CN111239393A - 一种检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法 - Google Patents

一种检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法，属于免疫学技术领域，将灭活抗原以及破乳后口蹄疫灭活疫苗进行蛋白电泳，从而将抗原或疫苗中大小不同的蛋白进行分离，然后做WB，根据出现的条带与标准对照，从而判断抗原或疫苗中是否含有NSPs以及NSPs的组分。本发明，特异性强，灵敏度高，操作简单，在普通实验室就可操作，非常适合于在口蹄疫生产厂家使用，为口蹄疫生产厂家在抗原纯化以及制定标准化流程提供技术指导。

Description

一种检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体地，涉及一种检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法。
背景技术
口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的，以感染猪、牛、羊等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触传染性动物疫病。FMDV属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，编码4种结构蛋白（SPs：VP4，VP2，VP3和VP1）和10种非结构蛋白（NSPs：L，2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D，3AB，3ABC）。我国口蹄疫防控主要采取疫苗免疫、扑杀感染和可疑动物以及血清监测的综合性防控措施来控制口蹄疫的流行，其中在疫苗免疫中主要使用灭活疫苗，而灭活疫苗所用的抗原为浓缩纯化抗原。理论上来说只有感染FMDV的动物，体内才存在NSPs抗体，而免疫动物体内不存在NSPs抗体。所以区分口蹄疫感染与免疫主要依赖于检测NSPs抗体。但由于抗原纯化工艺的问题，灭活疫苗抗原中仍会残留少量的NSPs。因此在疫苗免疫地区进行NSPs检测时，NSPs抗体不仅能在口蹄疫感染动物中检测到，而且也能在一些多次疫苗免疫的动物体内检测到。因此，世界动物卫生组织（OIE）对口蹄疫疫苗的纯净度制定了标准，具体是：至少用8头牛免疫两次，首免后21-30天后进行第二次免疫，第二次免疫后的30-60天检测牛体内NSPs抗体。其中有一头检测为NSPs抗体阳性是可以接受的；若超过两头检测为NSPs抗体阳性，则这批疫苗是不合格；若两头检测为NSPs抗体阳性，厂家有权要求进行复检。然而，动物实验即费钱又费时，如果有一批疫苗不能满足纯度要求，厂家必须将整批苗弃掉。
目前我国还没有检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法，并且一般检测方法不能确定抗原或疫苗中具体有哪几种NSPs，以及各组分所占的比例。
发明内容
针对目前口蹄疫灭活疫苗纯净度检测所面临的问题，本发明的目的是提供一种检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法，并通过该方法分析NSPs的组分。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
一种检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法，步骤如下：
（1）制样：对待测口蹄疫灭活疫苗进行破乳，分离水相，然后加入上样缓冲液后进行煮样；对待测灭活抗原直接加入上样缓冲液后进行煮样；
（2）蛋白电泳：制备蛋白胶，上样，加入SDS-PAGE电泳缓冲液进行电泳；
（3）WB：用甲醇激活PVDF膜后，按转膜顺序将胶和PVDF膜组装好后置于电转槽中进行转膜；转膜完毕后，将PVDF膜进行封闭，并与酶标抗体孵育；
（4）与酶标抗体孵育反应后，将PVDF膜洗涤后与化学发光液反应，进行曝片或扫膜；
（5）定性以及组分分析：将待测抗原或疫苗中出现条带的位置与标准对照中出现条带的位置进行比较，从而确定待测抗原或疫苗中是否存在NSPs以及NSPs的组分。
进一步地，步骤（1）中所述破乳是采用正戊醇、正丁醇或水浴法进行破乳。更进一步地，采用正戊醇进行破乳时，灭活疫苗和正戊醇的体积比为9.5:0.5-9:1，破乳时间为1-3h；采用正丁醇进行破乳时，灭活疫苗和正丁醇的体积比为9.5:0.5，破乳时间为1 h；采用水浴法进行破乳时，温度为60℃-98℃，时间为0.5h。
进一步地，步骤（1）中所述的4×上样缓冲液中所含的组分及其浓度分别为：250mM 且pH6.8的Tris-HCl、质量浓度为10%的 SDS、质量浓度为0.5% 的BPB、体积分数为50%的甘油和体积分数为5% 的β-巯基乙醇。
作为优选，步骤（2）中所述的蛋白胶的下层胶浓度为10%-15%，上样量为10-20 μL，电泳程序为80V 30 min、120V 90 min。
进一步，步骤（2）所述的SDS-PAGE电泳缓冲液中含有的组分及其浓度分比为：15.1g /L 的Tris、94 g/L 的Glycine和5.0 g/L 的SDS。
作为优选，步骤（3）中所述转膜采用的程序为90V 90 min。
进一步，步骤（3）所述转膜所采用的转膜缓冲液中所含有的组分及其浓度分别为：2.8 g/L的 Tris、2.9 g/L 的Glycine、0.37 g/L 的SDS和体积分数为20%的甲醇；所述封闭所采用的封闭液中所含有的组分及其浓度分别为：质量浓度为 5%的脱脂奶粉、体积分数为0.1% 的proclin-300。
进一步地，步骤（3）中所述酶标抗体为偶联HRP的识别3B的单抗。
进一步地，步骤（4）中所述洗涤所采用的洗涤液为含有体积浓度为0.05% Tween-20的0.0.1 M 磷酸盐缓冲液，所述洗涤液的pH 为7.2-7.4；所述化学发光液包括A液和B液，所述A液中含有0.1 mM的鲁米诺和0.07 M的发光增强剂IPP，所述B液为3 mM的H2O2溶液。
本发明先将感染FMDV不同时间的细胞样品进行蛋白电泳，从而将分子量大小不同的蛋白分开，然后做WB，将蛋白转至PVDF膜上，与识别3B的单抗进行反应，从而确定在FMDV复制过程中产生与3B相关的蛋白（即与识别3B的单抗有反应性），为后续验证口蹄疫灭活抗原和灭活疫苗中NSPs提供标准对照。将灭活抗原以及破乳后口蹄疫灭活疫苗进行蛋白电泳，从而将抗原或疫苗中大小不同的蛋白进行分离，然后做WB，根据出现的条带判断抗原或疫苗中是否含有NSPs以及NSPs的组分。本发明操作简单，在普通实验室就可操作，非常适合于在口蹄疫生产厂家使用，为口蹄疫生产厂家在抗原纯化以及制定标准化流程提供技术指导。此外，由于蛋白电泳可以根据分子量的大小将大小不同的蛋白分离开，从而使其特异性比ELISA或CLIA更强（将抗原或疫苗中出现的条带与标准对照出现的条带进行对比，抗原或疫苗中条带出现的位置与标准对照中出现条带的位置相吻合的位置为目的条带，在其他位置出现的条带为杂带），并且WB方法灵敏度高。
有益效果：
1、本发明利用原核表达纯化的3ABC蛋白免疫小鼠制备单抗，并且验证该单抗识别3B蛋白。对单抗的深入了解，为后续应用该单抗检测抗原以及疫苗中NSPs残留提供理论指导。
2、本发明利用蛋白电泳将口蹄疫灭活抗原和灭活疫苗中分子量大小不同的蛋白分离开，然后将蛋白转至PVDF膜上，用识别3B的单抗显示出疫苗和灭活抗原中与3B相关的蛋白。该方法特异性更强，能够确定灭活抗原或疫苗中是否含有NSPs以及NSPs的组分。
3、利用正戊醇、正丁醇或水浴法对疫苗进行破乳，从而为实现对成品疫苗中NSPs残留的检测提供基础。
附图说明
图1是3ABC蛋白纯化的SDS-PAGE图；
图2是单抗9E2识别3B的WB图；
图3是感染FMDV O/NC/CHA/2010不同时间的BHK-21 中NSPs的表达情况图；
图4是未纯化（0#）、纯化1次（1#）、纯化2次的抗原（2#）以及浓缩抗原（1-10）中NSPs的组分图；
图5是口蹄疫抗原A-F中NSPs的组分图；
图6是口蹄疫成品疫苗A-L中NSPs的组分图。
具体实施方式
以下对本发明的方法进行详细描述：
1、标准对照：将培养到80%-90%的BHK-21接毒（O/NC/CHA/2010，感染复数MOI为5），于37°C 5%的CO2中吸附1 h，将液体吸出后用DMEM洗2次，加入2 ml维持液。将接毒后4 h的细胞加入1 ml PBS，用细胞刮将刮下的细胞移入离心管中，4000 rpm离心5 min，弃掉上清，在沉淀中加入裂解液，于冰上超声后进行制样，该样品为标准对照。
2、细胞空白对照：将培养好的BHK-21细胞刮下后，进行超声破碎，制样。
3、对待测灭活抗原和疫苗制样：在待检疫苗中加入5%的正戊醇或正丁醇进行旋涡震荡（或利用60℃-98℃水浴法破乳30 min，4ºC静置30 min），破乳完全后以8000 g离心10min，吸取下层水相，然后加入4×上样缓冲液，并将其置于沸水中煮10 min。对待测灭活抗原直接加入4×上样缓冲液后进行煮样。
4、蛋白电泳：配制蛋白胶（下层胶浓度为10%-15%），将制备好的蛋白胶装在电泳槽中的夹子里，电泳槽中加入适量的1×SDS-PAGE电泳缓冲液。然后将marker、煮好的样品以及细胞空白对照分别加入孔中。设置电泳程序（80V 30 min，120V 90 min）。
5、WB ：电泳结束后，取出蛋白胶。用甲醇激活PVDF膜后，按转膜顺序将胶和PVDF膜组装好后置于电转槽中进行转膜（90V 90 min）。转膜完毕后，将PVDF膜放入封闭液（含有5%脱脂奶粉的PBST）中，室温封闭1 h。之后弃掉封闭液，加入1:10,000倍稀释的9E2-HPR，室温孵育1 h；用PBST洗涤5次，每次5 min；然后将等量混匀的化学发光液A+B滴在膜上，反应2min后将PVDF膜放入暗盒中，并在暗室进行曝片或扫膜。
6、待测灭活抗原和疫苗中NSPs的定性以及组分分析：若待测抗原或疫苗中出现条带的位置在标准对照中也出现，而在细胞空白对照中没有出现，那么说明灭活抗原或疫苗中存在NSPs，并根据大小确定该抗原或疫苗中存在的NSPs具体为哪几种NSPs。若待测抗原或疫苗中出现条带的位置在标准对照和细胞空白对照中都出现，那么说明该条带不是NSPs。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1 3B单抗与FMDV O/NC/CHA/2010感染细胞的反应性
1、3B单抗的制备
将原核表达的口蹄疫NSP 3ABC进行纯化（图1），并对其进行梯度透析复性后免疫小鼠制备单抗，通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行3次亚克隆，筛选出反应性强的单克隆细胞，然后将筛选的细胞注入小鼠腹腔制备腹水并将其进行纯化，将纯化后的单抗与辣根过氧化物酶（HRP）进行偶联（9E2-HRP）。通过Western blot验证表明该单抗识别3B蛋白（图2）。
2、感染O型FMDV不同时间的BHK-21 中NSPs的表达情况
接毒：将胰酶消化下的BHK-21重悬后加入到在60 cm2 dish中进行培养，待长到80%-90%时接毒（O/NC/CHA/2010，感染复数MOI为5）。于37°C 5%的CO2中吸附1 h，将液体吸出后用DMEM洗2次，加入2 ml维持液。
取样：接毒前记为0 h，吸附1 h记为1 h，以此类推。分别于0 h、1 h、2 h、2.5 h、3h、4 h、6 h、8 h取样。
制样：待所有时间段的样品收集好后，每管中加入160 μl裂解液，然后于冰上超声2 min，加入4×上样缓冲液后进行煮样。
3、SDS-PAGE和WB
配制蛋白胶（下层胶浓度为10%-15%），并将煮好的样品和marker加入孔中。设置电泳程序（80V 30 min，120V 90 min）。电泳结束后，按转膜顺序将胶和PVDF膜组装好后置于电转槽中进行转膜（90V 90 min）。转膜完毕后，将PVDF膜放入封闭液（含有5%脱脂奶粉的PBST）中，室温封闭1 h。之后弃掉封闭液，加入1:10,000倍稀释的9E2-HPR，室温孵育1 h；用PBST洗涤5次，每次5 min；然后将等量混匀的化学发光液A+B滴在膜上，反应2 min后将PVDF膜放入暗盒中，并在暗室进行曝片或扫膜。
由图3可以得知，在FMDV复制过程中产生与3B相关的蛋白有3AB（20.0 KD）、3ABB（22.7 KD）、3ABBB（25.2 KD）、3ABC（48.2 KD）以及3ABCD（101.0 KD）（与9E2-HRP反应），其中3AB、3ABB和3ABBB表达量很大。这为后续验证口蹄疫灭活抗原和灭活疫苗中NSPs提供标准对照。
实施例2检测口蹄疫灭活抗原中NSPs
取60 μl口蹄疫抗原，并加入20 μl 4×上样缓冲液，然后将其置于沸水中煮10 min。将煮好的样品和marker分别加入蛋白胶孔中，电泳、转膜、封闭、与9E2-HRP反应、进行曝片或扫膜（具体步骤同实施例1）。
由图4可以得知，在检测未纯化的抗原（0#）、纯化1次的抗原（1#）以及纯化2次的抗原（2#）中NSPs残留时，其中未纯化的和纯化1次的抗原都检测到了3ABB、3ABBB以及3ABC降解产物（3ABC-），而纯化2次的抗原未检测到。与未纯化的相比，纯化1次的抗原中NSPs残留已大大降低。在检测浓缩的抗原（1-10）时，可以观测到1-10所有的抗原都检测到了3ABB、3ABBB以及3ABC-，而在空白对照Cm和C中没有这三种蛋白对应的条带。
由图5可知，在检测抗原A-F时，仅在B、C和E中检测到NSPs，其中C和E中检测到3ABBB以及3ABC-，而在B中检测到3ABC以及3B（7.8 KD）。
实施例3检测口蹄疫成品疫苗中NSPs
取1.5 mL疫苗置于2 mL离心管中，然后加入75 μL的正戊醇进行旋涡震荡30s，然后于4℃静置1 h。破乳完全后以8000 g离心10 min，吸取下层水相，再以8000 g离心10 min后取60 μl，然后加入20 μl 4×上样缓冲液，并将其置于沸水中煮10 min。将煮好的样品和marker加入蛋白胶孔中，电泳、转膜、封闭、与9E2-HRP反应、进行曝片或扫膜（具体步骤同实施例1）。
由图6可知，在检测成品疫苗A-L时，仅在C、F和K中检测到NSPs 3ABBB和3ABC-，其中K中检测的量很大，并且也检测到NSPs 3ABB。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法，其特征在于：步骤如下：
（1）制样：对待测口蹄疫灭活疫苗进行破乳，分离水相，然后加入上样缓冲液后进行煮样；对待测灭活抗原直接加入上样缓冲液后进行煮样；
（2）蛋白电泳：制备蛋白胶，上样，加入SDS-PAGE电泳缓冲液进行电泳；
（3）WB：用甲醇激活PVDF膜后，按转膜顺序将胶和PVDF膜组装好后置于电转槽中进行转膜；转膜完毕后，将PVDF膜进行封闭，并与酶标抗体孵育；
（4）与酶标抗体孵育反应后，将PVDF膜洗涤后与化学发光液反应，进行曝片或扫膜；
（5）定性以及组分分析：将待测抗原或疫苗中出现条带的位置与标准对照中出现条带的位置进行比较，从而确定待测抗原或疫苗中是否存在NSPs以及NSPs的组分。
2.根据权利要求1所述的一种检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法，其特征在于：步骤（1）中所述破乳是采用正戊醇、正丁醇或水浴法进行破乳。
3.根据权利要求2所述的一种检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法，其特征在于：采用正戊醇进行破乳时，灭活疫苗和正戊醇的体积比为9.5:0.5-9:1，破乳时间为1-3 h；采用正丁醇进行破乳时，灭活疫苗和正丁醇的体积比为9.5:0.5，破乳时间为1 h；采用水浴法进行破乳时，温度为60℃-98℃，时间为0.5h。
4.根据权利要求1所述的一种检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的上样缓冲液中所含的组分及其浓度分别为：250 mM 且pH6.8的Tris-HCl、质量浓度为10%的 SDS、质量浓度为0.5% 的BPB、体积分数为50%的甘油和体积分数为5% 的β-巯基乙醇。
5.根据权利要求1所述的一种检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的蛋白胶的下层胶浓度为10%-15%，上样量为10-20 μL，电泳程序为80V 30 min、120V 90 min。
6.根据权利要求1所述的一种检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法，其特征在于：步骤（2）所述的SDS-PAGE电泳缓冲液中含有的组分及其浓度分比为：15.1 g /L的Tris、94 g/L 的Glycine和5.0 g/L 的SDS。
7.根据权利要求1所述的一种检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法，其特征在于：步骤（3）中所述转膜采用的程序为90V 90 min。
8.根据权利要求1所述的一种检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法，其特征在于：步骤（3）所述转膜所采用的转膜缓冲液中所含有的组分及其浓度分别为：2.8 g/L的 Tris、2.9 g/L 的Glycine、0.37 g/L 的SDS和体积分数为20%的甲醇；所述封闭所采用的封闭液中所含有的组分及其浓度分别为：质量浓度为 5%的脱脂奶粉、体积分数为0.1%的proclin-300。
9.根据权利要求1所述的一种检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法，其特征在于：步骤（3）中所述酶标抗体为偶联HRP的识别3B的单抗。
10.根据权利要求1所述的一种检测口蹄疫灭活抗原或灭活疫苗中NSPs残留的方法，其特征在于：步骤（4）中所述洗涤所采用的洗涤液为含有体积浓度为0.05% Tween-20的0.0.1M 磷酸盐缓冲液，所述洗涤液的pH 为7.2-7.4；所述化学发光液包括A液和B液，所述A液中含有0.1 mM的鲁米诺和0.07 M的发光增强剂IPP，所述B液为3 mM的H2O2溶液。
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