CN101034090A - 戊型肝炎病毒抗体以及利用所述抗体检测戊型肝炎病毒的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种针对HEV ORF2抗原的单克隆抗体，以及使用竞争ELISA与所述单克隆抗体的抑制率小于50％，优选的小于25％的单克隆抗体。本发明还涉及一种抗体组合物，其中含有至少一种前述单克隆抗体；一种使用双抗体夹心ELISA方法检测HEV抗原的试剂盒，其含有前述抗体组合物；以及利用前述抗体组合物通过双抗体夹心ELISA方法检测样品中HEV抗原的体外方法。本发明还涉及所述抗体组合物用于检测HEV抗原的用途。
Description
发明领域
本发明涉及一种针对HEV ORF2抗原的单克隆抗体，以及使用竞争ELISA与所述单克隆抗体的抑制率小于50％，优选的小于25％的单克隆抗体。本发明还涉及一种抗体组合物，其中含有至少一种前述单克隆抗体；一种使用双抗体夹心ELISA方法检测HEV抗原的试剂盒，其含有前述抗体组合物；以及利用前述抗体组合物通过双抗体夹心ELISA方法检测样品中HEV抗原的体外方法。本发明还涉及所述抗体组合物用于检测HEV抗原的用途。
背景技术
戊型肝炎病毒(HEV)为肠道传播非甲非乙型肝炎(EntericallyTransmitted non-A，non-B hepatitis，ET-NANBH)的主要病原体。过去认为，戊型肝炎主要流行于非洲和亚洲等不发达地区，随着近年来对戊型肝炎病毒(HEV)研究的深入以及相关检测手段的完善，在欧洲、美国和日本越来越多的非输入性HE病例见诸报道，HEV的流行情况远比先前想象的严重，因此HEV病毒的检测工作越来越得到重视。
流行病学研究表明，从感染HEV到出现临床症状的时间在15-60天左右，病程持续时间1-6周。而在实验感染中，志愿者感染HEV后大约36天出现临床症状。
现有的戊型肝炎病原学检测主要有以下几种方法：
1.免疫学检测
免疫学检测方法针对抗HEV抗体，主要采用酶联免疫检测方法，检测血清中的抗HEV IgM、IgA和IgG抗体。
由于HEV抗体的不同型别对于HEV感染的检测具有不同的意义，故HEV抗体检测试剂需要针对抗HEV的不同型别抗体分别进行检测。目前的HEV IgG检测试剂采用间接法，这种方法特异性不高，而且抗HEV IgG抗体在感染后持续时间很长，因此，仅仅检测IgG抗体不能有效的区分既往感染、近期感染和急性感染。此外，抗HEV IgG抗体在非流行地区阳性率为1-5％，但在HEV流行地区25岁以上人群中阳性率可达40％，对戊型肝炎急性感染的诊断存在一定的干扰作用，
IgM抗体作为急性感染和/或近期感染的标志，具有比IgG更高的诊断价值。IgM抗体作为感染后最早出现的抗体，存在亲和力和特异性低的缺点，IgM抗体的这种特性决定了HEV IgM抗体检测试剂存在敏感性和特异性都较低的缺点。
而且目前的IgM检测试剂多采用间接法或捕获法，Yu et al建立的捕获法的灵敏度高于经典间接法，但人体内IgM-类风湿因子和抗HEV IgG的同时存在可能引起假阳性，因为IgM-类风湿因子可以和抗HEV IgG的Fc段桥联，通过对样品进行稀释来提高试剂的特异性，但这样做的同时又降低了试剂的敏感性。
Chau et al认为，IgA抗体也可以作为HEV近期或急性感染的标志抗体，虽然IgA抗体阳性持续时间与在HEV感染诊断中的意义还有待临床和流行病学研究的进一步证实。
目前，国际上公认的HEV抗体ELISA检测试剂为Genelab公司和Abott公司的HEV抗体检测试剂盒，它们均采用HEV 1型和2型抗原为检测抗原。
2.分子生物学检测
分子生物学检测是指使用RT-PCR方法检测血清、粪便和组织等样本中的HEV病毒基因组RNA。然而，作为肠道传播病毒，HEV病毒血症持续时间很短，许多病人就医时已度过病毒血症期或已接近末期，血液中的病毒RNA拷贝数很低，难以通过RT-PCR检出，这种情况在医药卫生条件不发达的发展中国家尤其突出。粪便排毒虽然持续时间略长于病毒血症，但样品采集困难，易受污染且粪便中可能存在影响PCR的物质。目前报道的RT-PCR在HE病人中检出的阳性率存在很大的差别，从30％至80％不等，这可能与样品采集时间、样品保存情况、引物匹配、PCR条件和其它不确定因素有关。因此，目前检测HEV RNA的RT-PCR诊断方法仅用于实验室研究，还没有商品化的试剂被临床采用。
已知HEV在感染机体后进行复制，产生足够量病毒后可引起肝组织的损伤，临床上表现为肝炎症状，实验室检测则会显示相关酶类呈异常反应，为显性感染；有些感染者机体内虽也有病毒的复制，但没有引起典型的临床症状，为隐性感染。无论是显性还是阴性感染，在感染的早期机体内均存在HEV，如果检测手段足够灵敏，在此期间可检出HEV的核酸和抗原。随着感染过程的进展，病毒可诱发机体产生免疫反应，首先诱导感染者产生抗HEV IgM抗体，并持续一定时间，在IgM产生以后IgG也会随着产生，并持续较长的时间，同时也会产生IgA抗体。随着抗体的产生，机体内病毒的滴度也会逐步降低，最后彻底清除。检测IgM抗体以及IgG抗体的动态变化可以诊断HEV的急性感染，但在抗体产生以前，HEV的病毒核酸和抗原就已经存在，因此检测HEV病毒核酸和抗原可达到更早期诊断的目的。
目前有些实验室已发展了HEV核酸检测技术，但其操作繁杂、技术要求高、容易污染、成本较高等缺点限制了其广泛应用。如果开发研制技术要求比较低的抗原检测方法，将会为HEV感染的早期诊断提供很重要的工具。
为了及时准确检测HEV感染，长期以来一直迫切需要更为灵敏和准确的快速检测方法。为了解决上述问题，本发明人通过采用HEV ORF2作为抗原免疫小鼠，筛选针对所述HEV抗原的单克隆抗体，获得了能够以高灵敏度直接检测样品中存在的微量HEV抗原的试剂盒，从而实现了在HEV感染早期进行准确检测。
发明概述
本发明一方面，涉及一种针对HEV ORF2抗原的单克隆抗体。
本发明的另一方面还涉及使用竞争ELISA与本发明所述单克隆抗体的抑制率小于50％，优选的小于25％的单克隆抗体。。
本发明的另一方面，还涉及一种抗体组合物，其中含有至少一种前述单克隆抗体。
本发明的再一方面，涉及一种用于双抗体夹心ELISA方法检测HEV抗原的试剂盒，其中含有前述抗体组合物。
本发明的又一方面，涉及利用前述抗体组合物通过双抗体夹心ELISA方法检测样品中HEV抗原的体外方法。
本发明还涉及所述抗体组合物用于检测HEV抗原的用途。
发明详述
现已确认的HEV基因组共存在3个开放读码框(ORF 1-3)。ORF1(约28-5106nt)编码HEV病毒最大的蛋白，该蛋白约186kDa，包括至少4个结构区。到目前为止只有很少实验室能够表达完整的ORF1蛋白，分段表达的ORF1蛋白多应用于功能学研究，目前ORF1片段仅在HEV抗体Western印迹检测试剂中应用，ELISA检测试剂中很少使用。
ORF2基因长1980bp(约5147nt-7126nt)，编码分子量约为72kDa的病毒衣壳蛋白。ORF2蛋白有一个111氨基酸的信号序列和三个可能用于分泌表达的潜在的糖基化位点。在HEV感染中抗ORF2蛋白抗体具有重要意义，虽然HEV的感染机理仍未阐明，但作为HEV衣壳蛋白的ORF2蛋白在感染过程中很可能扮演着与宿主细胞膜上的受体结合并诱发病毒脱壳和进入细胞的角色，因此目前已经发现的多数中和抗体都为抗ORF2蛋白抗体。
目前用于抗体检测的ORF2蛋白主要来源于昆虫细胞系统表达的完整ORF2蛋白和大肠杆菌系统表达的ORF2蛋白片段，但不同的抗原表现出不同的抗体结合能力，比如ORF2蛋白片段比ORF2蛋白全长能更有效的结合恢复期病人血清中的抗HEV抗体。使用合成肽对ORF2蛋白的抗原性研究过程中，发现ORF2蛋白的12-147、381-504和573-660区域存在较多的能够与HE病人血清反应的抗原表位，这些区域适合于HEV抗体检测试剂的构建。
ORF3编码HEV病毒的一个小磷酸化蛋白，分子量约为13.5kDa。它同被称为AMBP的肝细胞骨架蛋白相互作用。ORF3蛋白较小，其含有的抗原表位也相对较少，目前已经发现的3个ORF3蛋白抗原表位(31-40、63-76和105-122)均为线性表位，其中ORF3蛋白的C`端，特别是105-122aa，抗原性较高，HE病人中针对该表位的抗体阳性率较高，目前的抗体诊断试剂中多包括ORF3蛋白的部分片段。
为了获得直接检测HEV抗原的高灵敏度检测方法，本发明人使用HEV ORF2免疫小鼠，常规方法制备杂交瘤细胞，使用免疫原包被ELISA板进行检测和筛选，共制备24株杂交瘤细胞用于进一步筛选。
除非另外定义，这里所用的所有技术和科学名词都表达的是在本发明涉及领域里的熟练技术人员所理解的通常含义。这里所用的命名和在细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。
抗体包含通过二硫键连接在一起的多肽链集合体。称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个的恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。
“重链可变区”是指一种多肽，(1)其长度为110至125个氨基酸；(2)其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，“轻链可变区”是指一种多肽，(1)其长度为95至115个氨基酸；(2)其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。
所用的术语Fab、Fc、F(ab)2及Fv各有其标准的免疫学含义(见Klein，免疫学，John Wiley，New York，1982；Parham，Chapter14，in Weir，ed.免疫化学，4th Ed.，Blackwell Scientific Publishers，Oxford，1986)。
本发明的一方面，涉及一种针对HEV ORF2抗原的单克隆抗体。
在本发明的一个实施方案中，采用已知技术建立本发明的杂交瘤细胞系。该方法通常包括一种可持久传代的细胞系与一种可产生所需抗体的B淋巴细胞融合。从注射了靶抗原的哺乳动物来获得适当淋巴细胞的技术是熟知的。一般说来，如果需要人的细胞，可使用外周血淋巴细胞；如果需要非人类哺乳动物细胞，则使用脾细胞或淋巴结细胞。给宿主哺乳动物重复注射纯化的抗原，并使该哺乳动物产生所需的抗体生成细胞，然后收集这些细胞与可持久传代的细胞系进行融合。细胞融合技术也是本领域内熟知的。一般包括将细胞与融合剂如聚乙二醇混合。用标准方法如HAT选择法选择杂交瘤细胞。使用ELISA法等标准的免疫分析法分析这些杂交瘤的培养基以选择出分泌所需抗体的杂交瘤。使用标准的蛋白质纯化技术由培养基中回收抗体。在应用任一种上述技术时有许多文献可供参考(Kohler等人，杂交瘤技术(Hybridoma Techniques)，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork，1980；Tijssen，酶免疫检测的实践与理论(Practice andTheory of Enzyme Immunoassays)，Elsevier，Amsterdam，1985；等等)。
抗体片段的应用和产生也是熟知的。如Fab片段(Tijssen，酶免疫检测的实践与理论，Elsevier，Amsterdam，1985)和Fv片段(Hochman等人，生物化学(Biochemistry)，12：1130-1135，1973；Sharon等人，生物化学，15：1591-1594，1976；Ehrlich等人，美国专利4470925)。此外，可借助已知技术用本发明的这些化合物和组合物构建双特异性抗体，如通过杂交瘤的进一步融合(即形成所谓四重杂交瘤)(Quadromas)(Reading，美国专利4474493)或半分子的化学再连接(Brennan等人，科学(Science)，229：81-83，1985)。
还可用重组方法制得本发明杂交瘤特有的抗体和抗体片段。利用本领域熟知的方法可方便地从本发明杂交瘤中获得编码本发明单克隆抗体的编码序列，尤其是重链的可变区序列和轻链的可变区序列。本领域内熟练的技术人员可方便地利用这些编码序列分析出对于单克隆抗体结合特异性重要的氨基酸区域，如存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定簇互补区域(CDR)CDR1、CDR2和CDR3，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域。利用这些氨基酸序列，用重组方法可制得具有与单克隆抗体相同或相似特异结合能力的多肽，如将抗体重链可变区基因与轻链可变区基因顺序连接表达而成的单链抗体(ScFv)；将抗体重链可变区基因与轻链可变区基因或CDRs基因置换到人类抗体的相应位置，表达出更接近于人类抗体而又具有原单克隆抗体结合特异性的人源单克隆抗体；等等。
根据上述方法，本发明人利用戊型肝炎病毒ORF2免疫小鼠，制备单克隆抗体。根据布达佩斯条约，本发明人已于2005年12月30日将分泌本发明所述单克隆抗体的杂交瘤细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)，分别为：保藏号为CCTCC-C0200519的杂交瘤细胞系HEV-NICPBP04、保藏号为CCTCC-C0200520的杂交瘤细胞系HEV-NICPBP07和保藏号为CCTCC-C0200521的杂交瘤细胞系HEV-NICPBP58。
根据本发明制备的各个单克隆抗体及其结合活性片段，本领域技术人员可获得编码所述单克隆抗体或其结合活性片段的核苷酸序列，以及根据遗传密码子的简并性产生的不同变体。根据本发明公开的内容，本领域技术人员可用多种方法制备包含上述核苷酸序列之重组表达载体，以及由所得重组表达载体转化的宿主细胞。宿主细胞的选择和转化为本领域技术人员周知，只要其能够表达本发明所述的单克隆抗体或其结合活性片段。
本发明的另一方面还涉及使用竞争ELISA与本发明所述单克隆抗体的抑制率小于50％，优选的小于25％的单克隆抗体。。所述单克隆抗体即为与本发明上述杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体识别相同或相似表位的单克隆抗体。
本领域普通技术人员知晓，可通过选择性标记，并对标记后抗体滴定，竞争ELISA测定对位点的识别。在本发明的一个实施方案中，本发明人通过改良过碘酸钠方法对抗体进行选择性HRP标记。标记后的抗体浓度稀释至50μg/ml，使用免疫原包被的ELISA板进行滴定，滴定过程中对标记的抗体进行倍比稀释。根据单克隆抗体的分组和标记抗体情况，对分组后抗体做竞争ELISA检测，相似单克隆抗体是否识别相同或相似的抗原表位。与竞争抗体浓度相同的无关单克隆抗体作为阴性对照，与竞争抗体浓度相同与标记抗体同株的未标记抗体作为阳性对照。37℃孵育1小时后，洗板，TMB显色，450nm处读取A值，计算竞争抗体对标记抗体的抑制率。公式如下：
抑制率＝(A竞争-A阳性/A阴性-A阳性)×100％
如抑制率≥75％为两株单克隆抗体所识别位点完全不相关；≥50％＜75％为不完全相关；≥25％＜50％为相关；＜25％为完全相关。
本发明的另一方面，还涉及一种抗体组合物，其中含有至少一种由保藏号为CCTCC-C0200519的杂交瘤细胞系HEV-NICPBP04、保藏号为CCTCC-C0200520的杂交瘤细胞系HEV-NICPBP07和保藏号为CCTCC-C0200521的杂交瘤细胞系HEV-NICPBP58所分泌的单克隆抗体。在本发明的一个具体实施方案中，所述抗体组合物同时含有为CCTCC-C0200519的杂交瘤细胞系HEV-NICPBP04、保藏号为CCTCC-C0200520的杂交瘤细胞系HEV-NICPBP07和保藏号为CCTCC-C0200521的杂交瘤细胞系HEV-NICPBP58所分泌的单克隆抗体，优选的所述抗体的比例为2∶5∶2。
本发明的再一方面，涉及一种用于双抗体夹心ELISA方法检测HEV抗原的试剂盒，所述试剂盒中包含诊断有效量的至少一种本发明的单克隆抗体或其结合活性片段，或本发明前述的抗体组合物。本领域技术人员知晓，适当地，该试剂盒中还应当包括适当的载体，缓冲剂/液，和用于检测所产生信号的试剂如市售的第二抗体，及使用说明书。
本领域技术人员知晓，对于固相反应检测而言，可以将本发明所述单克隆抗体固定于固相载体，也可以将待测样品固定于固相载体上。反应通常在室温下进行一段时间，检测过程中需要洗涤不与本发明所述单克隆抗体结合的样品的步骤。
对于液相反应而言，通常可以向处在特定缓冲体系中的待测样品直接加入本发明所述单克隆抗体，然后在适于抗原抗体发生相互作用的温度下，例如室温下，反应一段时间。
本发明组合物中所涉及的第二抗体的选择取决于本发明单克隆抗体的来源。本领域技术人员知晓，如何根据单克隆抗体的来源选择相应的第二抗体。本发明所述第二抗体可以是放射性同位素标记的，包括但不限于使用选自：32P、125I、S、2H等；也可以是非放射性同位素标记的，包括但不限于使用选自：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、链霉亲和素等标记。本发明所述检测方法中使用的检测剂，取决于检测过程使用的第二抗体的标记物。本领域技术人员知晓如何选择合适的检测试剂。
本发明的又一方面，涉及利用前述抗体组合物通过双抗体夹心ELISA方法检测样品中HEV抗原的体外方法。在本发明的一个实施方案中，所述方法包括如下步骤：
1)采用同时含有CCTCC-C0200519的杂交瘤细胞系HEV-NICPBP04、保藏号为CCTCC-C0200520的杂交瘤细胞系HEV-NICPBP07和保藏号为CCTCC-C0200521的杂交瘤细胞系HEV-NICPBP58所分泌的单克隆抗体，优选的，所述抗体的比例为2∶5∶2，的抗体组合物，作为捕获抗体包被酶标板；
2)向包被有捕获抗体的酶标板条中加入使用含5％牛血清PBST10倍稀释的待测血清，孵育，洗涤；
3)加入羊抗HEV多抗，孵育，洗涤；
4)然后加入生物素标记兔抗羊IgG抗体，孵育，洗涤；
5)再加入HRP标记亲和素，孵育，洗涤；
6)加入底物显色。
本发明还涉及所述抗体组合物用于检测HEV抗原的用途。
下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
实施例1 杂交瘤细胞系的产生
取6～8周龄雌性Balb/c小鼠，初次免疫每只小鼠肌肉注射用福氏完全佐剂乳化的5μg抗原(总体积50μl)。15天后进行二次基础免疫，方法为取相同量的抗原用福氏不完全佐剂乳化，肌肉注射。30天后，尾静脉加强注射5μg不加佐剂的抗原，并于加强免疫后72小时，杀死小鼠，收集血液，取脾制备脾细胞悬液(悬于RPMI1640培养基中)，细胞计数板细胞计数。按1/6于脾细胞的数量取培养的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞，混合后离心，利用聚乙二醇(PEG 1500)使脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。将细胞悬液与等体积的饲养细胞混合后，分置于96孔细胞培养板中(200μl/孔)于5％二氧化碳培养箱(ESPEC BNA-311)37℃培养。3天后，用HT培养基(黄嘌呤(hypoxanthn，H)1.361mg+胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)0.388mg，加RPMI1640(GIBCO公司)培养基至100mL。45～50℃条件下溶解后，过滤除菌。)半保留换液。7天后，用NE2重组抗原包被板，利用如下述酶联免疫吸附法(ELISA)检测96孔细胞培养板中所得杂交瘤细胞上清培养液。对于ELISA检测为阳性的细胞克隆，利用有限稀释法进行克隆化。
ELISA检测法
经HPLC纯化的抗原，溶解于0.05mol/L碳酸包被缓冲液(20.02gNa2CO3，2.52g NaHCO3加去离子水至1升，pH为9.5)中，浓度约为0.3μg/ml，在96孔聚乙烯微量滴定板的各孔表面上吸附2小时(37℃)，再置于4℃过夜。用PBS-吐温洗涤液(8.0g NaCl、0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O、0.2g KCl和0.5ml吐温20，加去离子水至1升，pH为7.4)洗涤滴定板以除去未结合的抗原蛋白。然后用200μl/孔的封闭液(1×PBS溶液，组成同前)中加入2％明胶、0.2％酪蛋白和2％蔗糖)37℃封闭2小时。甩净、拍干后真空封闭，4℃保存。
检测时，于每孔中加入100μl细胞培养液上清；每块96孔微量滴定板设一阳性对照，加入100μl小鼠多抗血清(1∶100稀释使用)；另设一阴性对照，加入100μlHT细胞培养液。37℃温浴30分钟，用PBS-吐温洗涤液洗5遍，拍干后加入过氧化物酶结合的羊抗鼠免疫球蛋白(HRP-GAM Ig，DAKO公司)，37℃温浴30分钟，取出后用PBS-吐温洗涤液洗5遍，拍干后先后加入底物液A、B各50μl(底物液A成分为：显色液A成分为：13.42g Na2HPO4·12H2O、4.2g柠檬酸·H2O和0.3g过氧化氢，用去离子水中调节体积为700ml；显色液B成分为：0.2g四甲基联苯胺、20ml二甲基甲酰胺用去离子水中调节体积为700ml)，37℃显色10分钟，加入50μl终止液(2M H2SO4)终止反应，并于酶标仪上检测各孔的OD450值，通常以OD450值高于阴性对照2倍以上者视为阳性。
单克隆抗体腹水的获得及纯化
取10周龄的健康Balb/c小鼠，腹腔注射福氏不完全佐剂，每只0.5ml。2～7天后，收集克隆化的杂交瘤细胞，离心去上清，加入不含血清的培养基，调节细胞密度至2×105～2×106个/ml，每只小鼠注射0.5ml。7～10天后小鼠腹部增大，开始收集腹水。3000rpm离心15分钟，吸取中间澄清部分的液体，0.45μm的微孔滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存。
将处理好的腹水用0.02mol/L、pH7.4的PBS(81ml 0.2mol/LNa2HPO4，19ml 0.2mol/L NaH2PO4，加生理盐水至100ml)对倍稀释，搅拌下逐滴缓慢加入硫酸铵(浓度达到50％饱和度)，4℃过夜。4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀溶于原腹水体积2倍的PBS中。搅拌下逐滴缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵浓度达到33％饱和度，4℃静置过夜。4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，将沉淀溶于原腹水体积2倍的PBS中。搅拌下逐滴缓慢加入硫酸铵，(浓度达到50％饱和度)，4℃过夜。4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清。将沉淀溶于适量的PBS中，装入透析带中，放入50～100倍含20mmol/L NaCl，pH7.8的120mmol/L Tris-HCl缓冲液中4℃搅拌下脱盐12小时左右，期间更换3次以上透析液。取出后分装-20℃保存。
以上述方法，筛选出了24株分泌抗HEV-ORF2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
实施例2单克隆抗体的制备、纯化、纯度鉴定
小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml/只，一周后，预处理小鼠腹腔注射杂交瘤细胞106/只，诱生腹水，一周后抽取含单克隆抗体的腹水，收集腹水3000g离心30分钟，吸取上清，-70℃冻存备用。
采集的腹水采用辛酸-饱和硫酸胺沉淀法纯化单克隆抗体，纯化后采用紫外分光光度法测定单克隆抗体浓度，并采用SDS-PAGE电泳分析纯化单克隆抗体纯度。
实施例3抗原和抗体包被及封闭
使用96孔聚苯乙烯板(Polystyrene microtiter plates，Maxisorp F96，Nunk Laboratories，Glostrup，Denmark)进行包被，使用0.05M NaHCO3缓冲液(pH9.6)将抗体稀释至合适浓度，抗原稀释为2.5μg/ml，每孔加入100μl，37℃2小时，用pH7.4的含0.1％Tween PBS(PBST)洗涤3遍后，每孔加入含20％牛血清的包被缓冲液200μl，37℃封闭2小时，PBST洗涤3遍后，保存于4℃备用。
间接ELISA
间接ELISA中，使用含5％牛血清的PBST将待检抗体稀释至合适浓度，加入包被有抗原的微孔板中，100μl/孔，37℃孵育1小时，PBST洗涤5遍。然后每孔加入100μl使用含5％牛血清PBST1：5000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育30分钟后，PBST洗涤五遍，加入TMB底物，37℃显色15分钟。在波长450nm处读取各孔A值。
ELISA板使用2.5μg/ml免疫原包被，二抗采用HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，使用间接法对纯化的单克隆抗体进行亲和力粗测，纯化单克隆抗体均稀释至浓度为10μg/ml，向下倍比稀释至0.3ng/ml，平行双孔，每板设阴性对照两孔，使用无关鼠源单克隆抗体作为阴性对照。TMB显色后，450nm读取A值。绘制同一单克隆抗体不同浓度下A值与浓度的折线图，并计算四参数曲线，由四参数曲线计算A50时单克隆抗体浓度，以A50浓度代表该株单克隆抗体的亲和力。结果见表1
表1单克隆抗体对抗原的亲和力测定
| 编号 | A50 | 编号 | A50 | 编号 | A50 | 编号 | A50 |
| 2347815 | 3.2×1051.766.116.871.629.8 | 172024262729 | 1.925.034.3386.267.5555.4 | 344044505256 | 0.721436.81752.522.212.132.3 | 586772809097 | 1.6×10-432.915.511.827.523.4 |
实施例4采用竞争ELISA测定所述单克隆抗体的识别表位
竞争ELISA：
根据标记抗体的滴定结果，将标记抗体浓度稀释至A值约为2.00左右，同时将竞争抗体浓度稀释为标记抗体现浓度的10倍。竞争抗体和标记抗体各50ul加入微孔板中，平行双孔测定。与竞争抗体浓度相同的无关单抗作为阴性对照，与竞争抗体浓度相同与标记抗体同株的未标记抗体作为阳性对照。37℃孵育1小时，PBST洗涤5次，加入TMB底物缓冲液显色，波长450nm，读取A值，计算竞争抗体对标记抗体的抑制率。
抑制率＝(A竞争-A阳性/A阴性-A阳性)×100％
改良过碘酸钠方法对本发明所述单克隆抗体进行选择性HRP标记，分别标记：4、7、8、15、26、27、29、34、40、44、52、56、58、72、80和97号抗体。标记后的抗体浓度稀释至50μg/ml，使用免疫原包被的ELISA板进行滴定，滴定过程中对标记的抗体进行倍比稀释。根据单克隆抗体的分组和标记抗体情况，对分组后抗体做竞争ELISA检测相似单克隆抗体是否识别相同或相似抗原表位。计算竞争抗体对标记抗体的抑制率：
抑制率＝(A竞争-A阳性/A阴性-A阳性)×100％
如抑制率≥75％为两株单克隆抗体所识别位点完全不相关；≥50％＜75％为不完全相关；≥25％＜50％为相关；＜25％为完全相关。表2：竞争ELISA结果
| 配对 | 抑制率(％) | 配对 | 抑制率(％) | 配对 | 抑制率(％) |
| 2-723-7250-722-803-8029-8040-8044-8072-802-29 | 88048920104114912040 | 3-2940-2944-292-4040-4456-9790-9756-90 | 1045143107415-4-13 | 26-6724-2617-5234-584-78-720-720-84-8 | 58861926566082 |
注：配对中后面一个抗体为标记抗体
根据竞争抑制结果和分组的情况：
23株单克隆抗体中识别位点完全相关的为：
3-50-72-80；40-44；56-90-97；26-67；17-52；34-58；8-20
识别位点相关的为：
2-29；40-44-29
识别位点不完全相关的为：
40-44-29；8-7；20-7
实施例5使用HEV1型、4型和猪源HEV攻毒后2周的猴血清选择适宜的包被抗体
LAB间接夹心法ELISA
包被有单克隆抗体的酶标板条中加入使用含5％牛血清PBST 10倍稀释的待测血清，37℃孵育2小时，PBST洗涤3遍。加入羊抗HEV多抗，37℃孵育1小时，PBST洗涤5遍，加入生物素标记兔抗羊IgG抗体，37℃孵育30分钟后，PBST洗涤5遍，再加入HRP标记亲和素，37℃孵育30分钟后，PBST洗涤5遍，加入TMB底物，37℃显色15分钟。在波长450nm处读取各孔A值。
为了确定适于包被的单克隆抗体，分别使用10μg/ml的单克隆抗体包被EILSA板，采用LAB间接夹心法ELISA对20倍稀释的HEV1型，4型和猪源HEV攻毒后2周的猴血清进行检测，选取能够同时检出3种不同HEV的11株抗体进行进一步的筛选。
表3：不同单克隆抗体作为包被抗体时对1、4和猪型HEV攻毒后猴血清检测的S/Co值
| 编号 | 2 | 3 | 4 | 7 | 8 | 15 | 17 | 20 |
| HEV1HEV4HEVs | 0.90.40.7 | 1.15.15.0 | 9.010.19.8 | 8.913.413.7 | 1.812.910.2 | 13.614.613.9 | 15.315.415.4 | 5.99.08.4 |
| 编号 | 24 | 26 | 27 | 29 | 34 | 40 | 44 | 50 |
| HEV1HEV4HEVs | 0.70.60.6 | 1.54.75.9 | 0.60.30.5 | 1.00.40.6 | 8.19.38.9 | 1.00.50.7 | 1.00.50.7 | 5.18.87.8 |
| 编号 | 52 | 56 | 5 8 | 67 | 72 | 80 | 90 | 97 |
| HEV1HEV4HEVs | 1.014.913.0 | 0.91.01.1 | 1.63.72.9 | 4.04.74.7 | 1.02.21.6 | 0.80.50.6 | 1.02.42.4 | 1.11.41.2 |
实施例6.最适包被抗体-单克隆抗体的筛选
使用佑安医院收集的抗HEV IgG和IgM双阳血清27份，对选择的11株单克隆抗体进行进一步的筛选。，最终确定5株适于包被的单克隆抗体分别为4、7、15、34、58号。结果见表4
表4：不同单克隆抗体作为包被抗体时对佑安医院收集的27份抗HEVIgG和IgM双阳血清检测的S/Co值
实施例7.包被抗体组合物的选择
选择合适的单克隆抗体进行了包被单克隆抗体的搭配选择，对不同单克隆抗体的搭配比例进行摸索，对单克隆抗体的包被浓度进行摸索，对27份临床样本进行重新测定。
根据以上单克隆抗体对27份血清的反应性确定了6个组合，使用总浓度为10μg/ml的以上单克隆抗体组合的等浓度混合物包被ELISA板，LAB间接夹心法检测上述27份临床血清，根据检测结果，确定58-4-7组合最检出率最高。结果见表5。
表5不同抗体组合对佑安医院收集的27份抗HEV IgG和IgM双阳血清检测的S/Co值
实施例8.包被抗体组合物最佳配比的选择
对58-4-7组合中各个单克隆抗体比例进行摸索，总浓度为10μg/ml，将总浓度分为9份，分别检测58-4-7不同搭配比例情况下对佑安医院收集的27份抗HEV IgG和IgM双阳血清中的7份具有代表性血清的检测效果。最终确定58-4-7搭配比例为2∶5∶2。结果见表6。
表6.58-4-7抗体组合物中不同搭配比例情况下对7份代表性血清检测的S/Co值
| 7∶1∶1 | 6∶1∶2 | 6∶2∶1 | 5∶1∶3 | 5∶2∶2 | 5∶3∶1 | 4∶1∶4 |
| 4.81.55.10.50.81.90.4 | 4.51.24.20.61.02.00.4 | 5.11.75.00.71.22.90.5 | 6.21.65.00.51.11.90.4 | 6.41.86.20.71.32.20.4 | 6.42.26.40.81.33.10.4 | 7.52.66.60.81.32.50.5 |
| 4∶2∶3 | 4∶3∶2 | 4∶4∶1 | 3∶1∶5 | 3∶2∶4 | 3∶3∶3 | 3∶4∶2 |
| 6.72.46.40.71.42.30.5 | 7.42.57.20.81.43.00.5 | 7.82.57.30.81.52.70.5 | 6.52.16.70.61.33.00.6 | 7.22.88.40.91.83.00.6 | 7.43.18.31.01.83.90.5 | 10.73.710.81.02.04.40.7 |
| 3∶5∶1 | 2∶1∶6 | 2∶2∶5 | 2∶3∶4 | 2∶4∶3 | 2∶5∶2 | 2∶6∶1 |
| 7.82.98.20.91.54.00.6 | 9.63.08.30.81.94.00.7 | 9.13.08.00.81.53.30.6 | 8.63.39.50.71.94.60.7 | 10.04.111.41.02.15.40.7 | 10.95.012.91.12.65.80.8 | 8.13.07.30.91.53.90.6 |
| 1∶1∶7 | 1∶2∶6 | 1∶3∶5 | 1∶4∶4 | 1∶5∶3 | 1∶6∶2 | 1∶7∶1 |
| 9.93.89.20.81.83.70.8 | 8.73.98.80.91.93.10.8 | 9.74.09.10.91.43.30.8 | 10.13.59.40.81.63.00.8 | 9.03.08.00.51.03.80.7 | 9.43.311.61.02.23.90.7 | 11.63.911.31.01.43.71.0 |
实施例9.最适包被浓度的确定
按照单克隆抗体58-4-7比例为2∶5∶2包被ELISA板，包被浓度分别为20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml和1.25μg/ml，对30份血清进行重新测定，根据阳性样品检出率和阴性A值，确定最合适的包被浓度为5μg/ml。
Claims (10)
1.一种针对HEV ORF2抗原的单克隆抗体，其为：
1)HEV-NICPBP04，由保藏号为CCTCC-C200519的杂交瘤分泌；
2)HEV-NICPBP07，由保藏号为CCTCC-C200520的杂交瘤分泌；和
3)HEV-NICPBP58，其特征在于由保藏号为CCTCC-C200521的杂交瘤分泌。
2.一种针对HEV ORF2抗原的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体与权利要求1的单克隆抗体的竞争性ELISA抑制率小于50％，优选的小于25％。
3.一种抗体组合物，其中含有至少一种权利要求1或2中的单克隆抗体。
4.权利要求3的抗体组合物，其由权利要求1中所述的单克隆抗体HEV-NICPBP04、HEV-NICPBP07和HEV-NICPBP58组成。
5.权利要求4的抗体组合物，其中单克隆抗体HEV-NICPBP04、HEV-NICPBP07和HEV-NICPBP58的比例为2∶5∶2。
6.一种用于双抗体夹心ELISA方法检测HEV抗原的试剂盒，其特征在于含有权利要求3的抗体组合物。
7.一种利用双抗体夹心ELISA方法检测样品中HEV抗原的体外方法。
8.权利要求7的方法，其中所述抗体组合物由单克隆抗体HEV-NICPBP04、HEV-NICPBP07和HEV-NICPBP58组成。
9.权利要求7的方法，其中所述抗体组合物中单克隆抗体HEV-NICPBP04、HEV-NICPBP07和HEV-NICPBP58的比例为2∶5∶2。
10.权利要求3的抗体组合物用于检测HEV抗原的用途。
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