CN110038124B - 猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位的疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兽药技术领域，具体而言，提供了一种猪瘟‑猪传染性胸膜肺炎二联亚单位的疫苗及其制备方法和应用。疫苗包括猪瘟病毒E2蛋白、血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII和血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml，以及疫苗佐剂。通过将蛋白与疫苗佐剂等体积混合乳化得到该疫苗。该疫苗可以同时预防猪瘟及由血清1型和7型猪胸膜肺炎放线杆菌引起的猪传染性胸膜肺炎，效果好，成本低。

Description

猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位的疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽药技术领域，具体而言，涉及一种猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位的疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性的猪瘟烈性传染病，每年给养猪业造成巨大经济损失。虽然目前的猪瘟兔化弱毒疫苗控制了猪瘟的大规模流行，但猪瘟仍呈散发流行。由于目前缺乏有效的疫苗免疫和流行毒株感染的鉴别诊断方法，研发和推广使用E2亚单位疫苗等标记疫苗对猪瘟的净化非常必要。

不同于传统弱毒苗，猪瘟E2疫苗的主要抗原为猪瘟病毒E2蛋白。E2蛋白是猪瘟病毒结构蛋白之一，该蛋白不仅在感染猪瘟时可以诱导大量的中和抗体产生，而且也被证实是猪瘟病毒中最为有效的免疫原。

猪瘟E2蛋白亚单位疫苗，是将E2蛋白基因重组到表达载体(昆虫杆状病毒系统、大肠杆菌、酵母或CHO系统等)中高效表达，产生大量保护性表位，然后将抗原提取后加入佐剂制成亚单位疫苗。但是这类疫苗由于其疫苗制造成本相对猪瘟活疫苗较高，单独用于免疫仔猪性价比较低。

猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumoniae，PCP)是由猪胸膜肺炎放线杆菌引起的猪的一种急性、热性、高度传染性的呼吸道疾病。该病可造成巨大的经济损失，各年龄阶段的猪只皆可被感染，但多发于育肥后期的猪只。感染猪只的肺脏呈出血性、坏死性、纤维素性胸膜肺炎，尤其是在季节变换或是气候有剧烈变化的时间，更易导致此呼吸道疾病的发生。由于本病的病程多属于亚急性到急性，造成猪只的大量死亡，而使猪场损失惨重。急性病例的主要临床症状包括：食欲减退、精神沉郁、发热、咳嗽、呼吸困难和/或呼吸急促，偶见呕吐。该疾病的发展进程非常快，可在几小时内造成死亡。在慢性病例中，疾病的临床症状不明显，但生产成绩会受到影响，屠宰时可发现胸腔粘连、胸膜炎、肺脏脓肿等病变。

该病发生具有季节性，每年多发生于4～5月和9～12月份。饲养环境突然发生改变、转群、混群、长途运输、饲养密度过大、通风不良、潮湿、气温多变等应激因素，均可促使本病的发生与流行，增加发病率与死亡率，造成更大的经济损失。

猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)具有15个血清型，且各血清型之间的交叉保护性不强。不同的国家和地区流行的猪胸膜肺炎放线杆菌的血清型不同，我国当前在猪群中流行的血清型主要为7型，其次是血清1、2、3、4、5和10型。

目前用于控制猪传染性胸膜肺炎的疫苗有灭活疫苗、亚单位疫苗、弱毒疫苗和自家苗。灭活疫苗的使用需考虑是否与当地流行血清型一致，若一致才能起到有效的免疫保护。弱毒疫苗的使用存在安全性和毒力返强的担忧。亚单位疫苗使用效果好，不用考虑当地流行血清型的问题，因而使用范围比灭活疫苗广，但由于工艺复杂和成本高而使应用受限。市售商品疫苗类型有全菌灭活疫苗和亚单位疫苗，目前国产疫苗均为全菌灭活疫苗。

猪瘟和猪传染性胸膜肺炎的单独免疫成本都较高，目前没有有效的措施可以同时对两种疾病免疫。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位的疫苗及其制备方法，以缓解现有技术中缺少一种可以同时预防猪瘟及由血清1型和7型猪胸膜肺炎放线杆菌引起的猪传染性胸膜肺炎的有效疫苗。

本发明的第二目的在于提供上述疫苗的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位的疫苗，包括猪瘟病毒E2蛋白、血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII和血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml，以及疫苗佐剂。

在一些优选地实施方式中，猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO.1)：

TMGGQIVQGVIWLLLVTGAQGRLACKEDYRYAISSTDEIGLLGAGGLTTTWKEYTHDLQLNDGTVKATCVAGSFKITALNAVSRRYLASLHKKALPTSVTFELLFDGTNPSTEEMGDDFGFGLCPFDTRPVVKGKYNATLVNGSAFYLVCPIGWTGVIECTAVSPTTLRTEVVKTFRRDKPFPHRMNCVTTTVENEDLFYCKLGGNWTCVKGEPVVYTGGLVKQCRWCGFDFNEPDGLPHYPIGKCILANETSYRVVDSTDCNRDGVVISTEGSHECLIGNTTVRVHASDERLGPMPCRPKEIVSSAGPAMKTSCTFNYAKTLKNRYYEPRDSYFQQYMLKGEYQYWFDLDATDHHSDYFAEFVVLVHHHHHH。

在一些优选地实施方式中，编码猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码猪瘟病毒E2蛋白的基因序列(SEQ IDNO.2)：

ACCATGGGAGGACAGATCGTGCAAGGTGTGATATGGCTGCTATTAGTAACTGGGGCGCAAGGCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGACTACAGGTACGCAATATCGTCAACCGATGAGATAGGGCTACTTGGGGCCGGAGGACTCACCACCACCTGGAAAGAATACACCCACGATCTGCAGCTGAATGACGGGACCGTTAAGGCCACTTGCGTGGCAGGTTCCTTTAAAATCACAGCACTTAATGCGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCATCACTGCATAAGAAGGCTTTACCCACTTCCGTGACATTCGAACTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAACTGAGGAAATGGGAGATGACTTCGGGTTCGGGCTGTGCCCGTTTGATACGAGACCCGTTGTCAAGGGAAAGTACAATGCGACCTTGGTGAACGGTAGTGCTTTCTATCTTGTCTGCCCAATAGGGTGGACGGGTGTTATAGAGTGCACAGCAGTGAGCCCAACAACCCTGAGAACAGAAGTGGTAAAGACCTTCAGGAGAGACAAGCCCTTTCCGCACAGAATGAATTGTGTGACCACCACAGTGGAAAATGAAGACTTATTCTACTGTAAGTTGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGCGAACCAGTGGTCTACACAGGGGGGTTAGTGAAACAATGTAGATGGTGTGGCTTCGACTTCAACGAGCCTGATGGGCTTCCGCACTACCCCATAGGTAAGTGCATTCTGGCAAACGAGACCAGTTACAGAGTAGTAGATTCAACGGACTGTAACAGAGATGGCGTTGTAATCAGCACAGAGGGGAGTCATGAGTGCTTGATTGGTAACACGACTGTCAGGGTGCATGCATCAGATGAAAGATTGGGCCCCATGCCATGCAGACCTAAAGAGATTGTCTCTAGTGCAGGACCTGCAATGAAAACCTCCTGTACATTCAATTACGCAAAAACTTTGAAGAACAGGTACTATGAGCCCAGGGACAGCTACTTCCAGCAATACATGCTTAAGGGTGAGTATCAGTACTGGTTTGACCTGGATGCGACTGACCACCACTCAGATTACTTCGCAGAATTTGTTGTCTTGGTGCATCACCATCACCATCAC。

本发明以Genebank上已发表的编码猪瘟病毒E2蛋白基因序列作参考，在C株(C株-猪瘟兔弱化毒疫苗)的E2基因基础上进行了修饰和密码子优化，5’端加入信号肽序列(VLRGQIVQGVIWLLLVTGAQG)，3’端连接了6个组氨酸构成的His标签，得到了编码猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列，经检测与C株的E2基因在核苷酸同源性达到93.2％。

在一些优选地实施方式中，编码血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

编码血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)：

CAGAATGTGAAAGGATTAGGAGGATTGAGTAATAAATTACAAAATCTACCAGATCTAGGAAAAGCAAGTTTAGGTTTGGACATTATCTCTGGTACTGATAGAGGAATTGTATTATTTGCACCTCAGCTAGATAATTTATTAAAGAAGAATCCTAAAATTGGCAATACATTAGGAAGTGCTTCTAGCATTATAGGTAATGTAACAAAAGCGGTCTCATCTTACATTCTTGCCCAACGAGTCGCTTCAGGTTTGTCTTCAACTGGTCCTGTCGCTGCATTAATCGCATCTACAGTTGCACTAGCTGTTAGCCCTCTTTCATTCTTAAATGTAGCTGATAAGTTTAAACAAGCTGATTTAATCAAATCATATTCTGAACGCTTCCAAAAATTAGGATATGATGGAGATCGTTTATTAGCTGATTTTCACCGTGAGACAGGAACTATTGATGCTTCTGTAACAACAATTAACACTGCTTTAGCAGCTATCTCCGGTGGAGTTGGAGCTGCAAGCGCGGGTTCTCTAGTCGGAGCTCCAGTTGCGTTACTCGTTGCTGGTGTTACGGGACTTATTACAACTATTCTAGAATATTCTAAACAAGCCATGTTTGAACATGTTGCAAATAAGGTTCATGACAGAATAGTTGAATGGGAGAAAAAACATAATAAAAACTATTTTGAGCAAGGTTATGATTCTCGTCATTTAGCTGATTTACAAGACAATATGAAGTTTCTTATCAATTTAAATAAAGAACTTCAGGCTGAACGCGTAGTAGCTATTACCCAACAAAGATGGGATAACCAAATTGGAGACCTAGCGGCAATTAGCCGTAGAACGGATAAAATTTCCAGTGGAAAAGCTTATGTGGATGCTTTTGAGGAGGGGCAACACCAGTCCTACGATTCATCCGTACAGCTAGATAACAAAAACGGTATTATTAATATTAGTAATACAAATAGAAAGACACAAAGTGTTTTATTCAGAACTCCATTACTAACTCCAGGTGAAGAGAATCGGGAACGTATTCAGGAAGGTAAAAATTCTTATATTACAAAATTACATATACAAAGAGTTGACAGTTGGACTGTAACAGATGGTGATGCTAGCTCAAGCGTAGATTTCACTAATGTAGTACAACGAATCGCTGTGAAATTTGATGATGCAGGTAACATTATAGAATCTAAAGATACTAAAATTATCGCAAATTTAGGTGCTGGTAACGATAATGTATTTGTTGGGTCAAGTACTACCGTTATTGATGGCGGGGACGGACATGATCGAGTTCACTACAGTAGAGGAGAATATGGCGCATTAGTTATTGATGCTACAGCCGAGACAGAAAAAGGCTCATATTCAGTAAAACGCTATGTCGGAGACAGTAAAGCATTACATGAAACAATTGCCACCCACCAAACAAATGTTGGTAATCGTGAAGAAAAAATTGAATATCGTCGTGAAGATGATCGTTTTCATACTGGTTATACTGTGACGGACTCACTCAAATCAGTTGAAGAGATCATTGGTTCACAATTTAATGATATTTTCAAAGGAAGCCAATTTGATGATGTGTTCCATGGTGGTAATGGTGTAGACACTATTGATGGTAACGATGGTGACGATCATTTATTTGGTGGCGCAGGCGATGATGTTATCGATGGAGGAAACGGTAACAATTTCCTTGTTGGAGGAACCGGTAATGATATTATCTCGGGAGGTAAAGATAATGATATTTATGTCCATAAAACAGGCGATGGAAATGATTCTATTACAGACTCTGGCGGACAAGATAAACTGGCATTTTCGGATGTAAATCTTAAAGACCTCACCTTTAAGAAAGTAGATTCTTCTCTCGAAATCATTAATCAAAAAGGAGAAAAAGTTCGTATTGGGAATTGGTTCTTAGAAGATGATTTGGCTAGCACAGTTGCTAACTATAAAGCTACGAATGACCGAAAAATTGAGGAAATTATTGGTAAAGGAGGAGAACGTATTACATCAGAACAAGTTGATAAACTGATTAAGGAGGGTAACAATCAAATCTCTGCAGAAGCATTATCCAAAGTTGTGAATGATTACAATACGAGTAAAGATAGACAGAACGTATCTAATAGCTTAGCAAAATTGATTTCTTCAGTCGGGAGCTTTACGTCTTCCTCAGACTTTAGGAATAATTTAGGAACATATGTTCCTTCATCAATAGATGTCTCGAATAATATTCAATTAGCTAGAGCCGCT。

在一些优选地实施方式中，编码血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

编码血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)：

ACACCTAAGGTTGATATGTCCGCACCAAAAGCGGAGCAGCCAAAAAAAGAGGAAGTTCCACAAGCGGATAATTCGAAAGCGGAAGAACCAAAAGAGATGGCTCCGCAAGTAGATAGCCCGAAAGCGGAAGAACCAAAAAATATGGCTCCACAAATGGGTAATCCAAAACTAAATGACCCACAAGTAATGGCTCCGAAAATGGATAATCCGCAAAAAGATGCCCCAAAAGGAGAAGAACTAAGTAAGGATAAAAGTAATGCGGAAATTCTTAAGGAATTAGGGGTTAAGGATATTAATTCAGGTATCATTAATAATGCTGATGTAGTTCTGAATTTAAAAATAGATGAAAAAGATCACATTACAGTCGTATTAGATAAGGATAAGATTAATCGTAATCATCTAAAAGTAACTAATACAATTTCTGCTCAAGACATTAAAACCTTAAAAGATTCTTCAGGCAAATTGTTGGGTTACTATGGATATATGCAGTTAAATCAAGTTCGACAAGATGAAAATTATAGCGATGAAAAAGTTAGTTTGAATGAATATTATTTATTATCAATGAACGATGCCGATAAAATACGTCCGACTAAATCTATATCATATAAGGGAGACATGTTTTATAGTTACAAAGATGTAGGAAATCAGAAATTAAAGGCTTCTGTAGAAGCTTCTTATGATGATGTAACAAAAAAAGTATCAATGAAAGTATTTGGTGAGAATAATGATTACTGGAAATTAGGTGAGTTTGGTAGAACTAATTTATTAGAAAATCAAGTGACTGGAGCAAAAGTTGGCGAAGATGGTACCATTATAAATGGAACTTTATATTCTAAAATAGATAATTTTCCTTTAAAACTAACTCCTGACGCAAACTTCTCTGGGGGTATTTTCGGTAAAAATGGCGAAGTATTAGCCGGAAGTGCTATTAGTGAAAAATGGCAAGGCGTAATCGGTGCTACGGCAACCACAAAAGAAGATAAA。

在一些优选地实施方式中，猪瘟病毒E2蛋白的制备方法包括：用昆虫杆状病毒表达系统将编码猪瘟病毒E2蛋白的基因序列重组于昆虫杆状病毒基因内，构建出猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒，将重组病毒接种于High five细胞，培养得到猪瘟病毒的E2蛋白，经BEI灭活后，得到猪瘟病毒E2蛋白。

在一些优选地实施方式中，血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII的制备方法包括：用大肠杆菌表达系统将编码血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII的基因序列重组于表达载体基因内，构建出血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII重组载体，将重组载体转化入大肠杆菌细胞，培养得到血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII。可以理解的是，该血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII具有生物活性。

在一些优选地实施方式中，血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml的制备方法包括：用大肠杆菌表达系统将编码血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml的基因序列重组于表达载体基因内，构建出血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml重组载体，将重组载体转化入大肠杆菌细胞，培养得到血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml。可以理解的是血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml具有生物活性。

在一些优选地实施方式中，疫苗佐剂包括ISA201VG、ISA563VG或ISA660VG。ISA201VG佐剂乳化形成水包油包水的双相剂型，抗原释放快，免疫持续期相对较短；ISA563VG或ISA660VG佐剂乳化形成油包水剂型，抗原缓释慢，但免疫持续期长。本发明提供的疫苗可以根据不同的使用需求选择疫苗佐剂。

在一些优选地实施方式中，疫苗佐剂的来源优选为法国SEPPIC公司。

在一些优选地实施方式中，猪瘟病毒E2蛋白、血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII和血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml的质量比为1：(1.5-2.5)：(1.5-2.5)，优选为1：(1.7-2.3)：(1.7-2.3)，进一步优选为1:2:2。

在一些优选地实施方式中，疫苗中蛋白与疫苗佐剂的体积比为1：(0.5-1.5)，优选为1:1，其中，蛋白包括猪瘟病毒E2蛋白、血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII和血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml。可以理解的是，上述的蛋白的体积指的是蛋白液整体的体积。

本发明提供一种上述疫苗的制备方法，具体包括：将猪瘟病毒E2蛋白、血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII和血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml，以及疫苗佐剂乳化制得疫苗。

在一些实时方式中，乳化的条件为：以5000-15000r/min乳化3-6min。乳化的转速典型但非限制性的为5000r/min、7000r/min、10000r/min、13000r/min或15000r/min；乳化的时间典型但非限制性的为3min、4min、5min或6min。

在一些实施方式中，乳化设备可以但不限为匀质机或剪切机。

在一些优选地实施方式中，用重组杆状病毒表达的猪瘟E2蛋白与重组大肠杆菌表达的具有生物活性的毒素蛋白(ApxII)、外膜蛋白(Oml)共3种重组蛋白按比例混合，添加特定佐剂混匀后，乳化制成新型二联亚单位疫苗。

在一些优选地实施方式中，疫苗的制备方法包括：将猪瘟病毒E2蛋白浓缩至100μg/ml；将猪胸膜肺炎放线杆菌ApxII和Oml的浓度分别调整为400μg/ml，将E2蛋白、ApxⅡ蛋白和Oml蛋白分别按50μg/头份、100μg/头份和100μg/头份的蛋白含量与疫苗佐剂(即三种抗原及佐剂体积比为2:1:1:4)，用均质机或剪切机以10000r/min乳化5分钟制成疫苗。

本发明最后提供上述疫苗在作为DIVA疫苗中的应用。

DIVA(Differentiation of field virus infected from vaccinated animals)疫苗可配套相应的鉴别诊断试剂盒区分野毒感染动物和疫苗免疫动物，从而通过免疫方式净化畜禽疾病，同时可有效促进畜产品的进出口贸易。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位的疫苗至少具有如下优点：

(1)该疫苗可以同时预防猪瘟和猪传染性胸膜肺炎两种疾病。猪瘟病毒E2蛋白和猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白之间不会产生交叉干扰，可同时预防猪瘟病毒和猪传染性胸膜肺炎的感染。

本发明提供的疫苗可为仔猪提供良好的免疫保护效力，有效抵抗猪瘟病毒石门系标准强毒株及猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型和7型的单独或混合感染。

(2)该疫苗临床使用灵活。根据猪场具体疫病情况，本发明的疫苗在35-70日龄免疫仔猪，同时为仔猪提供猪瘟、猪传染性胸膜肺炎双重保护。受猪瘟母源抗体干扰小，免疫空窗期短，抗体持续期长，育肥猪日增重高，能够有效缩短肥育周期，显著降低季节交替时育肥猪急性死亡率。

(3)该疫苗可以减少动物的免疫次数。一次免疫提高动物福利，降低了猪场人员的工作强度，更有利于猪场免疫效果的控制。

(4)该疫苗是由三种蛋白配制而成，可作为DIVA疫苗，区分猪瘟野毒感染与疫苗免疫，有利于猪瘟净化。

(5)该疫苗免疫母猪产仔的母源抗体持续期可达70-84日龄，育肥猪首免日龄定在70-84日龄，部分猪场可实现育肥猪免疫一针免受猪瘟、猪传染性胸膜肺炎攻击，保护至出栏上市的目标。

本发明提供的猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位的疫苗的制备方法，简单易操作，成本低，此外，由于该疫苗为亚单位疫苗，所以安全性良好，无毒株返强风险。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中E2基因的PCR扩增结果图，其中，1、阴性对照；2、PCR扩增产物；3、DNA marker；

图2为实施例2中猪瘟病毒E2重组杆状病毒构建方法流程图；

图3为实施例2中感染猪瘟病毒E2重组杆状病毒的Sf-9细胞免疫荧光结果图；

图4为实施例2中重组猪瘟病毒E2蛋白SDS-PAGE电泳检测结果图，其中，1-2为重组杆状病毒接种昆虫细胞收获的上清中表达的E2蛋白，3-4为离心后沉淀重悬液中E2蛋白；

图5为实施例2中重组猪瘟病毒E2蛋白western-blot检测结果图，其中，1-2为重组杆状病毒接种昆虫细胞收获的上清中表达的E2蛋白，3-4为离心后沉淀重悬液中E2蛋白；

图6为实施例3中重组猪瘟病毒E2蛋白SDS-PAGE电泳检测结果图，其中，1-5为重组杆状病毒接种昆虫细胞表达的E2蛋白，6-9为已知浓度的梯度稀释的牛血清白蛋白(BSA)；

图7为实施例3中重组猪瘟病毒E2蛋白western-blot检测结果图，其中，1-5为重组杆状病毒接种昆虫细胞表达的E2蛋白；

图8为实施例5中apxⅡ基因PCR扩增结果，其中，1-2为apxⅡ基因，M为maker；

图9为实施例5中omlA基因PCR扩增结果，其中，1-2为omlA基因，M为maker；

图10为实施例6中apxⅡ基因重组蛋白SDS-PAGE结果，其中，M为maker，1为诱导菌液，2为诱导菌液破碎后的上清，3为诱导菌液破碎后的沉淀；

图11为实施例6中apxⅡ基因重组蛋白Western Blot结果，其中，M为maker，1为apxⅡ基因重组蛋白；

图12为实施例6中omlA基因重组蛋白SDS-PAGE结果，其中，M为maker，1为诱导菌液，2为诱导菌液破碎后的上清，3为诱导菌液破碎后的沉淀；

图13为实施例6中omlA基因重组蛋白Western Blot结果，其中，M为maker，1为omlA基因重组蛋白。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。

本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。

本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。

本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“6～22”表示本文中已经全部列出了“6～22”之间的全部实数，“6～22”只是这些数值组合的缩略表示。

本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。

本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以不按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明实施例中涉及的试验用主要试剂及生产厂家信息见表1。

表1试验用主要试剂及生产厂家信息

实施例1猪瘟病毒E2基因的合成、PCR扩增及鉴定

从GenBank下载了已发表的猪瘟病毒E2序列和近年来流行的新毒株的E2序列作参考，在C株E2基因基础上进行了密码子优化和修饰，5’端加入信号肽序列(VLRGQIVQGVIWLLLVTGAQG，SEQ ID NO.11)，3’端连接了6个组氨酸构成的His标签，将修饰后的序列交与基因合成公司合成；获得该合成的E2基因通过PCR扩增后，对扩增产物E2基因进行序列测定，将测得的E2基因与C株的E2基因和各亚群的参考株进行比对，结果显示最终获得的E2基因与C株的E2基因在核苷酸同源性达到93.2％，作为构建猪瘟病毒E2重组杆状病毒的目的基因。

1)PCR扩增引物：

E2-F1:5’-ACCATGGGAGGACAGATCGT-3’(SEQ ID NO.5)；

E2-R1:5’-GTGATGGTGATGATGCACCAA-3’(SEQ ID NO.6)。

将合成的E2基因DNA稀释成10ppm/μl后，取2μl作为模板，用以上引物及PCR反应混合液进行PCR反应，扩增出1119bp左右的基因片段，与目的基因片段大小一致，结果详见图1。

2)将PCR产物经琼脂糖电泳、切胶回收纯化后送交测序公司测序，测序结果与合成基因序列一致。

实施例2猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒的构建及鉴定

猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒的构建方法如流程图图2所示。以合成的猪瘟病毒E2基因为模板，用高保真的Pfu DNA聚合酶进行PCR反应，扩增出猪瘟病毒E2基因，经测序验证正确后，参考Invitrogen操作手册进行重组病毒的构建，经E2基因扩增和鉴定、转移载体的构建、转移载体的筛选和鉴定、转移载体与线性杆状病毒的转染、重组病毒的筛选、重组病毒的鉴定和E2蛋白的表达，最终获得一株毒价稳定、E2蛋白分泌量高的重组杆状病毒，命名为CSFV-Rb-E2。

1)E2基因的扩增

本实验利用引物在PCR产物的5’端引入了

cloning site(CACC)及包含ATG的Kozak转录起始序列(ACC ATG G)。将合成基因用以上PCR引物进行扩增后，经琼脂糖凝胶进行电泳分析，产物大小相符则进一步用QIAguickTM PCR纯化试剂盒回收E2基因PCR产物。纯化产物用琼脂凝胶电泳进行回收确认后，利用分光光度计在波长260nm测定其OD值，换算回收DNA浓度，－20℃以下冰箱保存备用。

2)杆状病毒转移载体的构建

1、

克隆反应参考Invitrogen操作手册，用0.5-4μl已纯化的blunt-endPCR产物(含5-10ng DNA)加入

clone反应液，混匀后置室温(22-23℃)感作15分钟，将反应管置冰上备用。

2、质粒的转化取2μl

cloning反应液加至One

TOP10 ChemicallyCompetent E.coli(Invitrogen)作用管中，混合均匀置冰上感作30分钟，再置42℃水浴槽30秒进行热休克作用，之后立刻将反应管放回冰上冰浴，然后于反应管中加入已回温的250μl SOC培养液，放入37℃恒温振荡培养箱中以转速200r/min振荡培养60分钟。取50μl菌液均匀涂抹于LB-kana培养板(含50μg/ml kanamycin)，剩余菌液则全部取出并均匀涂抹于另一LB-kana培养板上，置37℃培养箱中培养过夜。

3、猪瘟病毒E2重组转移载体的筛选通过PCR方法，进行猪瘟病毒E2重组转移载体的初步筛选。无菌挑取单克隆，一分为二，其一用于另一LB-kana培养液上划线，并将培养液置37℃培养箱中培养6小时，另一作为PCR反应模板，用前述引物进行PCR扩增。若出现预期产物，则选取相应的菌落接种至3ml LB-kana中，于37℃恒温振荡培养箱中，以转速200r/min振荡培养过夜。

用QIAprepTM Spin Plasmid Kit进行重组载体的提取，经限制内切酶NotI切割后，以1％琼脂糖凝胶进行电泳分析。若与预期产物大小相符，则选取其中2个已提取的重组载体，以

vector本身的引物(M13F/M13R)，进行测序验证。

3)LR重组反应

重组转移载体经测序验证正确后，将提取的重组载体，用分光度计于波长260nm处测重组载体的核酸浓度，再参考《BaculoDirectTM Baculovirμs Expression System》，用重组转移载体、合成基因DNA、反应酶及缓冲液于25℃感作18小时进行LR重组反应，反应结束后，加入2μl Proteinase K solution，置37℃作用10分钟，中断LR重组反应。

4)转染

取6孔细胞培养板，每孔接种1.5×10⁶个活性良好(细胞存活率大于95％)的Sf-9细胞，重复2孔，将细胞置26-28℃培养1小时，使细胞完全附着于培养板底部。取20μl LR重组反应液(含已重组的杆状病毒DNA)、12μl

reagent与400μl SF900II无血清昆虫细胞培养液温和混匀，置室温感作45分钟。将转染混合液缓慢加入沥干培养基的贴壁昆虫细胞上，补加800μl无血清昆虫细胞培养液，将细胞培养板密封，26～28℃培养5小时。抽掉混合液，于每孔中加入3ml含有抗生素与100μM ganciclovir的Sf-900ⅡSFM，最后以透明胶带密封，置26-28℃恒温培养箱中培养5日。未重组成功的杆状病毒基因体，具有单纯疱疹病毒的thymidine kinase基因，在添加ganciclovir的培养液中，无法进行DNA的复制，所以可有效降低未重组杆状病毒的增殖，提高重组杆状病毒筛选效率。

5)猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒的收获与鉴定

将病毒液收集至50ml离心管中，以转速3000r/min离心5分钟去除细胞碎片，于病毒液中加入10％胎牛血清，以减少可能存在的蛋白酶对病毒的破坏，之后将病毒液避光保存4℃以下备用，或-70℃以下长期保存。用于转染后初代分离时，以0.45μm的滤膜过滤，再分装于1.5ml离心管中。提取感染4日的Sf-9昆虫细胞上清中的DNA，用前述引物进行PCR鉴定。

6)猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒筛选、传代

用病毒蚀斑克隆技术对重组杆状病毒进行筛选，选择感染细胞能力强的蚀斑进行扩增、传代，采用间接免疫荧光技术测定重组病毒毒价。经连续筛选、传代后获得了毒价可稳定至10^7-8TCID₅₀/ml的猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒，命名为CSFV-Rb-E2。

经过SDS-PAGE及Western-blot分析，证实猪瘟病毒E2重组杆状病毒接种Sf-9细胞后，重组E2蛋白主要分泌于上清中，细胞中仅含微量的E2蛋白，大小为52kDa。间接免疫荧光结果显示，重组E2蛋白能被猪瘟阳性血清所识别，具有良好的反应原性，结果详见图3-5。

实施例3猪瘟病毒E2蛋白的表达条件优化及收获

用3×3正交试验设计，对接毒剂量、接毒时细胞密度、收获时间三因素进行比较分析，其中设0.1、0.5、1MOI三个水平接毒剂量，100万、200万、300万/ml三个水平的细胞密度，收毒时间为72、96、120小时三个条件，用双抗夹心elisa法检测以上实验收获上清中的E2蛋白含量。最终确定Sf-9细胞密度200万/ml时以1MOI接毒，表达的重组E2蛋白含量最高，用免疫印迹法(Western-blot)验证该蛋白免疫原性好，用SDS-PAGE蛋白电泳及凝胶成像系统自带谱带分析软件定量其表达量为40-70微克/ml。

猪瘟病毒E2重组蛋白制备方法：取摇瓶培养的Sf-9细胞计数，当细胞活率不低于95％，密度不低于200万/ml时可进行接毒表达。以1个MOI剂量进行接毒，根据摇瓶中细胞量，计算所需CSFV-rB-E2重组病毒液体积，置25℃恒温培养箱中静置感作5分钟，之后用无血清昆虫细胞培养基将细胞密度调整至200万/ml，25℃恒温振荡培养箱中以180r/min转速振荡培养96小时。表达结束后取出细胞摇瓶，将细胞液摇匀后倒入离心瓶中，以转速3000r/min离心20分钟，收取上清液即为猪瘟病毒E2蛋白液，取10ml进行蛋白的定性分析和定量，详见图6-7。其余收获的猪瘟病毒E2蛋白抗原进行灭活。

实施例4猪瘟病毒E2重组杆状病毒液灭活、阻断及保存

用0.2mol的NaOH溶液溶解到1L的注射用水中，再加入0.1mol的2-bromoethylaehydrobromide(BEA，Sigma ALDRICH，B65705)，置37℃水浴中反应1小时，即制得0.1mol/L的BEI灭活剂溶液。将0.1mol/L的BEI溶液加入猪瘟病毒E2重组杆状病毒液，终浓度为1mmol/L，置37℃中灭活48小时，每隔2小时均匀搅拌10分钟。灭活完毕后加入1mol/L的硫代硫酸钠，终浓度为10mmol/L，37℃反应1小时。阻断后的抗原可在4℃短暂保存30日以内，长期保存需冻存至－20℃以下。

实施例5猪传染性胸膜肺炎毒素蛋白ApxII和外膜蛋白Oml的扩增、构建

利用大肠杆菌系统表达猪传染性胸膜肺炎免疫原性蛋白ApxII和Oml,表达量为80-100μg/ml，通过免疫原性验证，其具有良好的反应原性。可作为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的候选蛋白。

1)猪传染性胸膜肺炎毒素蛋白ApxII和外膜蛋白Oml基因的扩增

1、引物设计与合成：根据Genebank发表的血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡ基因序列和血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白omlA基因序列，设计合成2对引物。序列如表2所示。

表2引物信息

2、PCR扩增：通过PCR扩增，获得目的片段，与预期大小一致的约2232bp的apxⅡ基因目的片段，和与预期大小一致的约984bp的omlA基因目的片段。结果如图8和图9。

3、血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ基因重组克隆质粒送交测序公司测序，结果显示：由血清7型扩增所得的apxⅡ基因片段与Genebank中同血清型的同源性为100％，与其它血清型的同源性为99.9％-100％；氨基酸序列与Genebank中同血清型的同源性为100％。

4、血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌omlA基因重组克隆质粒送交测序公司测序，由APP1型扩增所得的omlA基因片段与Genebank中同血清型的同源性为99.9％；氨基酸序列与Genebank中同血清型的同源性为100％。

实施例6猪传染性胸膜肺炎毒素蛋白ApxII和外膜蛋白Oml的表达鉴定

1)apxⅡ基因重组蛋白鉴定

经SDS-PAGE凝胶电泳检测(结果如图10所示)，apxⅡ基因重组蛋白大小约101.6kDa，蛋白含量为95.1μg/ml，占总蛋白的18.9％，以包涵体的形式存在，Western Blot结果显示(结果如图11所示)，apxⅡ基因重组蛋白能被7型猪胸膜肺炎放线杆菌阳性血清所识别，具有良好的反应原性。

2)omlA基因重组蛋白鉴定

经SDS-PAGE凝胶电泳检测(结果如图12所示)，omlA基因重组蛋白大小约42kDa，蛋白含量为85.4μg/ml，占总蛋白的20.2％，以可溶性蛋白的形式存在，Western Blot结果显示(结果如图13所示)，omlA基因重组蛋白能被1型猪胸膜肺炎放线杆菌阳性血清所识别，具有良好的反应原性。

实施例7猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位疫苗的制备

1、抗原制备

将收获的猪瘟E2抗原浓缩至100μg/ml；将收获的猪传染性胸膜肺炎ApxII和Oml抗原调整为400μg/ml。

2、疫苗制备

将E2蛋白、ApxⅡ蛋白和Oml蛋白分别按50μg/头份、100μg/头份和100μg/头份的蛋白含量与法国SEPPIC的ISA563VG佐剂等体积混合(即三种抗原及佐剂体积比为2:1:1:4)，用均质机以10000r/min乳化5分钟制成疫苗。

实施例8猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位疫苗的安全性

将疫苗颈部肌肉注射4-5周龄非免疫猪瘟抗体阴性猪，4ml/头，另设5头为对照组，免疫后连续观察14日。结果，试验猪接种疫苗后，注射部位未见红肿，食欲和精神状况良好，未见任何不良反应，全部健活。

实施例9猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位疫苗的有效性试验

1、动物分组及免疫

按表3所示，将试验动物随机分组，打耳标进行标识。将受试疫苗颈部肌肉注射试验猪，2ml/头，一免后21日，以相同途径和相同剂量进行二免。对照组不注射任何疫苗。

表3试验组分组情况

注：“/”表示无此项操作。

2、猪瘟抗体测定及攻毒

二免后14日，逐头采集猪只血液无菌分离血清，参考中国兽药典测定猪瘟中和抗体，结果表明免疫组猪瘟中和抗体均不低于1:512，对照组均小于1:4，详见表4；取猪瘟石门系强毒及APP1、APP7型菌株，按照表4进行攻毒，攻毒后连续观察16日。

表4试验猪猪瘟中和抗体及攻毒情况

攻毒结果表明，空白对照组全部健活。

试验猪用猪瘟石门系强毒攻击后，攻毒对照组猪只体温全部升高至41℃以上，食欲不振，精神萎靡，伴有畏寒怕冷、结膜炎、便秘或腹泻、站立表现出弓背等典型猪瘟临床症状，在观察期内全部死亡，剖检可见扁桃体溃疡、淋巴结肿大、出血，脾边缘梗死，肾脏及膀胱有针尖状出血等典型猪瘟病理变化；免疫组猪只体温正常，未发生异常临床症状及死亡。

猪传染性胸膜肺炎APP1型强毒株攻毒后，攻毒对照组猪只均出现体温升高、食欲减退、精神沉郁和呼吸困难等临床症状，7日内死亡2头，剖检可在肺部观察到出血水肿、肺脏表面可见纤维素性渗出或与胸膜粘连等病变，攻毒对照组全部发病；免疫组全部存活，未观察到异常临床症状，剖检，1头试验猪可见极轻微的小结节，其余猪只无异常。

猪传染性胸膜肺炎APP7型毒株攻毒后，对照组猪只均出现体温升高、食欲减退、精神沉郁和呼吸困难等临床症状，7日内死亡1头，剖检可在肺部观察到出血水肿、肺脏表面可见纤维素性渗出或与胸膜粘连等病变；免疫组全部存活，未观察到异常临床症状，剖检无异常。详见表5。

表5攻毒保护效果统计

由上述试验结果可以看出，本发明提供的猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位疫苗免疫猪后可为其提供良好的免疫保护效力，猪瘟E2和猪胸膜肺炎放线杆菌蛋白之间无干扰，可有效抵抗猪瘟病毒石门系标准强毒株及猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型和7型单独和混合感染，达到同时预防猪瘟病毒和猪传染性胸膜肺炎的感染的目的，有效降低仔猪免疫成本及免疫负担。

实施例10猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位疫苗的临床应用

1、生产母猪免疫

采用跟胎免疫或全群普免3-4次/年免疫母猪，免后60日左右猪瘟中和抗体达峰值(1:4096左右)，免疫持续期不低于200日。

2、育肥猪免疫

使用该疫苗母猪产仔的母源抗体可持续至70-84日，临床应用中可在70-84日进行疫苗首免，30日后采血测定猪瘟抗体水平，若阳性率低于85％，可加强免疫一次；若阳性率不低于85％，可不进行免疫。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 天康生物股份有限公司

<120> 猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位的疫苗及其制备方法和应用

<130> 2019

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 373

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Thr Met Gly Gly Gln Ile Val Gln Gly Val Ile Trp Leu Leu Leu Val

1               5                   10                  15

Thr Gly Ala Gln Gly Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala

            20                  25                  30

Ile Ser Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr

        35                  40                  45

Thr Thr Trp Lys Glu Tyr Thr His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr

    50                  55                  60

Val Lys Ala Thr Cys Val Ala Gly Ser Phe Lys Ile Thr Ala Leu Asn

65                  70                  75                  80

Ala Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Lys Ala Leu Pro

                85                  90                  95

Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr

            100                 105                 110

Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr

        115                 120                 125

Arg Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Ala Thr Leu Val Asn Gly Ser

    130                 135                 140

Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys

145                 150                 155                 160

Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe

                165                 170                 175

Arg Arg Asp Lys Pro Phe Pro His Arg Met Asn Cys Val Thr Thr Thr

            180                 185                 190

Val Glu Asn Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr

        195                 200                 205

Cys Val Lys Gly Glu Pro Val Val Tyr Thr Gly Gly Leu Val Lys Gln

    210                 215                 220

Cys Arg Trp Cys Gly Phe Asp Phe Asn Glu Pro Asp Gly Leu Pro His

225                 230                 235                 240

Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Ser Tyr Arg Val

                245                 250                 255

Val Asp Ser Thr Asp Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu

            260                 265                 270

Gly Ser His Glu Cys Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Arg Val His Ala

        275                 280                 285

Ser Asp Glu Arg Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val

    290                 295                 300

Ser Ser Ala Gly Pro Ala Met Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Ala

305                 310                 315                 320

Lys Thr Leu Lys Asn Arg Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln

                325                 330                 335

Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Ala

            340                 345                 350

Thr Asp His His Ser Asp Tyr Phe Ala Glu Phe Val Val Leu Val His

        355                 360                 365

His His His His His

    370

<210> 2

<211> 1119

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 2232

<212> DNA

<213> 血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌

<400> 3

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<212> DNA

<213> 血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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<213> 人工序列

<400> 11

Val Leu Arg Gly Gln Ile Val Gln Gly Val Ile Trp Leu Leu Leu Val

1               5                   10                  15

Thr Gly Ala Gln Gly

            20

Claims (7)

1.一种猪瘟-猪传染性胸膜肺炎二联亚单位的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括猪瘟病毒E2蛋白、血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII和血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml，以及疫苗佐剂；

所述猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

编码所述血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

编码所述血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述猪瘟病毒E2蛋白、所述血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII和所述血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml的质量比为1:2:2；

所述疫苗佐剂为ISA563VG，所述疫苗中蛋白与疫苗佐剂的体积比为1：1；所述蛋白为所述猪瘟病毒E2蛋白、所述血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII和所述血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，编码所述猪瘟病毒E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述猪瘟病毒E2蛋白的制备方法包括：用昆虫杆状病毒表达系统将编码猪瘟病毒E2蛋白的基因序列重组于昆虫杆状病毒基因内，构建出猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒，将重组病毒接种于High five细胞，培养得到猪瘟病毒的E2蛋白，经灭活后，得到所述猪瘟病毒E2蛋白。

4.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII或所述血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml的制备方法包括：用大肠杆菌表达系统将编码血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII的基因序列或血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml的基因序列重组于表达载体基因内，构建出血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII重组载体或血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml重组载体，将重组载体转化入大肠杆菌细胞，培养得到所述血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII或所述血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml。

5.权利要求1-4任一项所述的疫苗的制备方法，其特征在于，将所述猪瘟病毒E2蛋白、所述血清7型猪胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白ApxII和所述血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Oml，以及所述疫苗佐剂乳化制得疫苗。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，乳化的条件包括：以5000-15000r/min乳化3-6min。

7.权利要求1-4任一项所述的疫苗在制备DIVA疫苗中的应用。

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