009-08-11 2010-01-06 无锡益达生物技术有限公司 一种乳制品中β-内酰胺酶的金标试剂盒及制备方法
KR20100043714A (ko) * 2008-10-21 2010-04-29 건국대학교 산학협력단 돼지 Ｅ형 간염바이러스의 ｃａｐｓｉｄ 단백질 및 그를 코딩하는 유전자
CN101710120A (zh) * 2009-12-14 2010-05-19 上海市农业科学院 稳定剂海藻糖在猪戊肝诊断试剂盒中的应用
CN101726595A (zh) * 2009-12-24 2010-06-09 上海市农业科学院 猪戊型肝炎病毒elisa诊断试剂盒的制备方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1000168A2 (en) * 1997-07-18 2000-05-17 The United States of America, as represented by the Secretary Department of Health and Human Services A swine hepatitis e virus and uses thereof
WO2002089733A2 (en) * 2001-05-07 2002-11-14 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant orf2 proteins of the swine hepatitis e virus and their use as a vaccine and as a diagnostic reagent for medical and veterinary applications
CN101034090A (zh) * 2006-03-08 2007-09-12 中国药品生物制品检定所 戊型肝炎病毒抗体以及利用所述抗体检测戊型肝炎病毒的方法和试剂盒
CN101216492A (zh) * 2008-01-10 2008-07-09 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 快速检测猪伪狂犬抗体的试纸条及其制备方法
KR20100043714A (ko) * 2008-10-21 2010-04-29 건국대학교 산학협력단 돼지 Ｅ형 간염바이러스의 ｃａｐｓｉｄ 단백질 및 그를 코딩하는 유전자
CN101587122A (zh) * 2009-06-24 2009-11-25 吉林大学 一种猪血凝性脑脊髓炎病毒胶体金抗原检测试纸条及其制备方法
CN101620230A (zh) * 2009-08-11 2010-01-06 无锡益达生物技术有限公司 一种乳制品中β-内酰胺酶的金标试剂盒及制备方法
CN101710120A (zh) * 2009-12-14 2010-05-19 上海市农业科学院 稳定剂海藻糖在猪戊肝诊断试剂盒中的应用
CN101726595A (zh) * 2009-12-24 2010-06-09 上海市农业科学院 猪戊型肝炎病毒elisa诊断试剂盒的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
猪戊型肝炎病毒ORF2基因的原核表达及单克隆抗体的制备;常晓依;《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》;20111115;12-21 *

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