CN107058239B - 一种抗猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体细胞株及其应用 - Google Patents
一种抗猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体细胞株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体细胞株及其应用。本发明筛选得到了一株稳定分泌抗猪瘟病毒E2蛋白的杂交瘤细胞株，该细胞株所分泌的单克隆抗体CSFV‑1C8与CSFV的E2蛋白能够发生特异性反应，而与牛病毒性腹泻/粘膜病病毒E2蛋白不发生反应；该单克隆抗体能特异的识别猪瘟病毒E2蛋白，且其识别的表位为：FDFDGPDGL；本发明的单克隆抗体及该单克隆抗体所识别的猪瘟病毒E2蛋白表位可制成检测CSFV的试剂，为建立猪瘟病毒抗体的血清学检测方法奠定了基础。本发明建立的一种检测猪瘟抗体的竞争ELISA试剂盒具有特异、敏感和操作简便等优点，适合猪瘟抗体的大规模筛查。
Description
技术领域
本发明涉及猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体细胞株及其在应用，属于兽用生物制品领域。
背景技术
猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由黄病毒科(flaviviridae)瘟病毒属(pestivirus)的重要成员猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种高度接触性传染病，是世界动物卫生组织(OIE)规定的必需报告的疫病之一，在我国属一类动物传染病。CSFV为有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子直径为25～50nm。与CSFV同属的还有牛病毒性腹泻病病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)和羊边界病病毒(Borderdisease virus,BDV),这三种病毒结构相似，血清学上存在交叉反应，并且有相似的宿主范围。猪(包括家猪和野猪)是唯一的易感宿主。CSF根据病程的不同可分为急性、亚急性、慢性和非典型性猪瘟。近些年来，世界范围内CSF流行发生了明显变化：从以前的大规模暴发流行转变为地区性、周期性、散发形式。一些原本宣布消灭CSF的国家又相继出现复发，我国的CSF发病率也呈上升趋势。同时，多种病原混合感染也成为目前十分严重的现象，给临床诊断和防治工作带来了很大的困难。
CSFV的囊膜糖蛋白E2(gp55)是研究得较为清楚的一种结构蛋白。其位于病毒囊膜表面。在CSFV编码的蛋白中，E2是最不保守的一种蛋白，但又是CSFV的主要保护性抗原蛋白，主要参与病毒的感染过程并诱导机体产生中和抗体。其空间构型由三个疏水区和三个N端的链内二硫键构成。E2蛋白由ORF编码的690(Arg)至1060(Leu)之间的370个氨基酸残基组成，在靠近E2蛋白N端上游有一段信号肽序列。利用针对E2蛋白的各种单抗，Wensvoort通过实验已证实CSFV E2具有4个相对独立的抗原结构域，分别为A、B、C和D，其中A、B、C含有中和性抗原表位。后经van Rijn等人的研究，将这4个区域的位置确定下来。按照van Rijn等预测的E2抗原结构模型，这些抗原结构域位于E2蛋白近N端的1/2部分，且处于两个相对独立的抗原结构单位，一个由结构域B和C组成，另一个则由高度保守的A构成，A又可分为A1、A2、A3三个亚结构域，A结构域中含有一疏水区，此疏水区在瘟病毒属中高度保守。A1和A2都很保守，只有A1能产生中和性抗体；A3与D既不产生中和性抗体，也不保守。CSFV上述抗原结构单位(B/C或A)所诱导的免疫反应都足以保护猪免受强毒攻击，由于E2蛋白是CSFV的免疫优势蛋白，所以人们一直尝试着把E2囊膜糖蛋白作为研制针对CSFV新型疫苗的首选靶蛋白。2000年Lin等报道了CSFV E2抗原表位TAVSPTTLR，该表位位于E2氨基酸序列的829～837位，具有中和活性，在CSFV内高度保守，为CSFV特异的抗原表位，而其他瘟病毒没有这一表位；此外，E2还具有一个所有瘟病毒都有的保守性抗原表位YYEP，位于E2羧基端得995～998位氨基酸。通过对E2蛋白单克隆抗体的进一步筛选，继而进一步获得E2蛋白抗原表位信息，不仅有助于分析E2蛋白的结构，对CSFV的新型诊断技术研发和猪瘟病毒的基础研究也具有积极意义。
发明内容
本发明目的之一是提供一株分泌抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株(简称单克隆抗体细胞株)；
本发明目的之二是提供一株由上述单克隆抗体细胞株所分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体可与CSFV-E2蛋白发生特异性反应；
本发明的目的之三在于提供含有该株单克隆抗体的抗体检测试剂盒；
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
1.一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株，其特征在于所述细胞株命名为抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞CSFV-1C8株，该细胞株已于2016年12月20日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.13387。
2.本发明所述的一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株，其特征在于所述细胞株能稳定地分泌猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体。
3.本发明所述的一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株的应用，其特征在于该CGMCC No.13387细胞株分泌的抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体在检测猪瘟病毒抗体检测试剂盒中的应用。
4.本发明所述的一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株的应用，其特征在于该试剂盒主要含有包被了猪瘟病毒E2蛋白的抗原包被板和由抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞CGMCC No.13387株产生的被标记辣根过氧化物酶的猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体。
5.本发明所述的一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株的应用，其特征在于该试剂盒为猪瘟病毒E2检测猪瘟抗体的竞争ELISA试剂盒。
具体实施方式
1.猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体细胞株的制备
(1)动物免疫取6周龄的BALB/C雌性小鼠5只，将真核表达纯化的猪瘟病毒E2蛋白与等量的弗氏完全佐剂混合乳化后，按100μg/只的剂量在小鼠背部多点注射；14天后，采用E2蛋白与等量弗氏不完全佐剂混合乳化后，按上述方法进行加强免疫；14天后，重复免疫1次。14天后，眼眶采血，分离血清，用间接ELISA方法测定免疫小鼠抗体效价。选择抗体效价最高的小鼠，腹腔注射100μg E2蛋白。3天后，取脾脏进行细胞融合。
(2)细胞融合细胞融合前1天。制备饲养细胞。按常规方法制备小鼠腹腔巨噬细胞，铺于96孔细胞培养板中。融合当天，断颈处死免疫小鼠，无菌摘取脾脏，分别用150目和200目的铜网进行研磨和过滤，与处于对数生长期的SP2/0细胞按照10:1的比例进行混合，离心弃上清，在1min内向细胞混合物中缓慢加入1ml 50％PEG，随后分步加入10ml DMEM培养基进行终止。离心后，用含1％HAT和15％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，铺于96孔细胞培养板中。
(3)杂交瘤细胞的筛选和亚克隆将猪瘟病毒Thiveral株病毒用无血清培养基稀释至200TCID50/0.1ml，接种长满单层的96孔PK15细胞板中，37℃5％CO2培养72h后，弃培养液，固定，用于融合细胞的筛选。将融合细胞上清加入到固定后的PK15细胞板中，37℃反应1h，PBS漂洗3次，加入工作浓度的FITC标记的羊抗鼠二抗，37℃反应1h。PBS漂洗3次后，置于倒置荧光显微镜下观察。将出现特异性胞浆染色的阳性孔中对应的杂交瘤细胞，用有限稀释法进行亚克隆，重复上述筛选方法，亚克隆3～4轮，最终获得一株稳定分泌CSFV E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株命名为抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞CSFV-1C8株，该细胞株已于2016年12月20日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.13387，将其分泌的抗体命名为猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体1C8，本发明又简称1C8抗体。
(4)单克隆抗体腹水的制备取经产的BALB/C小鼠，腹腔注射无菌的液体石蜡，0.5ml/只，1周后，腹腔注射杂交瘤细胞CSFV-1C8，1～2×105个/ml，0.5ml/只，待小鼠腹腔膨大，出现明显波动感时，用注射器抽取腹水。将抽取的腹水离心10000r/min离心10min，分离上清保存于-20℃。
(5)单克隆抗体的纯化将收集的单克隆抗体腹水10000r/min离心10min，取上清，每毫升腹水中加入40μl 10％硫酸葡聚糖溶液和1ml CaCl2溶液。室温混合15min后，10000r/min离心10min，取上清。用葡聚糖G-50层析柱进行脱盐处理，将收集的蛋白按照HiTrap Protein G HP亲和层析柱说明书进行纯化，收集目的蛋白峰。纯化后的1C8单抗见图5。
本发明所述的猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体具有良好的特异性，与牛病毒性腹泻/粘膜病病毒、伪狂犬病毒和猪细小病毒均无交叉反应。
本发明利用多肽扫描技术对CSFV-1C8所识别的E2蛋白表位进行了鉴定，最终将其表位确定为：FDFDGPDGL，该表位位于E2氨基酸的898～906位。同时，序列比对结果显示，这个多肽表位为CSFV特有表位，同属的BVDV和BDV无此表位。
本发明还提供包含所述的猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的检测试剂盒。
本发明所述猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体在制备检测猪瘟病毒抗体检测试剂盒中的应用。
本发明采用纯化的猪瘟病毒E2蛋白包被于抗原包被板，结合辣根过氧化物酶标记的猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体，应用竞争ELISA原理检测猪瘟病毒抗体。
本发明所述的免疫检测试剂盒包含包被了猪瘟病毒E2蛋白的抗原包被板，标记了辣根过氧化物酶的猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体，底物液和终止液。
本发明还提供一种猪瘟病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒在检测猪瘟病毒抗体中的应用。
附图说明
图1：1C8单抗与CSFV E2蛋白反应的Western-blot鉴定结果。M：蛋白Marker；1、2、3为猪瘟病毒E2蛋白与1C8单抗反应条带。
图2：1C8单抗与CSFV E2蛋白和BVDV E2蛋白的反应性实验
图3：1C8单抗的表位鉴定结果
图4：不同浓度包被抗原和1C8单抗的N/P值
图5：纯化后的1C8单克隆抗体
图6：最适反应时间的确定
图7：猪瘟病毒竞争ELISA抗体检测方法临界值的ROC曲线分析
图8：已知背景血清的检测结果
本发明涉及的生物材料资源信息
猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，菌种保藏编号:CVCC AV1211株,p139)，猪细小病病毒(Porcine parvovirus,菌种保藏编号:CVCC AV30株,p144)，牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,菌种保藏编号:CVCC AV67株p144)和CSFV Thiveral株(Classical swine fever virus,菌种保藏编号:CVCC AV65株p145)由中国兽医药品监察所鉴定、保藏、提供；SP2/0细胞、PK-15细胞(CVCC CL24株,p162)均由本实验室保存,(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p139,p144,p145,p162)
本发明的积极意义
本发明涉及一种抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体细胞株及其应用。本发明筛选得到了一株稳定分泌抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，该细胞株所分泌的单克隆抗体CSFV-1C8与CSFV的E2蛋白能够发生特异性反应，而与牛病毒性腹泻/粘膜病病毒E2蛋白不发生反应；该单克隆抗体能特异的识别猪瘟病毒E2蛋白，且其识别的表位为：FDFDGPDGL；本发明的单克隆抗体及该单克隆抗体所识别的猪瘟病毒E2蛋白表位可制成检测CSFV的试剂，为建立猪瘟病毒抗体的血清学检测方法奠定了基础。本发明建立的一种检测猪瘟抗体的竞争ELISA试剂盒具有特异、敏感和操作简便等优点，适合猪瘟抗体的大规模筛查。
实施例
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
本发明所使用的主要实验材料和来源：
1.蛋白、细胞和病毒
真核表达并纯化的CSFV E2蛋白、BVDV E2蛋白、SP2/0细胞、PK-15细胞和CSFVThiveral株均由本实验室制备和保存；猪伪狂犬病病毒(菌种保藏编号：CVCC AV1211)，猪细小病病毒(菌种保藏编号:CVCC AV30)，牛病毒性腹泻病毒(菌种保藏编号:CVCC AV67)及相应病毒的特异性血清由中国兽医药品监察所鉴定、保藏、提供。
2.主要试剂
胎牛血清：购自Sigma公司；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自康为试剂生物科技有限公司；FITC标记羊抗鼠IgG抗体、FITC标记兔抗猪二抗、HRP标记兔抗鼠IgG抗体、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、辣根过氧化物酶购自Sigma公司；蛋白Marker购自Fermentas公司；50％PEG、50×HAT、50×HT购自sigma公司；DMEM、MEM培养基购自Gibcol公司；PierceRapid ELISA Mouse mAb Isotyping kit购自Thermo公司；Vector VIP显色剂，购自美国Vetorlabs公司；HiTrap Protein G HP层析柱，购自GE Healthcare公司；BSA，购自Calbiochem公司。
3.实验动物
6～8周龄和经产BALB/C小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实施例1
——抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备
1.动物免疫
取6周龄的BALB/C雌性小鼠5只，将真核表达纯化的猪瘟病毒E2蛋白与等量的弗氏完全佐剂混合乳化后，按100μg/只的剂量在小鼠背部多点注射；14天后，采用E2蛋白与等量弗氏不完全佐剂混合乳化后，按上述方法进行加强免疫；14天后，重复免疫1次。14天后，眼眶采血，分离血清，用间接ELISA方法测定免疫小鼠抗体效价。选择抗体效价最高的小鼠，腹腔注射100μgE2蛋白。3天后，取脾脏进行细胞融合。
2.细胞融合
细胞融合前1天。制备饲养细胞。按常规方法制备小鼠腹腔巨噬细胞，铺于96孔细胞培养板中。
融合当天，断颈处死免疫小鼠，无菌摘取脾脏，分别用150目和200目的铜网进行研磨和过滤，与处于对数生长期的SP2/0细胞按照10:1的比例进行混合，离心弃上清，在1min内向细胞混合物中缓慢加入1ml 50％PEG，随后分步加入10ml DMEM培养基进行终止。离心后，用含1％HAT和15％胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，铺于96孔细胞培养板中。
3.杂交瘤细胞的筛选和亚克隆
将猪瘟病毒Thiveral用无血清培养基稀释至200TCID50/0.1ml，接种长满单层的96孔PK15细胞板中，37℃5％CO2培养72h后，弃培养液，固定，用于融合细胞的筛选。将融合细胞上清加入到固定后的PK15细胞板中，37℃反应1h，PBS漂洗3次，加入工作浓度的FITC标记的羊抗鼠二抗，37℃反应1h。PBS漂洗3次后，置于倒置荧光显微镜下观察。将出现特异性胞浆染色的阳性孔中对应的杂交瘤细胞，用有限稀释法进行亚克隆，重复上述筛选方法，亚克隆3～4轮，最终获得一株稳定分泌CSFV E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株命名为抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞CSFV-1C8株，该细胞株已于2016年12月20日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.13387，将其分泌的抗体命名为猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体1C8，本发明又简称1C8抗体。
4.单克隆抗体腹水的制备
取经产的BALB/C小鼠，腹腔注射无菌的液体石蜡，0.5ml/只，1周后，腹腔注射杂交瘤细胞CSFV-1C8，1～2×105个/ml，0.5ml/只，待小鼠腹腔膨大，出现明显波动感时，用注射器抽取腹水。将抽取的腹水离心10000r/min离心10min，分离上清保存于-20℃。
实施例2
——单克隆抗体的鉴定
1.单克隆抗体亚型鉴定
根据Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping kit说明书对实施例1中所得到的单克隆抗体进行亚类鉴定。
结果显示，本发明单克隆抗体1C8的重链为IgG1，轻链为Kappa链。
2.Western blot鉴定
将E2蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白条带转印至硝酸纤维素膜上，经5％脱脂奶粉封闭后，加入单克隆抗体细胞培养上清，37℃孵育1h，用PBST漂洗3次，加入工作浓度的HRP标记兔抗鼠IgG，37℃孵育1h，用PBST漂洗3次。按照Vector VIP说明书进行显色。
如图1所示，1C8单抗与CSFV E2蛋白能够发生特异性结合，在45KD处出现特异性条带。
3.特异性鉴定
将CSFV、PRV、PCV-2、PPV和BVDV分别接种敏感细胞。37℃5％CO2培养72小时后，对接毒细胞进行固定。将接毒后的细胞分为两组，第一组向接毒细胞中加入1C8细胞上清，第二组加入相应病毒的特异性的抗体。37℃作用1h，PBS漂洗细胞3次，加入工作浓度的FITC标记二抗，37℃作用1h，PBS漂洗细胞3次，倒置显微镜下观察细胞染色情况。从结果可以看出，第二组接毒细胞中均出现了特异性的荧光，说明病毒在敏感细胞上正常生长。而第一组细胞中仅有猪瘟病毒Thiveral株出现了特异性荧光。从结果说明，该株单抗与猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和牛病毒性腹泻/粘膜病病毒不发生反应。
为了进一步排除1C8单抗与BVDV E2蛋白的交叉反应，将纯化的CSFV E2蛋白和BVDV E2蛋白同时包被ELISA反应板，与1C8单抗进行间接ELISA反应，结果见图2。从图中可以看出，1C8单抗仅与CSFV E2蛋白发生反应，与BVDV E2蛋白无交叉反应。
4,表位鉴定
采用多肽扫描技术，对1C8单抗所对应的表位进行鉴定。构建E2重组病毒的亲本毒株为猪瘟兔化弱毒疫苗株。因此，E2基因的氨基酸序列为序列1所示：
按照上述氨基酸序列合成15个氨基酸的多肽，重置14个氨基酸，共合成313条多肽序列，制备多肽芯片。用1C8单抗与芯片上的多肽分别反应，分析每条多肽与单抗的反应信号强度，确定单克隆抗体表位。
如图3所示，有5个表位与1C8单抗出现了5个反应位点，其中一个为强反应位点，所对应的序列为FDFDGPDGL；另外4个为弱反应位点，所对应的序列分别为：LLFDGTNPST，DGTNPSTEEMGDD，GDDFRSGL和CVTTIVENE。因此，确定1C8单抗所针对的E2蛋白表位为FDFDGPDGL。
5.单克隆抗体的纯化
将收集的单克隆抗体腹水10000r/min离心10min，取上清，每毫升腹水中加入40μl10％硫酸葡聚糖溶液和1ml CaCl2溶液。室温混合15min后，10000r/min离心10min，取上清。用葡聚糖G-50层析柱进行脱盐处理，将收集的蛋白按照HiTrap Protein G HP亲和层析柱说明书进行纯化，收集目的蛋白峰。纯化后的1C8单抗见图5。
实例3.
——猪瘟病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒的制备
1.单克隆抗体的标记
称取2mg辣根过氧化物酶粉末溶于0.5ml蒸馏水中，加入0.5ml新鲜配制的0.06MNaIO4溶液，4℃避光30min。加入160mM乙二醇0.5ml，室温放置30min。向上述溶液中加入亲和层析纯化的单抗2mg，混匀。将上述溶液装入透析袋内，置于2000ml 0.05M碳酸盐缓冲液中透析过夜。次日，将标记物移至15ml离心管中，加入0.2ml新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀。将溶液用葡聚糖G-50层析，收集蛋白峰，去除未结合的辣根过氧化物酶。
2.抗原最适包被浓度和HRP标记1C8单抗最适工作浓度的确定
分别将CSFV E2蛋白稀释至1μg/ml、0.5μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml和0.05μg/ml包被酶标板，每个浓度包被1行。分别在酶标板的1、3、5、7、9列加入猪瘟抗体阳性血清，2、4、6、8、10列加入猪瘟抗体阴性血清，50μl/孔。将HRP标记1C8单抗分别按照1:1000、1:2000、1:4000、1:6000和1:8000稀释。每个稀释度的单抗依次加2列。37℃反应1h，PBST洗板3次，加入TMB显色液显色10min，终止，读OD450nm吸光值。如表1所示。计算N/P值，选择比值最高的抗原和单抗浓度的组合作为最佳稀释倍数。如图4所示。结果表明，CSFV E2蛋白的最适包被浓度为0.1μg/ml，HRP标记单抗的最佳稀释倍数为1:6000。
表1 抗原最适包被浓度和HRP标记1C8单抗最适工作浓度的确定
3.最适反应时间的确定
将CSFV E2蛋白以0.1μg/ml的浓度包被反应板，封闭后，在相应孔中分别加入50μl阳性对照血清和50μl阴性对照血清，再在所有反应孔中加入50μl 1:6000稀释的HRP标记单抗，37℃分别反应0.5h、1h、1.5h和2h，比较不同反应时间的反应效果。结果显示，当反应1h后，抗原抗体反应达到平衡，OD值基本维持恒定，因此，确定37℃1h为最适反应条件。图6。
4.临界值的确定
本试剂盒采用抑制率作为结果判定参数。
抑制率＝(阴性对照OD450nm-样本OD450nm)/阴性对照OD450nm×100％
从田间采集298份猪瘟抗体阴性猪血清和350份猪瘟抗体阳性猪血清，用建立的竞争ELISA方法进行检测，计算每份血清的抑制率。采用SPSS软件进行分析，以1-特异性为纵坐标，敏感性为横坐标，绘制ROC曲线，如图7，ROC曲线相关参数见表2。从表2中可以看出，曲线的下面积为0.996765，证明本诊断方法的准确率极高，该竞争ELISA试剂盒具有很高的诊断价值。
在ROC曲线的基础上计算Youden指数(Youden指数＝Youden指数＝敏感性-(1-特异性))，选择Youden指数最大值所对应的抑制率作为临界值，最终确定临界值为37％。见表3。在此临界值下，本方法所对应的敏感性为92.9％，特异性为98％。
表2 ROC曲线相关参数
表3 临界值所对应的敏感性、特异性及Youden指数(部分)
5.基于猪瘟病毒竞争ELISA抗体检测方法检测猪血清
取8份猪瘟抗体免疫血清(包含强阳性2份，中阳性3份，弱阳性3份)，非免疫猪瘟抗体血清8份，共计16份血清样本，采用建立的猪瘟病毒竞争ELISA抗体检测方法进行检测，主要操作方法如下：
将CSFV E2蛋白用碳酸盐缓冲液稀释至0.1μg/ml，加入到96孔酶标板中，100μl/孔，2～8℃放置16h，用PBST洗板1次；用含3％BSA的PBS缓冲液封闭，300μl/孔，2～8℃放置24h，用PBST洗板3次。将待检的16份猪血清与阴、阳性对照血清加入到相应孔中，50μl/孔，再向所有孔中加入1:6000稀释的HRP-1C8单抗，50μl/孔，37℃反应1h。PBST洗板3次。每孔加入TMB底物显色液，100μl/孔，显色10min，加入1mol/L HCl溶液终止反应，测定OD450nm吸光值。结果见图8。
结果显示，免疫血清和非免疫血清OD450nm吸光值能够明显区分。免疫血清的吸光值均在37％以上，其中，强阳性血清吸光值均大于70％，中阳性血清在50％～70％之间，弱阳性血清在37％～45％之间；非免疫血清的吸光值均小于30％。所得结果与预期一致，证明本试剂盒用于检测猪瘟免疫抗体有效且实用。
序列表
<110> 中国兽医药品监察所
<120> 一种抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体细胞株及其应用
<130>
<160> 1
<170> Patentin version 3.5
<210> 1
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 对人工序列的描述：猪瘟病毒E2基因的氨基酸序列
<400> 1
Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asp
5 10 15
Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu
20 25 30
Tyr Asn His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr Val Lys Ala Ser Cys
35 40 45
Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg
50 55 60
Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Lys Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe
65 70 75 80
Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr Glu Glu Met Gly Asp
85 90 95
Asp Phe Arg Ser Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Ser Pro Val Val Lys
100 105 110
Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val
115 120 125
Cys Pro ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro
130 135 140
Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Arg Arg Asp Lys Pro
145 150 155 160
Phe Pro His Arg Met Asp Cys Val Thr Thr Ile Val Glu Asn Glu Asp
165 170 175
Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Glu
180 185 190
Pro Val Val Tyr Thr Gly Gly Val Val Lys Gln Cys Arg Trp Cys Gly
195 200 205
Phe Asp Phe Asp Gly Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys
210 215 220
Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Ile Val Asp Ser Thr Asp
225 230 235 240
Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu Gly Ser His Glu Cys
245 250 255
Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Ser Asp Glu Arg Leu
260 265 270
Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro
275 280 285
Val Met Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Lys Thr Leu Lys Asn
290 295 300
Arg Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys
305 310 315 320
Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp
325
2
Claims (4)
1.一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株，其特征在于，所述细胞株命名为抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞CSFV-1C8株，该细胞株已于2016年12月20日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC No.13387。
2.如权利要求1所述的一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株在制备试剂盒中的应用，其特征在于，该CGMCC No. 13387细胞株分泌的抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体在检测猪瘟病毒抗体检测试剂盒中的应用。
3.如权利要求2所述的一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株在制备试剂盒中的应用，其特征在于，该试剂盒含有包被了猪瘟病毒E2蛋白的抗原包被板和由抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞CGMCC No. 13387株产生的被标记辣根过氧化物酶的猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体。
4.如权利要求2或3所述的一株抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体细胞株在制备试剂盒中的应用，其特征在于，该试剂盒为猪瘟病毒E2检测猪瘟抗体的竞争ELISA试剂盒。
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