CN107828745B - 猪瘟兔化弱毒表位突变株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及猪瘟兔化弱毒株表位突变株及其应用。本发明构建的猪瘟兔化弱毒株表位突变株，不仅保持了猪瘟兔化弱毒株安全性好，免疫原性优良等特点，而且该毒株稳定性好，细胞生产病毒含量高，能用于工业化大生产，免疫猪体后产生的抗体可区分免疫和自然感染，在猪瘟净化过程中或暴发疫情时免疫，根据是否存在免疫抗体，有选择的屠杀感染田间毒的动物，可降低经济损失，有利于猪瘟的净化根除及紧急免疫，对防控净化猪瘟及紧急免疫都具有重大意义。

Description

猪瘟兔化弱毒表位突变株及其应用
技术领域
本发明涉及猪瘟兔化弱毒表位突变株及其应用，属于兽用生物制品领域。
背景技术
一直以来，猪瘟是猪的最重要传染病之一，发病率高，死亡率高，一旦暴发往往引起巨大的经济损失，OIE将其列为法定通报疫病，我国将其归类为一类动物传染病。欧美等发达国家在经过几十年的免疫控制后，已逐渐消灭了猪瘟，但在部分发展中国家使用疫苗免疫，仍然出现非典型、温和型猪瘟，以及持续感染、隐性感染等现象。在这些国家，淘汰感染猪只、净化猪群是当务之急。我国用猪瘟兔化弱毒株(又称C株)生产的猪瘟活疫苗以其良好的安全性、免疫原性以及坚强免疫力被全世界广泛应用，为猪瘟疫苗的“金标准”，但该毒株免疫后不能区分免疫与自然感染动物(differentiation of infected fromvaccinated animals，DIVA)，因此净化猪瘟时使用该疫苗很难通过测定抗体筛出感染猪。
此外，猪瘟在非免无疫区暴发时将造成巨大的经济损失，如欧洲1997/1998年发生的猪瘟。当猪瘟暴发时采取扑杀及紧急免疫措施有利于控制疫情，出于经济和动物福利考虑，紧急免疫接种标记疫苗具有重要的经济效益和社会效益。
鉴于以上原因，猪瘟标记疫苗一直是近些年的研究热点，按照文献报道，可将标记疫苗分为阳性标记、阴性标记和双标记疫苗(Dong,X.N.,Chen,Y.H.,2007.Marker vaccinestrategies and candidate CSFV marker vaccines.Vaccine 25,205-230.)。阳性标记疫苗通常引入外源基因，可判断动物是否免疫。表位突变毒株通常缺失部分中和表位或蛋白，可通过检测针对缺失表位或蛋白产生的抗体区分免疫与自然感染动物。双标记疫苗通常含有上述两种标记，便于更好的区分免疫与感染动物。
亚单位疫苗、活载体疫苗、反向遗传修饰疫苗、DNA疫苗等均可以归为标记疫苗。其中E2亚单位疫苗是最早开发的猪瘟标记疫苗，如
Figure BDA0001469279240000011
Pesti及
Figure BDA0001469279240000012
但欧盟猪瘟参考实验室对这两种疫苗进行猪体免疫攻毒及阻止水平传播等进行了评估，发现E2亚单位疫苗与经典C株疫苗相比，抗体产生时间较晚，免疫保护力不够坚强，免疫攻毒后不能阻止水平传播等，建议不作为紧急免疫用疫苗。
活载体疫苗是以其它病毒为载体，插入猪瘟病毒的主要免疫抗原基因而获得，如腺病毒、伪狂犬病毒等，近期以BVDV为载体的CP7_E2Alf疫苗已在欧洲通过注册，该毒株(CP7_E2Alf)将BVDV E2替换为猪瘟E2基因，该疫苗属于表位突变毒株，在野猪口服免疫中取得了良好效果(Koenig,P.,Lange,E.,Reimann,I.,Beer,M.,2007.CP7_E2alf:a safeand efficient marker vaccine strain for oral immunisation of wild boaragainst Classical swine fever virus(CSFV).Vaccine 25,3391-3399.)。2009年L.G.Holinka等以猪瘟病毒Brescia株为基础研究开发了双标记疫苗，插入外源片段Flag并突变E2蛋白表位，获得了较好的免疫攻毒结果(Holinka,L.G.,Fernandez-Sainz,I.,O'Donnell,V.,Prarat,M.V.,Gladue,D.P.,Lu,Z.,Risatti,G.R.,Borca,M.V.,2009.Development of a live attenuated antigenic marker classical swine fevervaccine.Virology 384,106-113)，但该疫苗以强毒株为基础，毒力返强的可能性较高，并且其免疫谱未知，是否具有我国C株的普遍适用性也不得而知。
发明内容
本发明的目的在于以猪瘟病毒C株全长感染性克隆为基础，将E2基因中的某一表位进行突变或缺失，经病毒拯救获得猪瘟兔化弱毒株的表位突变毒株。该毒株病毒遗传稳定性良好，即保持着C株优秀的安全性、免疫原性等特点，制备的疫苗免疫动物后攻毒保护效果良好，还能通过检测相应表位的抗体，用于区分免疫动物与自然感染动物。
本发明技术方案
1.一种猪瘟兔化弱毒表位突变株，其特征在于该毒株是通过以猪瘟病毒C株全长感染性克隆为基础，将其E2基因中的某一表位进行突变或缺失，经病毒拯救而获得的一株猪瘟C株的表位突变毒株，被命名为猪瘟病毒(Hog cholera virus)猪瘟兔化弱毒表位突变株(mHCLV-ZJS，简称mHCLV),该毒株于2017年11月3日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.12377。
2.如本发明所述一种猪瘟兔化弱毒表位突变株，其特征在于该突变株病毒E2蛋白的氨基酸序列与C株相比，至少含有以下一种氨基酸替换或缺失：第774位替换为Asn，第830位替换为Ser，第831位替换为Phe或Gly，第832位替换为Gly，第833位替换为Met或缺失，第834位替换为Asp或缺失；优选为含有第774位替换为Asn，第830位替换为Ser，第831位替换为Phe或Gly，第832位替换为Gly，第833位替换为Met，第834位替换为Asp。
3.如本发明所述一种猪瘟兔化弱毒株表位突变株，其特征在于该突变株病毒E2基因核苷酸序列与C株相比，有以下一种或多种替换：第2694-2696位核苷酸替换为序列1，第2862-2876位核苷酸替换为序列2，第2865-2876位核苷酸替换为序列3，第2865-2876位核苷酸替换为序列4；优选为第2862-2876位核苷酸替换为序列2。
4.如本发明所述的猪瘟兔化弱毒株表位突变株，其特征在于该毒株其E2蛋白中TAVSPTT表位氨基酸序列与C株相比，替换为序列6或/和序列7或/和序列8，优选为TAVSPTT表位氨基酸序列替换为序列6。
5.如本发明所述的猪瘟兔化弱毒表位突变株的构建，其特征在于可通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、测序、过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和间接免疫荧光染色(IFA)来区分猪瘟病毒C株表位突变毒株与猪瘟病毒C株及猪瘟病毒野毒株。
6.本发明所述的猪瘟兔化弱毒株表位突变株的应用，其特征在于该毒株可作为生产毒株制备猪瘟活疫苗。
7.本发明所述的猪瘟兔化弱毒株表位突变株的应用，其特征在于该株病毒制备的疫苗免疫猪体后，可通过检测针对氨基酸序列5的血清学抗体来区分疫苗免疫与野毒感染动物，免疫猪不产生针对序列5的抗体，野毒感染猪可产生针对序列5的抗体。
8.本发明所述的猪瘟兔化弱毒株表位突变株的应用，其特征在于可通过酶联免疫吸附试验(ELISA)来区分免疫抗体与自然感染抗体。
本发明具体实施方式
1.猪瘟兔化弱毒表位突变毒株的构建
本发明猪瘟兔化弱毒表位突变毒株基于反向遗传操作技术，以猪瘟病毒C株全长感染性克隆为基础，通过基因突变或缺失，将E2基因中重要表位的关键氨基酸替换或缺失而获得。具体是通过以下技术方案实现的(见图1)：
(1)目的序列扩增：通过重叠PCR将替换或缺失的编码序列引入，分别用序列9和序列10扩增引入替换序列2，序列11和序列12引入替换序列3，序列13和序列14引入序列4。
(2)定点突变：将以上序列2或序列3或序列4用定点突变试剂盒将第2694-2696位核苷酸突变为序列1。
(3)猪瘟C株阴性标记感染性克隆构建：将含有序列2或序列3或序列4的重叠PCR产物经酶切连接至猪瘟C株全长感染性克隆pAC-CS，即为pAC-CS-N M。
(4)体外转录：将猪瘟病毒C株表位突变毒株全长感染性克隆pAC-CS-N M质粒线性化处理，通过体外转录试剂盒(Ambion公司)转录成RNA。
(5)病毒拯救：通过电转染或脂质体转染将含标记的pAC-CS-Marker质粒或RNA转染到猪瘟病毒易感细胞SK6(或ST、PK15等)，成功拯救出病毒，被命名为猪瘟病毒(Hogcholera virus)猪瘟兔化弱毒株表位突变株(mHCLV),该毒株于2017年11月3日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.12377。
2.猪瘟兔化弱毒表位突变毒株的特征
猪瘟病毒兔化弱毒株经突变或缺失后，其特征在于E2蛋白包含与野生型猪瘟病毒不同的序列，由此所述病毒氨基酸及核苷酸序列至少含以下一种突变或缺失。
(1)猪瘟病毒兔化弱毒表位突变毒株E2蛋白氨基酸序列至少含有以下一种替换或缺失：
氨基酸第774位替换为N；
氨基酸第830位替换为S；
氨基酸第831位替换为F或G；
氨基酸第832位替换为G；
氨基酸第833位替换为M或缺失；
氨基酸第834位替换为D或缺失。
(2)猪瘟病毒兔化弱毒表位突变毒株基因组E2基因至少含有以下一种或多种核苷酸替换：
第2694-2696位核苷酸替换为序列1；
第2862-2876位核苷酸替换为序列2；
第2865-2876位核苷酸替换为序列3；
第2865-2876位核苷酸替换为序列4。
(3)本发明的猪瘟病毒兔化弱毒表位突变毒株的特征在于可通过基因组及免疫学方法来区别于C株及野生型毒株。
(4)本发明的猪瘟病毒兔化弱毒表位突变毒株的特征在于基因组方法基于RT-PCR检测，序列测定，与C株及野生型毒株区分。
(5)本发明的猪瘟病毒兔化弱毒表位突变毒株的特征在于免疫学方法基于免疫IPMA或IFA，由此使用的针对TAVSPTT特异性表位及猪瘟其它通用表位的单克隆抗体。
(6)本发明的猪瘟病毒兔化弱毒表位突变毒株的特征在于可用于预防猪瘟，并通过检测接种动物抗体及感染野生型猪瘟病毒动物抗体将免疫动物与感染动物区分。
(7)本发明的猪瘟病毒兔化弱毒表位突变株特征在于抗体检测方法基于酶联免疫吸附测定(ELISA)，由此使用的特异性单克隆抗体。
3.猪瘟兔化弱毒表位突变毒株繁殖及特性检验
(1)病毒繁殖
(2)病毒检测：用猪瘟病毒特异性单克隆抗体WH303(针对TAVSPTT表位)和1C8进行IPMA及IFA染色，以上猪瘟表位突变毒株均不与WH303反应，与1C8反应，而C株及野生型毒株与2株单抗均反应(见图2和图3)。
(3)病毒遗传稳定性检测：将以上毒株通过细胞传代(SK6、ST、PK-15)20代及兔体传代10代，以序列15和序列16通过RT-PCR检测及测序，病毒序列稳定，未发生变异。
(4)动物实验：选取经中和试验方法检测的无猪瘟中和抗体的健康易感断奶猪5头，每头肌肉注射病毒液1mL(含1×105最小兔体感染量)，接种后，每天上下午观察并测温，每2天采血一次，每次采血2mL，分离血清，用于检测猪瘟特异性抗体及标记抗体，采集至第60天，同时设空白对照及C株对照猪各2头。免疫猪只体温升高不超过1℃，稽留时间不超过24h，符合《中华人民共和国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)的安全检验规定。
(5)标记抗体检测：用人工合成的含TAVSPTT表位的标记蛋白包被ELISA反应板，通过间接ELISA测定免疫动物抗体，猪瘟兔化弱毒表位突变毒株免疫动物抗体检测结果为阴性，C株对照为阳性。用E2蛋白包被的ELISA反应板，通过间接ELISA测定动物抗体，C株标记疫苗及C株免疫动物抗体均为阳性。
(6)免疫攻毒保护检验：选取无猪瘟病毒中和抗体的猪4头接种表位突变毒株，每头肌肉注射1.0mL(1/150头份/mL)，接种10～14天后，连同对照猪3头，均注射猪瘟病毒石门系血毒1.0mL(含105最小致死量)，观察16日，免疫猪均出现保护，对照猪全部死亡。结果表明疫苗保护效果很好。
(7)本发明中猪瘟兔化弱毒表位突变株制造方法特征在于通过兔体繁殖及细胞繁殖，所述方法包括：
1)基于兔体繁殖，在兔体中多次传代，采集脾脏，研磨，加入牛奶蔗糖等冻干保护剂，用于病毒传代及生产疫苗。
2)基于细胞繁殖，选用ST、PK-15、SK6细胞任意一种，适应并繁殖病毒，用于病毒扩大培养及疫苗生产。
本发明涉及一种修饰的猪瘟病毒，它可以包含文本中公开的突变或删除的任何位置或全部位置。除能用做阴性标记外，这些毒株还显示优秀的免疫攻毒保护效果。
附图说明
图1猪瘟兔化弱毒表位突变毒株构建示意图
图2猪瘟兔化弱毒表位突变株及C株IPMA染色图
图3猪瘟兔化弱毒表位突变株及C株IFA染色图
本发明涉及微生物资源信息
猪瘟病毒(Hog cholera virus)猪瘟兔化弱毒株表位突变株(mHCLV),该毒株是通过以猪瘟病毒C株全长感染性克隆为基础，将其E2基因中的某一表位进行突变或缺失，经病毒拯救而获得的一株猪瘟兔化弱毒株的表位突变毒株，被命名为猪瘟病毒(Hog choleravirus)猪瘟兔化弱毒株表位突变株(mHCLV-ZJS，简称mHCLV),该毒株于2017年11月3日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.12377。猪瘟病毒(Hog cholera virus)猪瘟兔化弱毒株和石门系强毒株(CVCC保藏编号AV1412和AV1411)；细胞系：SK6株，CVCC保藏编号CL31，)、ST株(CL27，p160)、PK-15株(CL34,)细胞均来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2008年版，p139；163、160和p164)。
本发明的有益效果
本发明涉及猪瘟兔化弱毒株表位突变株及其应用。本发明构建的猪瘟兔化弱毒株表位突变株，不仅保持了猪瘟兔化弱毒株安全性好，免疫原性优良等特点，而且该毒株稳定性好，细胞生产病毒含量高，能用于工业化大生产，免疫猪体后产生的抗体可区分免疫和自然感染，在猪瘟净化过程中或暴发疫情时免疫，根据是否存在免疫抗体，有选择的屠杀感染田间毒的动物，可降低经济损失，有利于猪瘟的净化根除及紧急免疫，对防控净化猪瘟及紧急免疫都具有重大意义。
实施例
以下实施例为进一步说明本发明的技术方案，不对本发明构成限制。
实施例1
——构建猪瘟兔化弱毒表位突变株
以猪瘟病毒C株为模板，通过重叠PCR引入突变表位，并将PCR产物克隆至pGEM-Teasy载体中，转化并挑选阳性克隆，测序确定突变成功。以NgoMIV/BamHI双酶切连接至猪瘟病毒C株全长感染性克隆中，以PCR测序鉴定猪瘟兔化弱毒表位突变株构建成功。
2.病毒拯救
将猪瘟兔化弱毒表位突变株感染性克隆经酶切线性化处理，体外转录，电转染SK6细胞(或ST或PK-15细胞)。用单克隆抗体WH303和1C8经IPMA和IFA检测，病毒拯救成功，获得一株猪瘟兔化弱毒株的表位突变株，被命名为猪瘟病毒(Hog cholera virus)猪瘟兔化弱毒表位突变株(mHCLV-ZJS，简称mHCLV),该毒株于2017年11月3日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.12377。该株病毒不与WH303单克隆抗体反应，与1C8单克隆抗体反应。
本发明涉及一种修饰的猪瘟病毒，它可以包含本发明中公开的突变或删除的任何位置或全部位置。除能用做阴性标记外，这些毒株还显示优秀的免疫攻毒保护效果。
实施例2
——猪瘟活疫苗的制备
1.制苗用病毒抗原的制备
以下两种方法均可用猪瘟兔化弱毒表位突变株作为疫苗生产种毒用于猪瘟活疫苗疫苗抗原的制备：
(1)细胞制备病毒抗原：将猪瘟兔化弱毒表位突变株接种生长良好的SK6细胞(或/和ST、PK-15细胞)，每隔一段时间收获一次，以此方法连续传代20代。收获的病毒液冻存于-20℃以下。
(2)兔体繁殖病毒抗原：病毒培养上清接种日本大耳白兔，选取24小时以后出现定型热或轻热反应的家兔，待其体温下降后的24小时内剖杀，以无菌手术采取脾脏和淋巴结。称重、剪碎磨浆，加入冻干保护剂经冷冻干燥制成猪瘟活疫苗。可立即配苗或冻存于-20℃以下。保存期不得超过15日。
2.制苗抗原检验：
(1)无菌检验：按照《中国兽药典》附录3306进行检验，应无菌生长；
(2)支原体检验：按照《中国兽药典》附录3308进行，无支原体生长；
(3)毒含量测定：将收获的病毒耳静脉注射家兔，引起了典型的定型热，每毫升病毒含量为1～5×105家兔最小感染量(MID)。
(4)安全检验：选用经中和试验方法检测的无猪瘟中和抗体的健康易感断奶猪2头，各耳根后肌肉注射病毒液10mL。每日上下午各测体温观察一次，观察21日，体温、精神、食欲注射病毒液前后没有明显变化，体温升高不超过0.5℃，减食没有超过1日，猪只全部健活，表明猪瘟病毒兔化弱毒标记疫苗株是安全的。
3.配苗分装及冻干
将检验合格的病毒液混合，按比例加入冻干保护剂，充分混匀，定量分装，每头份含细胞毒液不少于0.015mL。脾淋苗每头份不少于0.01g。然后迅速进行冷冻真空干燥。
实施例3
——疫苗成品检验
按照现行《中国兽药典》中“猪瘟活疫苗(细胞源)或猪瘟活疫苗(兔源)”进行检验。
(1)性状：海绵状疏松团块，易与瓶壁分离，加稀释液后迅速溶解；
(2)无菌检验：按照附录3306进行检验，应无菌生长。如果有菌生长，应进行杂菌计数和病原性鉴定(附录3307)；
(3)支原体检验：按照附录3308进行，无支原体生长；
(4)鉴别检验：将疫苗用生理盐水稀释成每毫升含100个兔MID的病毒悬液，与等量抗猪瘟病毒特异性血清充分混合，置10～15℃中和60min，其间振摇2～3次。同时设病毒对照和生理盐水对照。中和结束后，分别耳静脉注射兔2只，每只0.1mL，按照《中国兽药典》“猪瘟活疫苗(兔源)”中效力检验项(1)进行观察和判定。除病毒对照组出现热反应外，其余2组在接种后120小时内应不出现热反应。
(5)安全检验：
1)小鼠和豚鼠检验：将疫苗用生理盐水稀释成5头份/mL，皮下注射体重18～22g小鼠5只，每只0.2mL，肌肉注射体重350～400g豚鼠2只，各1.0mL，观察10日，应全部健活。
2)用猪检验：选用无猪瘟中和抗体的健康断奶猪。接种前观察5～7日，每日上、下午各测温一次。挑选体温、精神、食欲正常的使用。将疫苗用生理盐水稀释成6头份/ml，肌肉注射猪4头，每头5.0mL，接种后，每日上、下午观察并测体温1次，观察21日，注苗后猪只体温、精神、食欲与接种前没有明显变化；或体温升高超过0.5℃，但不超过1℃，稽留不超过4个温次，或减食不超过1日。如果有一头猪的反应超过上述标准，但不超过1.5℃，稽留不超过2个温次，疫苗也可判为合格；如果有1头猪的反应超过上述标准；或出现可疑的其它体温反应和其他异常现象时，可用4头猪重检1次。重检的猪仍出现同样反应，疫苗应判为不合格。也可在猪高温期采血复归猪2头，每头肌肉注射可疑猪原血5.0ml，测温观察16日。如果均无反应，疫苗可判为合格。如果第一次检验结果已经确证疫苗不安全，则不应进行重检。
(6)效力检验：
用猪检验：将疫苗用生理盐水稀释成每1/150头份/ml,肌肉注射无猪瘟中和抗体的猪4头接种标记疫苗，每头1.0mL，接种10～14日，连同对照猪3头，均注射猪瘟病毒石门系血毒1.0mL(不低于105MLD)，观察16日，对照猪应全部发病且至少死亡2头，免疫猪应全部健活或稍有体温反应，但无猪瘟临床症状。结果表明疫苗保护效果很好。
序列表
<110> 中国兽医药品监察所
<120> 猪瘟兔化弱毒表位突变株及其应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3
<212> DNA
<213> 猪瘟兔化弱毒表位突变株人工序列(人工序列)
<400> 1
aac 3
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 猪瘟兔化弱毒表位突变株人工序列(人工序列)
<400> 2
agtttcggaa tggat 15
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> 猪瘟兔化弱毒表位突变株人工序列(人工序列)
<400> 3
ggaggaatgg at 12
<210> 4
<211> 6
<212> DNA
<213> 猪瘟兔化弱毒表位突变株人工序列(人工序列)
<400> 4
ggaagc 6
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 猪瘟兔化弱毒表位突变株人工序列(人工序列)
<400> 5
Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 猪瘟兔化弱毒表位突变株人工序列(人工序列)
<400> 6
Thr Ser Phe Gly Met Asp Thr
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 猪瘟兔化弱毒表位突变株人工序列(人工序列)
<400> 7
Thr Ala Gly Gly Met Asp Thr
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 猪瘟兔化弱毒表位突变株人工序列(人工序列)
<400> 8
Thr Ala Gly Ser Thr
1 5
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 猪瘟兔化弱毒表位突变株人工序列(人工序列)
<400> 9
caagtttcgg aatggatact ctgaggacag aagtg 35
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 猪瘟兔化弱毒表位突变株人工序列(人工序列)
<400> 10
atccattccg aaacttgtgc actctatgac acccg 35
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 猪瘟兔化弱毒表位突变株人工序列(人工序列)
<400> 11
cagcattcgg aatggatact ctgaggacag aagtg 35
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 猪瘟兔化弱毒表位突变株人工序列(人工序列)
<400> 12
atccattccg aatgctgtgc actctatgac acccg 35
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 猪瘟兔化弱毒表位突变株人工序列(人工序列)
<400> 13
cagcaggaag cactctgagg acagaagtg 29
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 猪瘟兔化弱毒表位突变株人工序列(人工序列)
<400> 14
gcttcctgct gtgcactcta tgacacccg 29
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 猪瘟兔化弱毒表位突变株人工序列(人工序列)
<400> 15
tagtaactgg ggcacaaggc cggctag 27
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 猪瘟兔化弱毒表位突变株人工序列(人工序列)
<400> 16
catctgatgc atgcaccttg acag 24

Claims (7)

1.一种猪瘟兔化弱毒株表位突变株，其特征在于该毒株是通过以猪瘟病毒C株全长感染性克隆为基础，将其E2基因中的某一表位进行突变，经病毒拯救而获得的一株猪瘟C株的表位突变毒株，被命名为猪瘟病毒猪瘟兔化弱毒表位突变株mHCLV-ZJS，简称mHCLV， 该毒株于2017年11月3日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.12377；
所述突变株病毒E2蛋白的氨基酸序列与C株相比第774位替换为Asn，第830位替换为Ser，第831位替换为Phe，第832位替换为Gly，第833位替换为Met，第834位替换为Asp。
2.如权利要求1所述一种猪瘟兔化弱毒株表位突变株，其特征在于该突变株病毒E2基因核苷酸序列与C株相比：第2694-2696位核苷酸替换为序列1，第2862-2876位核苷酸替换为序列2。
3.如权利要求1所述的猪瘟兔化弱毒株表位突变株，其特征在于该突变株病毒其E2蛋白中TAVSPTT表位氨基酸序列与C株相比替换为序列6。
4.如权利要求1所述的猪瘟兔化弱毒株表位突变株，其特征在于可通过反转录聚合酶链式反应、测序、过氧化物酶单层细胞试验和间接免疫荧光染色来区分猪瘟病毒C株表位突变株与猪瘟病毒C株及猪瘟病毒野毒株。
5.权利要求1所述的猪瘟兔化弱毒株表位突变株在制备猪瘟活疫苗中的应用，其特征在于该毒株可作为生产毒株制备猪瘟活疫苗。
6.如权利要求5所述的猪瘟兔化弱毒株表位突变株在制备猪瘟活疫苗中的应用，其特征在于该株病毒制备的疫苗免疫猪体后，可通过检测针对氨基酸序列5的血清学抗体来区分疫苗免疫与野毒感染动物，免疫猪不产生针对序列5的抗体，野毒感染猪可产生针对序列5的抗体。
7.根据权利要求5所述的猪瘟兔化弱毒株表位突变株在制备猪瘟活疫苗中的应用，其特征在于可通过酶联免疫吸附试验来区分免疫抗体与自然感染抗体。
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