CN101294147B - 抗猪瘟病毒野毒株e2蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗猪瘟病毒野毒株E2蛋白的单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明采用环磷酰胺免疫抑制法，用杆状病毒表达的猪瘟兔化弱毒疫苗株E2蛋白作为耐受原，以石门株E2蛋白作为免疫原，免疫小鼠，经细胞融合，筛选得到稳定分泌抗E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该单克隆抗体能与石门株发生反应，同时能与1.1、2.1、2.2和2.3基因亚群猪瘟病毒野毒株发生特异性反应，并具有中和活性，而与猪瘟兔化弱毒疫苗株不发生反应。本发明单克隆抗体可用于鉴别猪瘟病毒野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株，为建立一种区分猪瘟野毒感染与疫苗免疫的方法以及研究CSFV强毒和弱毒之间的分子差异奠定了基础。

Description

抗猪瘟病毒野毒株E2蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体，尤其涉及一种抗猪瘟病毒野毒株E2蛋白的单克隆抗体，本发明还涉及分泌该抗E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及该单克隆抗体在猪瘟临床诊断中的应用，属于动物疾病检验检疫领域。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种以高热和出血为特征的高度接触性传染病，是危害养猪业的重大传染病之一，世界动物卫生组织(OIE)将其列入OIE疾病名录(OIE Listeddiseases)，我国也将其列为一类传染病。CSFV属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，其基因组为线状单股正链RNA，长约12.3kb，含有一个大的开放阅读框架(ORF)，由其编码一条约3898个氨基酸的多聚蛋白，在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下，多聚蛋白在翻译和翻译后加工过程中形成12种成熟的病毒蛋白，包括4种结构蛋白(C、E^rns、E1和E2)以及8种非结构蛋白(N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)(Rice CM.Flaviviridae：the viruses and theirreplication.In：Knipe DM，Fields BN，and Howley P，eds.Fundamental Virology，Philadelphia：Lippincott-Rave Publishers，1996：931-959)，其中E2囊膜糖蛋白编码373个氨基酸残基，是CSFV诱导机体产生中和抗体的主要抗原(Rumenapf T，Meyers G，Stark R，et al.Hog cholera virus-Characterization of specific antiserumand identification of cDNA clones.Virology，1989，171(1)：18-27)。

目前，在猪瘟流行的国家控制猪瘟应用最广泛的还是接种猪瘟弱毒疫苗。而常规弱毒疫苗免疫的最大缺点是难以用血清学方法与自然感染区分开。国内外学者已经制备了多种CSFV单克隆抗体(Wensvoort G，Terpstra C，Boonstra J，et al.Production of monoclonal antibodies against swine fever virus and theiruse in laboratory diagnosis.Vet Microbiol，1986，12(2)：101-108；丘惠深，王在时，方国安.猪瘟单克隆抗体诊断试剂的研究.中国畜禽传染病，1991，6：20-26；1991，6：20-26；马刚，李作生，余兴龙等.猪瘟病毒保护性抗原E2蛋白单抗的制备及其抗原表位的初步分析.中国兽医学报，2002，22(2)：121-124；杨艳艳，张改平，王选年.猪瘟病毒单克隆抗体的制备及其免疫组织化学研究.中国兽医科学，2006，36(10)：782-786；侯强，彭伍平，孙元等.猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的原核表达及其单克隆抗体的制备.中国兽医科学，2008，38(1)：1-5.)，然而由于猪瘟野毒株和弱毒疫苗株的同源性很高，大多数单克隆抗体与猪瘟病毒野毒株和弱毒株都可以反应，无法有效区分野毒感染与疫苗毒，很大程度上限制了CSFV单克隆抗体在猪瘟临床诊断中的应用。

从80年代后期开始，国内外学者对于不易纯化的抗原、与其它蛋白具有高相似性的蛋白(抗原)和弱免疫原性的抗原制备单克隆抗体时使用扣减免疫技术(Subtractive immunization techniques)，并取得了令人满意的效果(Matthew WD，Sandrock AW Jr.Cyclophosphamide treatment used to manipulate the immuneresponse for the production of monoclonal antibodies.J Immunol Methods，1987，100(1-2)：73-82；Weiland E，Thiel HJ，Hess G，et al.Development of monoclonalneutralizing antibodies against bovine viral diarrhea virus after pretreatment of micewith normal bovine cells and cyclophosphamide.J Virol Methods，1989，24(1-2)：237-43；Salata RA，Malhotra IJ，Hampson RK，et al.Application of animmune-tolerizing procedure to generate monoclonal antibodies specific to analternate protein isoform of bovine growth hormone.Anal Biochem，1992，207(1)：142-9；陆芹章.免疫抑制法制备单克隆抗体的研究.中国免疫学杂志，1994，10(6)：350-353；钱建飞，毛洪先，邵国青等.环磷酰胺免疫抑制法制备单克隆抗体的研究.中国农业科学，1996，29(3)：86-92)，该技术主要包括3种方法：新生动物耐受(Neonatal tolerization)、高带耐受(High zone tolerization)与药物免疫抑制(Chemical immunosuppression)。药物免疫抑制中的常用药物是环磷酰胺(Cyclophosphamide；Cy)，因此该方法又常称为环磷酰胺免疫抑制。环磷酰胺是一种非特异性免疫抑制剂，与抗原联用时能优先杀死针对外来抗原迅速增殖的B、T淋巴细胞克隆，并诱导机体在一定时期内对该抗原产生特异性免疫耐受，而不影响机体免疫系统对其它抗原的识别。

制备一种仅与猪瘟野毒株反应而与兔化弱毒疫苗株不反应的单克隆抗体，对于建立一种区分猪瘟野毒感染与疫苗接种的诊断方法以及研究猪瘟强毒和弱毒之间的分子差异均具有重要的意义。

发明内容

此前，本发明人利用杆状病毒表达系统表达了具有生物学活性的CSFV强毒和弱毒株E2蛋白(彭伍平，夏照和，侯强，等.猪瘟病毒石门强毒株和兔化弱毒疫苗株E2蛋白糖基化位点差异分析.病毒学报，2007，23(5)：389-393)，在此基础上，本发明利用环磷酰胺免疫抑制法制备了一株仅与猪瘟野毒株反应而与兔化弱毒疫苗株不反应的单克隆抗体。具体来说，本发明采用环磷酰胺免疫抑制法，用杆状病毒表达的猪瘟兔化弱毒疫苗株E2蛋白(HCLV-E2)作为耐受原，以石门株E2蛋白(Shimen-E2)作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取其脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选获得一株稳定分泌抗E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其分类命名为：分泌抗猪瘟病毒野毒株E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；其微生物保藏号是：CGMCC NO.2455；保藏地址是：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是：2008年4月11日。

如果想获得高质量的单克隆抗体，免疫原的活性至关重要。昆虫杆状病毒载体表达系统是目前比较有效的真核表达系统之一，此系统具有与高等真核细胞类似的蛋白质修饰、加工和转运体系。由杆状病毒表达的外源蛋白，在结构和功能上均与天然蛋白相似。本发明利用杆状病毒表达系统表达的重组蛋白HCLV-E2作为耐受原，以重组蛋白Shimen-E2作为免疫原，这两种重组蛋白都可以被CSFV抗血清和单克隆抗体HQ06特异性识别，具有很好的反应原性。

Shimen-E2蛋白与HCLV-E2蛋白的氨基酸序列具有很高的同源性，因此两者具有很多共同表位。按常规制备方法所获得的单克隆抗体大多数与Shimen-E2蛋白和HCLV-E2蛋白都可以反应。本发明采用环磷酰胺免疫抑制法，先用HCLV-E2蛋白免疫小鼠，同时联合应用环磷酰胺，使小鼠对HCLV-E2蛋白产生免疫耐受，然后再免疫Shimen-E2蛋白，目的是让机体的免疫应答主要针对于Shimen-E2蛋白上特有而HCLV-E2蛋白上没有的表位，而针对HCLV-E2蛋白与Shimen-E2蛋白共有表位的免疫应答被抑制。试验结果显示，本发明所制备的单克隆抗体只能识别CSFV石门强毒株，而不能识别猪瘟兔化弱毒疫苗株，可用于建立区分CSFV野毒株和疫苗株的血清学鉴别诊断方法，从而有利于猪瘟的净化和无猪瘟疫区的建立。本发明所制备的单克隆抗体对不同基因亚群CSFV野毒株都具有很强的中和活性，推测它针对的是CSFV的一个构象性中和表位，可能对于揭示CSFV致弱机制有一定价值。

经检测，本发明所制备的单克隆抗体能与石门株发生反应，同时能与1.1、2.1、2.2和2.3基因亚群猪瘟病毒发生特异性反应，并具有中和活性，而与猪瘟兔化弱毒疫苗株不发生反应，该单克隆抗体可以用于鉴别猪瘟野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株。

总之，本发明通过环磷酰胺免疫抑制法制备了一株能够稳定分泌特异性针对Shimen-E2蛋白的单克隆抗体，为建立一种区分猪瘟野毒感染与疫苗免疫的方法与研究CSFV强毒和弱毒之间的分子差异奠定了基础。

附图说明

图1应用间接免疫荧光试验检测单克隆抗体4A4与猪瘟病毒石门株和兔化弱毒疫苗株的反应性结果。

图2应用抗原捕获ELISA检测4A4单克隆抗体与猪瘟病毒石门株和兔化弱毒疫苗株的反应性结果。

图3应用Western blot分析单克隆抗体4A4与CSFV E2蛋白的反应性；1和4：HCLV-E2；2和6：预先染色的蛋白梯带分子量标准；3和5：Shimen-E2。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

毒种、细胞、实验动物和生化试剂

(1)、Sf9细胞、SP2/0细胞、PK15细胞、重组杆状病毒rAcV-Shimen-E2和rAcV-HCLV-E2、CSFV石门株和猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株)均由本实验室保存(其中，重组杆状病毒rAcV-Shimen-E2和rAcV-HCLV-E2可按照以下文献所公开的方法构建：彭伍平，夏照和，侯强，等.猪瘟病毒石门强毒株和兔化弱毒疫苗株E2蛋白糖基化位点差异分析.病毒学报，2007，23(5)：389-393)；

(2)、HLJ-1(05)(1.1亚群)、GZ1(98)(2.1亚群)、ZJ2(99)(2.2亚群)、HuB2(98)(2.3亚群)等4株不同基因亚群的CSFV分离株由长春军事兽医研究所保存并提供；

(3)、8周龄实验用雌性BALB/c小鼠由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供；

(4)、Ni-NTA His-Bind Resins购自Amersco公司；标准胎牛血清、培养基DMEM购于Gibco公司；环磷酰胺、弗氏完全佐剂、选择试剂HAT和HT、融合剂PEG3250、单克隆抗体亚型鉴定试剂盒、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(HRP-IgG)购于Sigma公司；rProtein G树脂购于Invitrogen公司。

实施例1单克隆抗体的制备

1、重组蛋白的纯化与检测

分别用第4代重组杆状病毒rAcV-Shimen-E2与rAcV-HCLV-E2感染处于对数生长期的Sf9细胞，27℃培养96h后收取细胞培养液上清，3000r/min，4℃离心10min，除去细胞碎片；然后将上清液放于透析袋内，用PEG 8000包埋法进行浓缩；浓缩后的上清置于Ni²⁺离子亲和层析平衡液(50mmol/L Na₃PO₄、500mmol/LNaCl，pH7.0)中4℃透析过夜。然后将透析后的上清液与平衡过的树脂混匀，与4℃轻轻摇晃吸附1h，用250mmol/L咪唑洗脱，收集洗脱液，进行SDS-PAGE电泳分析，然后将目的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，与抗E2蛋白单克隆抗体HQ06(侯强，彭伍平，孙元，等.猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的原核表达及其单克隆抗体的制备.中国兽医科学，2008，38(1)：1-5)进行Western blot活性分析。

试验结果：纯化后Shimen-E2蛋白与HCLV-E2蛋白具有较高的纯度与良好的反应活性。

2、小鼠免疫

用50μg纯化的杆状病毒表达的重组HCLV-E2蛋白腹腔注射8周龄雌性BALB/c小鼠；分别于15min、24h、48h后腹腔注射环磷酰胺(100mg/kg体重)。2w和4w后分别重复此免疫抑制过程。最后一次注射环磷酰胺2w后，腹腔注射用弗氏完全佐剂乳化的50μg Shimen-E2蛋白；2w和4w后重复此过程。10d后用50μgShimen-E2蛋白加强免疫，3d后取脾用于细胞融合。

3、细胞融合

融合前2d准备饲养细胞，按照常规方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。断颈处死待取脾的小鼠，无菌取其脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞5∶1的比例用PEG进行融合，融合后的细胞铺于准备好的饲养细胞之上(Kohler G，Milstein C.Continuous cultures of fused cell secretingantibody of predefined specificity.Nature，1975，256(5517)：495-497.)。

4、阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆

分别用纯化的重组蛋白HCLV-E2与Shimen-E2包被聚苯乙烯板，收取融合后10d的细胞培养上清进行间接ELISA检测。经检测与HCLV-E2反应为阴性、与Shimen-E2反应为阳性的杂交瘤细胞扩大培养，同时用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的克隆，克隆3轮，将克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。

经过3次对HCLV-E2蛋白的耐受和3次Shimen-E2蛋白免疫后，取抗体阳性小鼠的脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选与HCLV-E2反应为阴性而与Shimen-E2反应为阳性的杂交瘤细胞，经过3轮克隆后获得了1株能够稳定分泌特异性针对Shimen-E2蛋白的单克隆抗体(命名为4A4)的杂交瘤细胞株。

5、单克隆抗体的大量制备

给10周龄左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，0.5mL/只，1w后腹腔注射10⁵个杂交瘤细胞，7-10d后当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，隔2d抽一次，将抽取的腹水10000r/min离心10min，去除上层油脂和沉淀，上清分装于-20℃保存。

试验例1单克隆抗体的鉴定

1、间接免疫荧光试验(IFA)

分别将感染CSFV石门株72h的PK15细胞与感染CSFV C株7d的原代犊牛睾丸细胞(BT细胞)吹下，离心后，用PBS重悬，将细胞涂在载玻片上，然后用冷丙酮固定8min，加入实施例1所制备的杂交瘤细胞培养上清，37℃作用1h后，用PBS洗3遍，5min/次，再加入1∶200稀释的FITC荧光标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃作用45min，PBS洗3遍后，晾干载玻片，加入缓冲甘油，盖上盖玻片，置荧光显微镜下观察。

试验结果证实，本发明所制备的单克隆抗体4A4能够与CSFV石门株发生特异性反应，而与兔化弱毒疫苗株不发生反应(图1)。进一步实验证明，单克隆抗体4A4可以识别HLJ-1(05)、GZ1(98)、ZJ2(99)和HuB2(98)等4株不同基因亚群的猪瘟病毒野毒株。

2、抗原捕捉ELISA

分别用纯化的单克隆抗体HQ06与4A4包被聚苯乙烯板，用封闭液封闭后，再分别将感染石门株、LJ-1(05)、GZ1(98)、ZJ2(99)和HuB2(98)等5株猪瘟病毒的PK15细胞上清与感染CSFV C株的原代犊牛睾丸细胞上清加入孔中，37℃作用2h后，用PBST洗3遍，每次5min。然后加入辣根过氧化物酶标记的抗CFSV抗体(IDEXX公司)，37℃作用1h后，用PBST洗3遍，每次5min。加入100μLTMB显色液，避光显色10min，最后加入100μL终止液(2mol/L H₂SO₄)终止反应，用酶标仪读取OD_450nm值。

抗原捕捉ELISA结果证实，单克隆抗体4A4能够与CSFV石门株发生特异性反应，而与兔化弱毒疫苗株不发生反应(图2)。同时，4A4可以与HLJ-1(05)、GZ1(98)、ZJ2(99)和HuB2(98)等4株不同亚群CSFV野毒株发生反应(结果未显示)。

3、中和性免疫荧光试验

将PK15细胞铺于96孔板内，次日将筛选的杂交瘤细胞培养上清(实施例1所制备)连续2倍稀释(同时用猪瘟病毒中和性单克隆抗体WH303[Kohler G，Milstein C.Continuous cultures of fused cell secreting antibody of predefinedspecificity.Nature，1975，256(5517)：495-497.]作为阳性对照，然后将各稀释度的杂交瘤细胞培养上清分别与100TCID₅₀的HLJ-1(05)、GZ1(98)、ZJ2(99)和HuB2(98)等4株不同基因亚群的猪瘟病毒混和，在37℃培养箱中作用1h。再将混合物加入到铺有PK15细胞的96孔板内，在CO₂培养箱中培养72h后，按照间接免疫荧光试验的步骤进行，计算杂交瘤细胞上清中和效价(ND₅₀)。

试验结果表明：本发明所制备的单克隆抗体4A4能够中和石门株、HLJ-1(05)、GZ1(98)、ZJ2(99)和HuB2(98)等5株不同亚群CSFV的感染性，ND₅₀可达1∶30。

4、Western blot分析

取纯化的Shimen-E2蛋白与HCLV-E2蛋白进行SDS-PAGE分析，然后将其转移至NC膜上，进行与筛选到的单克隆抗体(实施例1所制备)的Western blot分析，以单克隆抗体HQ06(侯强，彭伍平，孙元，等.猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的原核表达及其单克隆抗体的制备.中国兽医科学，2008，38(1)：1-5.)作为对照，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG(HRP-IgG)。

Western blot分析显示，本发明单克隆抗体4A4与还原剂二硫苏糖醇(DTT)处理的HCLV-E2蛋白和Shimen-E2蛋白都不发生反应(图3)，而单克隆抗体HQ06与同样处理的HCLV-E2蛋白和Shimen-E2蛋白都可以反应，推测4A4可能针对的是E2蛋白的一个构象表位。

5、单克隆抗体的亚型鉴定

按照单克隆抗体亚型鉴定试剂盒操作说明书对实施例1所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定。

亚型鉴定结果显示，本发明单克隆抗体4A4的重链为IgG1型，轻链为κ链。

Claims (3)

1.一株分泌抗猪瘟病毒野毒株E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.2455。

2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断或检测猪瘟病毒试剂中的用途。

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