CN107991481A - 一种检测猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒的二联阻断elisa抗体检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒的二联阻断elisa抗体检测试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107991481A
CN107991481A CN201610954527.7A CN201610954527A CN107991481A CN 107991481 A CN107991481 A CN 107991481A CN 201610954527 A CN201610954527 A CN 201610954527A CN 107991481 A CN107991481 A CN 107991481A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pseudorabies virus
antibody
3abc
porcine pseudorabies
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610954527.7A
Other languages
English (en)
Inventor
陈斌
但汉并
徐高原
尹争艳
陈关平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd
Original Assignee
WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd filed Critical WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd
Priority to CN201610954527.7A priority Critical patent/CN107991481A/zh
Publication of CN107991481A publication Critical patent/CN107991481A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于动物疫病检测领域，具体涉及一种检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体和口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体的二联阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用。所述试剂盒包括：包被有猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒3B多肽的抗原检测板、含有酶标抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体和酶标抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体的混合液、猪伪狂犬病毒gE蛋白酶标单抗显色体系、口蹄疫病毒3ABC蛋白酶标单抗显色体系、阴性/阳性对照、样品稀释液和洗涤液。本发明使两个独立的ELISA反应在前两个步骤同时进行，再使用独特的显色体系，使前一个酶的显色与终止不影响下一个酶的反应，实现了一份血清，一次样品孵育，一次二抗孵育，得到两个ELISA结果。

Description

一种检测猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒的二联阻断ELISA抗体 检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于动物疫病检测领域，具体涉及一种检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体和口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体的二联阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PrV)引起的包括家畜和多种野生动物的一种以发热、奇痒及脑脊髓炎为症状的重要传染病。该病给养猪业造成了巨大的经济损失，猪是本病的天然宿主和储存者。预防、控制和最终根除该病是我国当前面临的一项艰巨任务。
在伪狂犬病的防控工作中，普遍采用gE基因缺失活疫苗进行免疫，这些疫苗免疫后都不产生针对gE蛋白的抗体，但是猪伪狂犬病毒野毒感染则可以产生该蛋白的抗体，因此检测gE蛋白可以进行鉴别诊断，以判定猪是否被野毒感染，在临床上有重要意义。
猪O型口蹄疫(FMD)是由O型口蹄疫病毒(FMDV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病。除感染猪外，还可感染牛、羊等偶蹄动物。
在口蹄疫病毒的防控工作中，当前均采用口蹄疫病毒的灭活疫苗或亚单位疫苗，免疫后会产生针对口蹄疫病毒结构蛋白的抗体，但是非结构蛋白3ABC只会产生于口蹄疫病毒增殖过程中，灭活疫苗和亚单位疫苗在免疫后不存在增殖过程，也不会产生针对3ABC的抗体，因此检测猪只血清中3ABC抗体也可以进行鉴别诊断，以判定猪是否被野毒感染。
酶联免疫技术(ELISA)用于抗体检测已有多年的历史，其优点是敏感性高，应用成本低，适合批量检测。但是，所有ELISA操作步骤都至少包含样品孵育和二抗孵育两个步骤，而这两个步骤的反应时间都较长，导致一个ELISA检测至少需要2～3小时。对于监测猪群健康的血清学实验室而言，同一份血清往往需要检测多种抗体，因此要出具多种抗体的检测报告，需要数天时间。鉴别诊断就是希望在疫病发生早期发现问题，及时采取防控措施，以减少损失，检测时间过长，无疑会使疾病防控措施滞后，导致损失的扩大。
血清学诊断被越来越多的单位所采用，尤其是基层养殖场，对于各级单位而言，控制人力成本是至关重要的事情，因此，急需简化操作流程，缩短操作时间，减少人力资源的投入。此外，血清学检测需要使用猪的血清，大部分阻断ELISA的血清用量是很大，当需要检测多个病原的抗体时，就需要大量采血以分离足够的血清，但是这对处在生长发育期的猪而言，是一个较大的应激，原则上只要能检测到结果，采的血越少对猪只的影响就越小。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，目的在于提供一种检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体和口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体的二联阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
一种检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体和口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体的二联阻断ELISA抗体检测试剂盒，包括：包被有猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒3B多肽的抗原检测板、含有酶标抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体和酶标抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体的混合液、猪伪狂犬病毒gE蛋白酶标单抗显色体系、口蹄疫病毒3ABC蛋白酶标单抗显色体系、阴性对照、阳性对照、样品稀释液和洗涤液。
上述方案中，所述混合液中酶标抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体和酶标抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体的浓度均为1mg～5mg/L。
上述方案中，所述酶标抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体与酶标抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体的比率为1:1。
上述方案中，所述猪伪狂犬病毒采用猪伪狂犬病毒鄂A株(该猪伪狂犬病毒鄂A株来源见参考文献：陈焕春等，猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定，畜牧兽医学报，1998年02期)，通过中空纤维浓缩病毒液，然后通过分子筛纯化得到纯度大于95％的猪伪狂犬病毒颗粒。
上述方案中，通过公布的O型口蹄疫3ABC蛋白质序列，采用蛋白合成技术合成3ABC蛋白中的3B多肽。
上述方案中，所述酶标抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体；所述酶标抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体为α-半乳糖苷酶标记的抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体。
上述方案中，所述抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的制备过程为：采用杂交瘤细胞技术，用纯化的猪伪狂犬病毒(鄂A株)免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，用HAT选择性培养基进行培养后，再用纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白包被板进行间接ELISA筛选，筛选的阳性细胞株经有限稀释法克隆，再用猪伪狂犬病毒(鄂A株，gE基因未缺失)感染猪阳性对照血清和未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪阴性血清进行阻断ELISA筛选，最终筛选得到具有阻断效果的单克隆抗体，分泌此单克隆抗体的细胞株命名为PRV-eA-gE。
上述方案中，所述抗口蹄疫病毒3ABC单克隆抗体的制备过程为：采用杂交瘤细胞技术，用合成的口蹄疫病毒3ABC蛋白中的3B多肽免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，用HAT选择性培养基进行培养后，再用纯化的口蹄疫病毒3B多肽包被板进行间接ELISA筛选，筛选的阳性细胞株经有限稀释法克隆，再用临床筛选出的感染过O型口蹄疫病毒的阳性对照血清和未感染过O型的健康猪阴性血清进行阻断ELISA筛选，最终筛选到具有阻断效果的单克隆抗体，分泌此单克隆抗体的细胞株命名为FMDV-O-3B。
上述方案中，所述猪伪狂犬病毒gE蛋白酶标单抗显色体系包括底物液与终止液，所述底物液中包含过氧化氢脲、四甲基联苯胺(TMB)、柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，所述终止液为体积浓度0.25％的氢氟酸溶液。
上述方案中，所述口蹄疫病毒3ABC蛋白酶标单抗显色体系包含底物液与终止液，所述底物液包含硝基酚-α-D-吡喃半乳糖和磷酸缓冲液，所述终止液包含0.2mol/L pH 9.5～10.0硼酸缓冲液和2mg/mL BSA保护剂。
上述方案中，所述样品稀释液为含2.5mg/mL明胶的DMEM培养基。
上述方案中，所述阳性对照为猪伪狂犬病毒(鄂A株)感染猪血清和临床筛选的O型口蹄疫病毒自然感染猪血清的混合液。
上述方案中，所述阴性对照为未感染过猪伪狂犬病毒和O型口蹄疫病毒的阴性血清。
上述方案中，所述洗涤液为浓缩洗涤液，需稀释后使用，洗涤液稀释后为含0.05wt％Tween-20的PBS缓冲液。
上述二联阻断ELISA抗体检测试剂盒在检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体和口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体中的应用，具体地应用方法包括如下步骤：
(1)取出包被有猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒3B多肽的抗原检测板，向抗原检测板的孔内加入稀释好的待检血清，同时设阴性对照孔和阳性对照孔；轻轻振匀孔中样品，置37℃条件下温育30分钟，温育结束后，弃去板孔内溶液，并用洗涤液洗涤板孔；
(2)再向孔内加入含有酶标抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体和酶标抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体的混合液，置于37℃条件下温育30分钟，温育结束后，弃去板孔内溶液，并用洗涤液洗涤板孔；
(3)然后向孔内加入口蹄疫病毒3ABC蛋白酶标单抗显色底物液，室温避光显色10分钟，再加入口蹄疫病毒3ABC蛋白酶标单抗终止液，5分钟内用酶标仪测定405nm左右处吸光度；
(4)弃去各孔中的显色液及终止液，用洗涤液洗涤各孔后，向每孔加入猪伪狂犬病毒gE蛋白酶标单抗显色底物液，室温避光显色10分钟，再加入猪伪狂犬病毒gE蛋白酶标单抗终止液，5分钟内用酶标仪测定630nm左右处吸光度；
(5)依据检测结果进行结果判定，具体的判定标准为：
猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体部分：试验成立条件是阴性对照孔平均OD630nm值与阳性对照孔平均OD630nm值之差大于或等于0.4；S＝样品孔OD630nm值，N＝阴性对照孔平均OD630nm值，若S/N比值小于或等于0.35，样品判为PRV gE蛋白抗体阳性；若S/N比值小于或等于0.4但大于0.35，该样品必须重测，如果结果相同，则过一段时间后重新从动物取样进行检测；若S/N比值大于0.4，样品判为PRV gE蛋白抗体阴性；
O型口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体部分：试验成立条件是阴性对照孔平均OD405nm值大于0.5，阳性对照的阻断率大于60％；S＝样品孔OD405nm值，N＝阴性对照孔平均OD405nm值；阻断率＝(1-S/N)×100％；若被检样品的阻断率大于或等于50％，该样品判为MD-3ABC抗体阳性，否则判为阴性。
本发明的有益效果：
(1)本发明基于阻断ELISA的基本原理，构建了一种二联阻断ELISA血清检测方法，本发明中使用包被有两种病毒(猪伪狂犬病毒和O型口蹄疫病毒)抗原的酶标板，同时使用两种酶标单抗(辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体和半乳糖苷酶标记的口蹄疫病毒ABC蛋白单克隆抗体)，使得待检血清中的抗体可以同时、分别与两种抗原结合，两种酶标单抗也可以同时、分别进行竞争反应，因此，本发明使两个相对独立的ELISA反应在开始的两个步骤中可以同时进行，同时使用独特的显色和终止体系，使得前一个酶的显色与终止不影响下一个酶的反应，两个ELISA反应结果可以被单独检测到，最终实现了一份血清，一次样品孵育，一次二抗孵育，得到两个ELISA结果。
(2)本发明所述二联阻断ELISA抗体检测试剂盒可以准确、快速的测定出猪伪狂犬病毒gE抗体和O型口蹄疫病毒3ABC抗体，具有特异性好、检测灵敏度高等优点，可以将整体检测时间缩短一半，样品血清量减少一半，具有实际的应用价值。
(3)基于本发明所采用的二联ELISA方法可以衍生出其他两种病原的或同一种病原两种特征抗原的二联ELISA。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1抗原包被板的制备
包被有猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒3B多肽的抗原检测板的制备，包括如下步骤：
(1)猪伪狂犬病毒培养及纯化:将猪伪狂犬病毒(鄂A株)病毒以5％比率接种BHK细胞，48小时后收集病毒液；收集的病毒液经孔径为100KD的中空纤维浓缩30倍，然后将浓缩液通过葡聚糖凝胶分子筛纯化，收集特征峰对应的病毒液作为最终的猪伪狂犬病毒抗原液，-15℃以下保存备用；
(2)通过公布的O型口蹄疫蛋白质序列，将3ABC蛋白中的3B多肽序列发送至蛋白合成公司，将收获的3B多肽保存于-15℃以下备用；
(3)将步骤(1)所得猪伪狂犬病毒抗原液用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释为约2μg/mL，按100μL/孔加于聚苯乙烯微孔板中，4℃放置过夜，甩干；
(4)将3B多肽用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释为约0.1～0.5μg/mL，加入100μL到上述包被过猪伪狂犬病毒的聚苯乙烯微孔板中，4℃放置过夜，甩干；
(5)按150μL/孔用含5mg/mL BSA pH7.4的磷酸盐缓冲液4℃封闭1小时、甩干；
(6)按100μL/孔用含20wt％蔗糖pH 7.4的磷酸盐缓冲液室温保护3小时，甩干，置干燥室干燥后，将聚苯乙烯微孔板装入含干燥剂的包装中密封保存。
实施例2酶标单抗的制备
(1)抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的制备：用纯化的猪伪狂犬病毒(鄂A株)免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，用HAT选择性培养基进行培养后，再用纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白包被板进行间接ELISA筛选，筛选的阳性细胞株经有限稀释法克隆，再用猪伪狂犬病毒(鄂A株，gE基因未缺失)感染猪阳性对照血清和未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪阴性血清进行阻断ELISA筛选，最终筛选到具有阻断效果的单克隆抗体，分泌此单克隆抗体的细胞株命名为PRV-eA-gE。
(2)抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体的制备：用合成的3ABC蛋白中的3B多肽免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，用HAT选择性培养基进行培养后，再用纯化的口蹄疫病毒3B多肽包被板进行间接ELISA筛选，筛选的阳性细胞株经有限稀释法克隆，再用临床筛选出的感染过O型口蹄疫病毒的阳性对照血清和未感染过O型的健康猪阴性血清进行阻断ELISA筛选，最终筛选到具有阻断效果的单克隆抗体，分泌此单克隆抗体的细胞株命名为FMDV-O-3B。
(3)大量生产单克隆抗体步骤：
a.首先用1640培养基分别大量培养上述杂交瘤细胞株PRV-eA-gE和FMDV-O-3B；按每只小鼠腹腔注入106个细胞量(小鼠注入细胞前5天需经不完全弗式佐剂处理)，10天后收集腹水，离心除去固体成分，其上清液即含有单克隆抗体；
b.抗体的纯化：向一份腹水中加入两份0.06mol/L(pH＝5.0)的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的盐酸调pH值至4.7；室温搅拌下在30min内逐渐滴加入辛酸(每毫升稀释前的腹水加33μL)，4℃静置2小时，12000rpm离心30min，弃沉淀；上清经滤纸过滤后调pH至7.4，在4℃冰浴下缓慢加入pH为7.4的饱和硫酸铵，使硫酸铵最终饱和度不超过45％，搅拌30min，静置2～4小时或4℃过夜；4℃下12000r/min离心20min弃去上清；沉淀用0.01mol/L的PBS(pH＝7.4)重悬，用pH为8.0的10mmol/L Tris-HCl透析过夜；收集抗体后用分光光度计检测其浓度。
(4)猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记：称取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于lmL双蒸水中，加500μL新配制的0.06mol/L的NaIO4，4℃放置30min，勿超过此时间，此时溶液呈草绿色，加入0.5mL乙二醇(0.16mol/L)室温避光反应30min；再加入5mg/mL的纯化后的猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体1mL，在0.05mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液中4℃透析过夜；吸出后加5mg/mL新配的NaBH4 0.2mL，4℃放置2小时，再加等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃放置30min，7000r/min离心10min，弃上清，用生理盐水重悬，再在0.15mol/L pH7.4的PBS中透析过夜；收集透析袋中辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病毒gE单克隆抗体进行工作浓度标定，然后分装于20mL瓶中，4℃保存备用。
(5)口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体的α-半乳糖苷酶标记：将纯化后的抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体溶于0.1moL/L pH5.0醋酸钠缓冲液并在同一缓冲液中透析平衡过夜，离心除去不溶性物质；将浓度为7mg/mL的抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体与10mlα－巯基乙胺在37℃温育90min；过Sephadex后浓缩使每毫升含3.0mg左右的还原单克隆抗体；在0℃条件下，向还原单克隆抗体(浓度为3mg/mL)中按1∶1的体积比滴加饱和N、N‘－O－苯二马来酰亚胺溶液，混合，于30℃温育20min，过SephadexG25柱，除去未反应的二马来酰亚胺；收集二马来酰亚胺“活化”的单克隆抗体，浓缩使浓度为OD280nm＝1.0(光径1cm)，取1mL浓缩溶液加入20μL(5mg/ml)α-半乳糖苷酶，置30℃20min，用0.1moL/L NaOH中和后，置于4℃条件下24h～72h，再过Sepharose-6B柱(1.5×40cm)，以pH7.0PBS洗脱，收集α-半乳糖苷酶标记的口蹄疫病毒3ABC单克隆抗体，4℃保存备用。
调整两个酶标抗体的浓度均为1mg～5mg/L，比率为1:1作为试剂盒的酶标单抗。
实施例3试剂盒组装
试剂盒含96孔ELISA抗原检测板2块，含两种酶标单抗的混合液1瓶(20mL/瓶)、猪伪狂犬病毒gE蛋白酶标单抗显色底物液、终止液各1瓶(10mL/瓶)，口蹄疫病毒3ABC蛋白酶标单抗显色底物液、终止液各1瓶(10mL/瓶)，阴性对照和阳性对照各2管(1.5mL/管)，样品稀释液1瓶(50mL/瓶)和浓缩洗涤液1瓶(30mL/瓶)，附说明书一份。
上述抗原检测板为包被有猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒3B多肽的抗原检测板；
上述两种酶标单抗为辣根过氧化物酶标抗的伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体和α-半乳糖苷酶标记的抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体，其中辣根过氧化物酶标抗的伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体和α-半乳糖苷酶标记的抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体的浓度均为1mg～5mg/L，比率为1：1；
上述猪伪狂犬病毒gE蛋白酶标单抗显色底物液中包含过氧化氢脲、四甲基联苯胺(TMB)、柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，终止液为0.25％(体积浓度)的氢氟酸溶液。
上述口蹄疫病毒3ABC蛋白酶标单抗显色底物液包含硝基酚-α-D-吡喃半乳糖和磷酸缓冲液，终止液包含0.2mol/L pH 9.5～10.0硼酸缓冲液和保护剂(2mg/mL BSA)；
上述样品稀释液为含2.5mg/mL明胶的DMEM培养基；
上述阳性对照为猪伪狂犬病毒(鄂A株)感染猪血清和临床筛选的O型口蹄疫病毒自然感染猪血清的混合液；
上述阴性对照为未感染过猪伪狂犬病毒和O型口蹄疫病毒的阴性血清；
上述浓缩洗涤液需稀释后使用，浓缩洗涤液稀释后为含0.05wt％Tween-20的PBS缓冲液。
实施例4试剂盒检测效果实验
1、方法如下：
1)从试剂盒中取出预包被有两种病毒的抗原检测板(根据样品多少，可拆开分次使用)，将稀释好的待检血清(1：1稀释)100μL加入包被有两种病毒的抗原检测板中，同时设阴、阳性对照孔，各设2孔，每孔100μL。
2)轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置37℃条件下温育30分钟，甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板5次，200μL/孔，每次静置3分钟倒掉，最后一次在吸水纸上拍干。
3)向每孔内加入100μL含有辣根过氧化物酶标抗的伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体和α-半乳糖苷酶标记的抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体的混合液，置37℃条件下温育30分钟，甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板5次，方法同步骤2。
4)再向每孔内加入口蹄疫病毒3ABC蛋白酶标单抗显色底物液一滴(50μL)，室温(18～25℃，以下相同)避光显色10分钟；然后向每孔内加入口蹄疫病毒3ABC蛋白酶标单抗终止液一滴(50μL)，5分钟内用酶标仪测定405nm左右处吸光度。
5)弃去各孔中的显色液及终止液，用洗涤液洗板3次，200μL/孔，每次静置3分钟倒掉，最后一次在吸水纸上拍干。
6)向每孔内加入猪伪狂犬病毒gE蛋白酶标单抗显色底物液一滴(50μL)，室温避光显色10分钟；再向每孔内加入猪伪狂犬病毒gE蛋白酶标单抗终止液一滴(50μL)，5分钟内用酶标仪测定630nm左右处吸光度。
7)依据检测结果进行结果判定，具体的判定标准为：
猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体部分：试验成立条件是阴性对照孔平均OD630nm值与阳性对照孔平均OD630nm值之差大于或等于0.4；S＝样品孔OD630nm值，N＝阴性对照孔平均OD630nm值；若S/N比值小于或等于0.35，样品判为PRV gE蛋白抗体阳性；若S/N比值小于或等于0.4但大于0.35，该样品必须重测，如果结果相同，则过一段时间后重新从动物取样进行检测；若S/N比值大于0.4，样品判为PRV gE蛋白抗体阴性。
O型口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体部分：试验成立条件是阴性对照孔平均OD405nm值大于0.5，阳性对照的阻断率大于60％；S＝样品孔OD405nm值，N＝阴性对照孔平均OD405nm值；阻断率＝(1-S/N)×100％；若被检样品的阻断率大于或等于50％，该样品判为FMD-3ABC抗体阳性，否则判为阴性。
2、结果如下：
2.1干扰性试验
取5份猪伪狂犬病毒gE阳性血清和5份阴性血清，取适量检测板直接用上述试剂盒测定各血清的OD630nm值(即直接检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体)；另取同一试剂盒的另外的检测板同时孵育样品与两种酶标单抗，先使用口蹄疫病毒3ABC蛋白酶标单抗显色底物液和终止液，读数OD405数值之后，弃去各孔中的显色底物液和终止液，用洗涤液洗板3次，200μL/孔，每次静置3分钟倒掉，最后一次在吸水纸上拍干，再加猪伪狂犬病毒gE显色底物液显色，最后加终止液读数OD630数值。
将先显色测定口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体、再显色测定猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的OD630数值与前述的直接检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的OD630数值进行比较，统计比较的结果显示：先对口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体检测结果进行显色和终止对后续的猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体检测无显著影响。
表1干扰性试验检测结果
2.2特异性试验：用猪伪狂犬病毒gE蛋白、口蹄疫病毒3ABC蛋白二联阻断ELISA抗体检测试剂盒检测猪伪狂犬病、猪瘟、猪口蹄疫(O型)、猪细小病毒、猪流感和猪繁殖与呼吸综合征等标准阳性血清，两轮显色中，除试剂盒对应的两种血清在各自的显色环节中判定为阳性外，其余血清S/N值均符合阴性血清的判定标准，表明本发明所述猪伪狂犬病毒gE蛋白和口蹄疫病毒3ABC蛋白二联阻断ELISA抗体检测试剂盒的特异性良好。
表2特异性检测结果
2.3敏感性的检测：将包含猪伪狂犬病毒gE蛋白阳性血清和O型口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体阳性血清的试剂盒质控阳性血清梯度稀释后进行敏感性试验检测，结果如下表3，表3结果结果显示：16倍稀释的试剂盒阳性质控血清仍然可以被检测出阳性，说明试剂盒敏感性较好。
表3敏感性检测结果
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体和口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体的二联阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒3B多肽的抗原检测板、含有酶标抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体和酶标抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体的混合液、猪伪狂犬病毒gE蛋白酶标单抗显色体系、口蹄疫病毒3ABC蛋白酶标单抗显色体系、阴性对照、阳性对照、样品稀释液和洗涤液。
2.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体和口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体的二联阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述混合液中酶标抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体和酶标抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体的浓度均为1mg~5mg/L。
3.根据权利要求2所述的检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体和口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体的二联阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体与酶标抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体的比率为1:1。
4.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体和口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体的二联阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体；所述酶标抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体为α-半乳糖苷酶标记的抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体和口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体的二联阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒gE蛋白酶标单抗显色体系包括底物液与终止液，所述底物液包含过氧化氢脲、四甲基联苯胺和柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，所述终止液为体积浓度为0.25%的氢氟酸溶液。
6.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体和口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体的二联阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述口蹄疫病毒3ABC蛋白酶标单抗显色体系包含底物液与终止液，所述底物液包含硝基酚-α-D-吡喃半乳糖和磷酸缓冲液，所述终止液包含0.2mol/L pH 9.5~10.0硼酸缓冲液和2mg/mL BSA 保护剂。
7.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体和口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体的二联阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含2.5mg/mL明胶的DMEM培养基。
8.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体和口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体的二联阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为猪伪狂犬病毒感染猪血清和临床筛选的O型口蹄疫病毒自然感染猪血清的混合液；所述阴性对照为未感染过猪伪狂犬病毒和O型口蹄疫病毒的阴性血清。
9.根据权利要求1所述的检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体和口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体的二联阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为浓缩洗涤液，需稀释后使用，洗涤液稀释后为含0.05wt% Tween-20的PBS缓冲液。
10.权利要求1~9任一所述二联阻断ELISA抗体检测试剂盒用于检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体和口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体的应用，具体应用方法包括如下步骤：
（1）取出包被有猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒3B多肽的抗原检测板，向抗原检测板的孔内加入稀释好的待检血清，同时设阴性对照孔和阳性对照孔；轻轻振匀孔中样品，置37℃条件下温育30分钟，温育结束后，弃去板孔内溶液，并用洗涤液洗涤板孔；
（2）再向孔内加入含有酶标抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体和酶标抗口蹄疫病毒3ABC蛋白单克隆抗体的混合液，置于37℃条件下温育30分钟，温育结束后，弃去板孔内溶液，并用洗涤液洗涤板孔；
（3）然后向孔内加入口蹄疫病毒3ABC蛋白酶标单抗显色底物液，室温避光显色10分钟，再加入口蹄疫病毒3ABC蛋白酶标单抗终止液，5分钟内用酶标仪测定405nm左右处吸光度；
（4）弃去各孔中的显色液及终止液，用洗涤液洗涤各孔后，向每孔加入猪伪狂犬病毒gE蛋白酶标单抗显色底物液，室温避光显色10分钟，再加入猪伪狂犬病毒gE蛋白酶标单抗终止液，5分钟内用酶标仪测定630nm左右处吸光度；
（5）依据检测结果进行结果判定，具体的判定标准为：
猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体部分：试验成立条件是阴性对照孔平均OD630nm值与阳性对照孔平均OD630nm值之差大于或等于0.4；S＝样品孔OD630nm值，N＝阴性对照孔平均OD630nm值，若S/N比值小于或等于0.35，样品判为PRV gE蛋白抗体阳性；若S/N比值小于或等于0.4但大于0.35，该样品必须重测，如果结果相同，则过一段时间后重新从动物取样进行检测；若S/N比值大于0.4，样品判为PRV gE蛋白抗体阴性；
O型口蹄疫病毒3ABC蛋白抗体部分：试验成立条件是阴性对照孔平均OD405nm值大于0.5，阳性对照的阻断率大于60%；S＝样品孔OD405nm值，N＝阴性对照孔平均OD405nm值；阻断率=（1-S/N）×100%；若被检样品的阻断率大于或等于50%，该样品判为MD-3ABC抗体阳性，否则判为阴性。
CN201610954527.7A 2016-10-27 2016-10-27 一种检测猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒的二联阻断elisa抗体检测试剂盒及其应用 Pending CN107991481A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610954527.7A CN107991481A (zh) 2016-10-27 2016-10-27 一种检测猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒的二联阻断elisa抗体检测试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610954527.7A CN107991481A (zh) 2016-10-27 2016-10-27 一种检测猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒的二联阻断elisa抗体检测试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107991481A true CN107991481A (zh) 2018-05-04

Family

ID=62029328

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610954527.7A Pending CN107991481A (zh) 2016-10-27 2016-10-27 一种检测猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒的二联阻断elisa抗体检测试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107991481A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111744000A (zh) * 2020-07-14 2020-10-09 中国农业科学院兰州兽医研究所 免疫抑制功能降低的口蹄疫重组病毒及其制备方法与应用
CN113671182A (zh) * 2020-05-13 2021-11-19 洛阳中科生物芯片技术有限公司 一种猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白的抗体联检试剂盒及其制备方法与应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1399641A (zh) * 1999-10-28 2003-02-26 比奥美希奥公司 酶底物,合成方法和用途
CN1554948A (zh) * 2003-12-20 2004-12-15 苏冬梅 酶联免疫吸附elisa同步快速测定多项免疫指标的方法
CN1673745A (zh) * 2003-12-20 2005-09-28 苏冬梅 酶联免疫吸附elisa同步快速测定多项免疫指标的方法
CN102353783A (zh) * 2011-06-29 2012-02-15 武汉科前动物生物制品有限责任公司 一种检测猪伪狂犬病毒抗体的试剂盒及阻断elisa检测方法
CN102608315A (zh) * 2012-02-21 2012-07-25 武汉科前动物生物制品有限责任公司 一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫试剂盒及应用
CN103524619A (zh) * 2006-08-03 2014-01-22 阿斯利康(瑞典)有限公司 针对αVβ6的抗体及其应用
CN103554258A (zh) * 2006-11-30 2014-02-05 米迪缪尼有限公司 白介素-6的结合成员
CN105675886A (zh) * 2016-03-25 2016-06-15 武汉科前生物股份有限公司 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3abc抗体的阻断elisa试剂盒及检测方法
US20160229896A1 (en) * 2012-12-05 2016-08-11 Thevax Genetics Vaccine Co., Ltd. Fusion proteins for use as immunogenic enhancers for inducing antigen-specific t cell responses

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1399641A (zh) * 1999-10-28 2003-02-26 比奥美希奥公司 酶底物,合成方法和用途
CN1554948A (zh) * 2003-12-20 2004-12-15 苏冬梅 酶联免疫吸附elisa同步快速测定多项免疫指标的方法
CN1673745A (zh) * 2003-12-20 2005-09-28 苏冬梅 酶联免疫吸附elisa同步快速测定多项免疫指标的方法
CN103524619A (zh) * 2006-08-03 2014-01-22 阿斯利康(瑞典)有限公司 针对αVβ6的抗体及其应用
CN103554258A (zh) * 2006-11-30 2014-02-05 米迪缪尼有限公司 白介素-6的结合成员
CN102353783A (zh) * 2011-06-29 2012-02-15 武汉科前动物生物制品有限责任公司 一种检测猪伪狂犬病毒抗体的试剂盒及阻断elisa检测方法
CN102608315A (zh) * 2012-02-21 2012-07-25 武汉科前动物生物制品有限责任公司 一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫试剂盒及应用
US20160229896A1 (en) * 2012-12-05 2016-08-11 Thevax Genetics Vaccine Co., Ltd. Fusion proteins for use as immunogenic enhancers for inducing antigen-specific t cell responses
CN105675886A (zh) * 2016-03-25 2016-06-15 武汉科前生物股份有限公司 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3abc抗体的阻断elisa试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QI HONG等: "A recombinant pseudorabies virus co-expressing capsid proteins precursor P1-2A of FMDV and VP2 protein of porcine parvovirus: a trivalent vaccine candidate", 《BIOTECHNOL LETT》 *
YANNAN HE等: "Construction and immune response characterization of a recombinant pseudorabies virus co-expressing capsid precursor protein (P1) and a multiepitope peptide of foot-and-mouth disease virus in swine", 《VIRUS GENES》 *
中国微生物学会1979年学术年会筹备组: "《中国微生物学会1979年学术年会论文摘要汇编》", 31 October 1979 *
刘建等: "猪细小病毒NS1非结构蛋白和VP2结构蛋白主要抗原区间接ELISA方法的建立与联合应用", 《黑龙江畜牧兽医》 *
张惟杰: "《糖复合物生化研究技术》", 31 August 1999, 浙江大学出版社 *
徐秉锟等: "《人体寄生虫学》", 31 May 1989, 人民卫生出版社 *
郑宝东等: "《食品酶学》", 31 October 2006, 东南大学出版社 *
陈亮等: "血清学方法在几种猪病毒抗体检测中的应用进展", 《农业开发与装备》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113671182A (zh) * 2020-05-13 2021-11-19 洛阳中科生物芯片技术有限公司 一种猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白的抗体联检试剂盒及其制备方法与应用
CN113671182B (zh) * 2020-05-13 2023-11-28 洛阳中科生物芯片技术有限公司 一种猪伪狂犬病病毒gD、gE蛋白的抗体联检试剂盒及其制备方法与应用
CN111744000A (zh) * 2020-07-14 2020-10-09 中国农业科学院兰州兽医研究所 免疫抑制功能降低的口蹄疫重组病毒及其制备方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mackay et al. A solid-phase competition ELISA for measuring antibody to foot-and-mouth disease virus
Chénard et al. A solid-phase blocking ELISA for detection of type O foot-and-mouth disease virus antibodies suitable for mass serology
US10520506B2 (en) Method for the detection and classification of PRRSV-infections in swine herds and diagnostic antigen compositions for such methods
CN103864906B (zh) 口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒
CN113607952B (zh) 非洲猪瘟病毒阻断elisa抗体检测试剂盒及其制备方法和应用
CN110927390A (zh) 一种检测非洲猪瘟CD2v蛋白抗体的ELISA方法、试剂盒及应用
CN101294147B (zh) 抗猪瘟病毒野毒株e2蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用
CN109851671B (zh) 检测口蹄疫o型广西株抗原的单克隆抗体及其应用
CN213933883U (zh) 猪瘟病毒e2＆e0抗体检测试剂盒
CN102731615A (zh) Prrsv的检测试剂和检测方法
CN106771182A (zh) 牛布鲁氏菌IgM亚型抗体间接ELISA检测试剂盒
Yoon et al. Comparison of a commercial H1N1 enzyme-linked immunosorbent assay and hemagglutination inhibition test in detecting serum antibody against swine influenza viruses
CN110058019A (zh) 一种猪瘟抗体阻断检测试纸
CN111474346B (zh) 猪流行性腹泻病毒IgA和IgG抗体检测试剂盒及其制备方法和应用
CN109187968A (zh) 一种猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的二联金标检测试纸及其制备方法
CN105296434B (zh) 杂交瘤细胞株及其分泌的抗口蹄疫o型病毒的单克隆抗体与应用
CN107513101B (zh) 猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒
CN109959788B (zh) 一种用于检测猪伪狂犬病病毒gE抗体的包被抗原和酶标抗体及阻断法试剂盒
CN107991481A (zh) 一种检测猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒的二联阻断elisa抗体检测试剂盒及其应用
CN111398585B (zh) 一种特异性检测基孔肯雅病毒nsp1抗原的免疫诊断试剂盒
CN101241138A (zh) Asia 1型口蹄疫抗体水平检测试纸及制备方法
CN116836938A (zh) 一株产生抗iii型鸭甲型肝炎病毒vp1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN111398594B (zh) 一种特异性检测黄热病毒ns1抗原的免疫诊断试剂盒
CN106442998A (zh) 一种基于型特异性单抗的a型口蹄疫病毒抗体固相竞争elisa试剂盒
CN107064488B (zh) 一种猪瘟病毒血清总抗体固相阻断elisa试剂盒所用抗原的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180504

RJ01 Rejection of invention patent application after publication