CN107338227B - 牛副流感病毒pbiv3-b株及其应用 - Google Patents
牛副流感病毒pbiv3-b株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了牛副流感病毒PBIV3‑B株及应用,本发明的牛副流感病毒PBIV3‑B株具有免疫原性好、培养特性好等优点,将本发明的牛副流感病毒(PBIV3‑B株)接种MDBK细胞,收获培养物,用β‑丙内酯(β‑propiolactone)灭活后,与法国赛比克公司的商品化MontanideTM ISA15AVG佐剂混合乳化制成牛副流感病毒灭活疫苗。实验证明,使用本发明制备得到的牛副流感病毒灭活疫苗免疫断奶健康阴性牛能够预防由牛副流感病毒3型引起的疾病,而且此疫苗具有安全、产生抗体快、免疫期持久等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物领域,更具体的,属于生物疫苗领域,涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒及其应用,特别涉及一株自行分离得到的牛副流感病毒PBIV3-B株以及由该病毒株制备得到的灭活疫苗。
背景技术
牛副流感是由牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus 3,PBIV3)所引起的一种急性、接触性传染病,又称“运输热”。PBIV3属于副黏病毒科、副黏病毒属,是单股负链有囊膜的RNA病毒,主要引起牛和其他反刍动物急性呼吸道疾病。1959年,Reisinger等从美国的犊牛肾脏中首次分离到PBIV3。之后,法国、前苏联、日本、丹麦、加拿大、澳大利亚、巴拿马和意大利等国也相继分离出该病毒。1966年,在埃及出现了关于PBIV3的早期报道。Gulliksen等对挪威的PBIV3进行血清学调查发现,PBIV3的血清阳性率较高,达到50.2%。目前,PBIV3的感染已呈世界性分布。从我国的血清学调查结果可知,PBIV3在我国感染严重、分布广泛,多数省市均存在PBIV3的感染,省区的平均阳性率高达91.08%。经流行病学调查和病原学检测显示,PBIV3在牛呼吸道疾病综合征中起重要的作用。
PBIV3的预防主要以疫苗为主。早期的PBIV3疫苗以灭活苗及弱毒苗为主且多为对抗牛多种呼吸系统病原的联合疫苗。研究表明,PBIV3疫苗免疫1年后仍可在血清中检测到中和保护抗体且具有免疫记忆。目前,国内还没有商品化的牛副流感病毒疫苗及检测试剂。
本发明的发明人在2015年从山东某牛场分离到一株牛副流感病毒3型,经实验室鉴定为强毒株,驯化克隆后的毒株命名为PBIV3-B株。利用PBIV3-B株,开展了牛副流感病毒灭活疫苗的研制开发工作,筛选培育出免疫原性良好、效价稳定的牛副流感病毒PBIV3-B株,选择了最适合该病毒增殖的MDBK细胞和符合制造疫苗的灭活剂、佐剂及其他条件。对制品的生产工艺、安全性、保护率、免疫程序、最小剂量、抗体持续期和保存期等都进行了试验测定,并获得了大量的试验数据,证明本疫苗安全有效。在此基础上,进行了中试生产,经抽样检验,全部符合拟定的质量标准,并对中试产品进行了安全试验和效力试验,其结果也证实本疫苗能有效地预防由牛副流感病毒引起的牛呼吸道疾病,在实验室试验、中间试制的基础上,本发明研制出了牛副流感病毒PBIV3-B株灭活疫苗,其结果也证实本疫苗能有效地预防由牛副流感病毒引起的牛呼吸道疾病,进一步验证了本疫苗的各项质量标准。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种免疫原性良好、效价稳定的牛副流感病毒株;
本发明的目的之二是提供所述的牛副流感病毒株在制备疫苗中的应用;
本发明的目的之三是提供一种由所述的牛副流感病毒株制备得到的疫苗;
本发明的目的之四是提供所述的疫苗在制备预防牛副流感病毒病药物中应用。
为了达到上述目的,本发明采用了以下技术手段:
本发明的发明人在2015年从山东某牛场分离到一株牛副流感病毒3型,经实验室鉴定为强毒株,驯化后的毒株命名为PBIV3-B株。本发明的PBIV3-B株是从发生典型牛副流感病毒3型感染牛中分离获得的,因此与分离到的其它毒株相比在细胞上的增殖滴度高,对牛的免疫原性好。经MDBK细胞传代后作为疫苗毒种,效检用强毒为PBIV3-B株第7~10代。该毒株可以引起MDBK细胞90%以上感染。
本发明的一种牛副流感病毒,为在MDBK细胞上传代后的第7代病毒株,命名为牛副流感病毒PBIV3-B株,分类命名为牛副流感病毒,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所,其菌种保藏编号为:CGMCC No.14293,保藏日期为2017年06月15日。
本发明还提供了所述的牛副流感病毒在制备牛副流感病毒灭活疫苗中的应用。
本发明的一种牛副流感病毒灭活疫苗,其特征在于含有灭活后的本发明所述的牛副流感病毒PBIV3-B株。
在本发明所述的牛副流感病毒灭活疫苗中,优选的,所述的牛副流感病毒PBIV3-B株采用以下方法进行灭活:0.2%的β-丙内酯在4℃条件下灭活24小时,然后室温继续灭活24小时。
在本发明中,优选的,所述的其特征在于含有灭活后的本发明所述的牛副流感病毒灭活疫苗是由15%(v/v)的法国赛比克公司的商品化MontanideTM ISA15AVG佐剂和85%(v/v)的用β-丙内酯灭活的牛副流感病毒PBIV3-B株乳化后得到。
在本发明中,乳化工艺是采用法国赛比克公司的商品化MontanideTM ISA15AVG佐剂,除菌后可直接用于疫苗乳化制备;乳化前将灭活的同批病毒液解冻混合,在无菌室内用匀浆机以200r/min搅拌均匀,然后按照水相抗原与油相佐剂8.5∶1.5的体积配比;乳化程序为先将水相放入乳化器中进行搅拌,然后缓缓加入油相佐剂,以800r/min连续搅拌30分钟;生产得到的疫苗属水包油剂型,为了稳定界面和消除气泡,获得最佳乳化效果,需要静止30分钟后分装。
进一步的,本发明还提供了所述的灭活疫苗在制备预防由其特征在于含有灭活后的本发明所述的牛副流感病毒引起的疾病的生物制品中的用途。
特别地,所述的疾病为健康牛发生的呼吸系统疾病。
附图说明
图1为牛副流感病毒PBIV3-B株负染电镜图像
图2为牛副流感病毒PBIV3-B株在MDBK细胞上培养72小时的荧光检测结果;
图3为牛副流感病毒PBIV3-B株感染MDBK细胞后的一步生长曲线。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明,应该理解的是,这些实施例仅用于例证的目的,决不限制本发明的保护范围。
实施例1牛副流感病毒PBIV3-B株的分离及培养鉴定
1毒种来源及标准
根据新生物制品申报要求,结合本发明获得的大量的试验数据,参照《中国兽药典》(2005年版),对制苗用毒种进行了鉴定,现将试行规程(草案)中毒种标准进行以下说明。
1.1毒种来源
制造本品用的毒种为牛副流感病毒PBIV3-B株,是本发明人在2015年从发病牛自行分离驯化后获得,由于这一毒株是从发生典型牛副流感病毒3型感染牛中分离获得的,并且与分离到的其它毒株相比在细胞上的增殖滴度高,对牛的免疫原性好,所以选择其用于疫苗的生产。经MDBK细胞传代后作为疫苗毒种,效检用强毒为PBIV3-B株第7~10代。该毒种为在MDBK细胞上传代后的第7代病毒株,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院院微生物研究所,其菌种保藏编号为:CGMCC No.14293,保藏日期为2017年06月15日。
1.2毒种(CGMCC No.14293)标准
1.2.1电镜形态
PBIV3-B株具有囊膜,表面有纤突,病毒粒子直径150-250nm,呈多形性,多为球形(见图1)。
1.2.2病毒的特性
PBIV3-B株是有囊膜的RNA病毒,对乙醚、氯仿极其敏感,不耐热,对酸的抵抗力较弱。以200个TCID50的病毒液与倍比稀释的PBIV3标准阳性血清反应,按Reed-Muench法测得标准阳性血清的中和效价为1∶64。PBIV3-B株血凝素效价为1∶256
1.2.3病毒含量
以DMEM培养液将毒种作连续10倍系列稀释,每个稀释度取100μl加入96孔细胞培养板中,每个稀释度作8个重复,随后加入MDBK细胞,每孔100μl(细胞含量以3×105/ml),并设正常细胞培养对照,置37℃、含5%的CO2培养箱中培养,逐日观察细胞病变(CPE),细胞圆缩,聚集成葡萄串样群落,在单层细胞上形成空洞则判为CPE。观察7日,记录细胞病变的孔数,按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。结果:每毫升病毒液不低于1010.0TCID50。
1.2.4毒力
病毒代次为牛副流感病毒PBIV3-B株第7~10代细胞毒;攻毒剂量为每毫升病毒含量应不低于107.0TCID50;程序是健康阴性豚鼠10只和犊牛4头,分别鼻内喷雾接种PBIV3-B株第7~10代细胞毒0.3ml、4ml;判定标准是接毒后豚鼠表现精神沉郁,有部分打喷嚏、流鼻液,可引起体温升高、体重下降。肺剖检表现为暗红、不规则的实变等。犊牛感染PBIV3-B株两天后出现发热迹象,第4或第5天体温达到最高40.9~41.4℃,且可持续7到10天。咳嗽是最先表现出来的临床症状,主要体现为急促的干咳,声音较大。咳嗽的同时伴有发热症状。解剖后肺部可见肉样实变。病理变化表现为肺泡壁毛细血管扩张淤血;气管粘膜层消失;淋巴小结内淋巴细胞有轻微减少,部分淋巴细胞出现凋亡;肝脏、脾脏、肾脏、心脏无明显病理变化。在鼻液及肺脏、气管和眼周部位组织可分离到病毒。
1.2.5免疫原性
将毒种同步接种MDBK细胞进行增殖,收获病毒液,用β-丙内酯灭活后,加MontanideTMISA15 AVG佐剂混合乳化制成水包油型灭活疫苗,用健康易感断奶犊牛(PBIV3中和抗体效价不高于1∶2)5头,肌肉注射按本规程制苗2ml,设未免对照牛5头,鼻内喷雾接种IBRV-B株各4ml(107.0TCID50),攻毒后14日剖杀所有牛。对照组应至少4头出现牛传染性鼻气管炎感染的典型临床症状,免疫组应至少4头保护。
1.2.6纯净检验
对建立的牛副流感病毒PBIV3-B株的原始种子批第10~11代、基础种子批第12~21代和生产种子批第22~25代进行了细菌、霉菌、支原体检验,并对第11、12和24代次毒种进行了外源病毒的检验,结果表明,本发明建立的原始种子批、基础种子批、生产种子批均无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染,均纯净。
1.2.7特异性
用DMEM液将毒种稀释至200TCID50/0.1ml,与灭活的抗牛副流感病毒特异性血清等量混匀,置37℃中和1小时,同步接种生长良好的MDBK细胞3瓶(细胞含量以3×105/ml),同时设病毒对照、正常细胞对照和阴性血清对照,置37℃、含5%的CO2培养箱中,培养5~7日。中和病毒组和正常细胞对照组均应不出现细胞病变(CPE);病毒对照组和阴性血清对照组均应出现CPE。
1.2.8毒种使用代次
将原始分离得到的牛副流感病毒PBIV3-B株,在MDBK细胞上连续传40代(即在菌种保藏编号为CGMCC No.14293的毒株基础上连续传代33代),测定了每一代病毒的TCID50,选择第15、20、25、30、35、40代病毒分别灭活后制成疫苗,接种2~4月龄犊牛,14天后进行攻毒。结果表明,病毒在MDBK细胞上传代,第7代以后(包括第7代病毒,即菌种保藏编号为CGMCC No.14293的病毒株)各代次病毒含量稳定,均不低于1010.0TCID50,且中和效价均在32以上,已经达到了做疫苗的标准。攻毒试验表明,第15、20、25、30代病毒制备的疫苗免疫牛在对PBIV3-B株攻击的保护性无显著差异,犊牛均健康存活;第35和40代病毒制备的疫苗免疫后攻毒各有3头和2头死亡,而对照组4头犊牛均有不同程度的牛副流感病毒感染症状。根据以上结果,为保证生产毒种良好的免疫原性和安全性,本发明确定了病毒的传代最高次数在25代,原始毒种为7~11代,基础毒种为第12~21代,生产用毒种最高传代次数限制在3代(第22~25代)以内。
1.2.9毒种保存期的确定
将牛副流感病毒PBIV3-B株湿毒保存在-20℃和-70℃下,于保存后不同时间取样进行中和效价和TCID50测定,结果显示湿毒于-20℃冻存18个月、于-70℃保存30个月时毒价开始明显下降;冻干毒保存在-20℃和-70℃下,于保存后每年取样进行中和效价和TCID50测定。结果在-20℃保存30个月的病毒的效价略有下降,保存36个月病毒的中和效价和TCID50值明显下降,而在-70℃下保存40个月病毒的中和效价和TCID50没有明显的变化,保存50个月下降明显。考虑到在病毒保存时存在的其他不利因素,保证病毒保存期可靠性,牛副流感病毒PBIV3-B株湿毒在-20℃的保存期定为10个月,在-70℃的保存期定为20个月;牛副流感病毒PBIV3-B株冻干毒在-20℃的保存时间定为30个月;冻干毒在-70℃的保存时间为40个月。
2生产用细胞
2.1细胞来源
MDBK细胞,购自中国科学院上海细胞库,由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所保存。
2.2细胞的选择
在病毒的培养过程中本发明选用了传代细胞系MDBK进行病毒的增殖,病毒按病毒感染量值(MOI)为0.01接种MDBK细胞上的病变时间早,增殖滴度最高,MDBK细胞感染牛传染性鼻气管炎病毒IBRV-B株72小时如图2所示,牛副流感病毒PBIV3-B株感染MDBK细胞后的一步生长曲线如图3。此种条件下,72小时收获的病毒滴度最高。
2.3细胞系的建立
制苗用细胞系选用MDBK细胞。传代范围控制在40~55代,本发明建立了原始细胞库、基础细胞库和工作细胞库。其中原始细胞库共分装55瓶;基础细胞库分装370瓶;工作细胞库共分装了350瓶。对各个代次的细胞都按《中国兽药典》附录进行检验,应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒的污染。
2.4细胞系的鉴定
根据现行《中国兽药典》附页中有关“生产、检验用细胞标准”规定进行检验,均符合标准。具体见“MDBK细胞系的鉴定试验报告”。
实施例2灭活疫苗的制备
牛副流感病毒PBIV3-B株的制备工艺流程是按照目前已经成熟的商品化疫苗制备工艺制备。从实验室制备的3批疫苗和中间试制的5批疫苗质检结果来看,用该工艺流程制备的疫苗产品质量稳定,效检结果完全符合所制定的质量标准。
1病毒液的制备
在病毒繁殖过程中,很多因素会影响细胞及病毒的增殖。经过一系列比较试验,选用细胞培养液血清浓度为10%,维持液血清浓度为2%,能够繁殖稳定的,高滴度的病毒液;另外对培养液的pH值、细胞浓度、病毒接种剂量、收毒时间等进行了比较试验,结果显示病毒繁殖时细胞维持液pH值控制在7.2~7.4之间、按病毒感染量值(MOI)为0.01接种MDBK细胞、病毒最佳收获时间为48~72小时,均能获得高病毒含量的病毒液。
在本实施例中选用细胞培养液中血清浓度为10%,pH值控制在7.3,维持液(商品名是DMEM,购自Hyclone公司)中血清浓度为2%,按病毒感染量值(MOI)为0.01牛副流感病毒PBIV3-B株株第7代病毒株(菌种保藏编号为CGMCC No.14293)种毒于MDBK细胞、病毒收获时间为72小时。
2灭活工艺
选择终浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的甲醛溶液和终浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的β-丙内酯对牛传染性鼻气管炎病毒进行灭活比较试验,试验结果表明,0.2%的β-丙内酯在4℃条件下24小时后可将牛传染性鼻气管炎病毒完全灭活,而且,试验结果表明β-丙内酯对细胞的损伤较小;牛副流感病毒加入0.3%的甲醛溶液,经37℃灭活48小时亦可达到完全灭活病毒的目的;但甲醛具有强刺激性,如果疫苗中残留游离的甲醛进入动物机体,会产生不良反应。因而最终确定用0.2%的β-丙内酯在4℃条件下灭活牛副流感病毒24小时后,室温灭活24小时以水解残余的β-丙内酯。
3乳化工艺
采用法国赛比克公司的商品化MontanideTM ISA15AVG佐剂,除菌后可直接用于疫苗乳化制备;乳化前将灭活的同批病毒液解冻混合,在无菌室内用匀浆机以200r/min搅拌均匀,然后按照水相抗原与油相佐剂8.5∶1.5的体积配比;乳化程序为先将水相放入乳化器中进行搅拌,然后缓缓加入油相佐剂,以800r/min连续搅拌30分钟;生产得到的疫苗属水包油剂型,为了稳定界面和消除气泡,获得最佳乳化效果,需要静止30分钟后分装。
4半成品检验质量标准
4.1无菌检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验,应无菌生长。
4.2病毒含量测定
以DMEM培养液将毒种作连续10倍系列稀释,每个稀释度取100μl加入96孔细胞培养板中,每个稀释度作8个重复,随后加入MDBK细胞,每孔100μl(细胞含量以3×105/ml),并设正常细胞培养对照,置37℃、含5%的CO2培养箱中培养,逐日观察细胞病变(CPE),病变早期可见典型的细胞变大、变圆现象,然后局部细胞开始融合;晚期细胞开始表现为大面积融合呈网状,最后融合细胞坏死、脱落。观察7日,记录细胞病变的孔数,按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。结果:每毫升病毒液不低于1011.0TCID50。
4.3灭活检验
取灭活后的病毒液,按病毒液与生长液1∶10的比例接种于MDBK细胞3瓶(细胞含量以3×105/ml),37℃培养观察5日,对无病变者再盲传2代,同时设病毒对照。结果无细胞病变。实验室生产的3批半成品均合格。
5关于成品检验质量标准
5.1安全检验标准
为了保证疫苗的安全性,本发明对实验室制备的5批疫苗先后进行了“对小白鼠的安全性试验”、“对犊牛单剂量接种、单剂量重复接种、一次性超剂量(2倍剂量)接种的安全性试验”、“对育肥牛单剂量接种、单剂量重复接种、一次性超剂量(2倍剂量)接种的安全性试验”、对妊娠母牛单剂量接种、单剂量重复接种、一次性超剂量(2倍剂量)接种的安全性试验”。试验结果表明:各免疫动物单剂量接种、单剂量重复接种、一次性大剂量接种后,动物状态均良好,采食饮水正常,无异常反应;疫苗接种后对妊娠母牛的繁殖功能也无明显影响。以上试验均证明疫苗是安全的。通过试验观察本发明总结出只要接种疫苗后21日内不出现局部红肿、溃疡、糜烂以及神经萎缩、采食减少等现象,以后就不会出现因为疫苗接种而引起的不良反应,就可以证明疫苗的安全性。因此,在试行规程(草案)中规定:用2~6月龄健康易感犊牛(中和抗体效价不高1∶2)2头,各深部肌肉注射疫苗4ml,另取条件相同的2头牛不接种作为对照,连续观察14天。在观察期内应不出现由疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应。
5.2效力检验标准的制定
5.2.1抗体效价与免疫攻毒保护相关性试验
将安全性试验合格的1批牛副流感病毒灭活疫苗151211,按照不同剂量0.5ml/头份、1ml/头份、2ml/头份、4ml/头份分别免疫2~6月龄的健康犊牛(中和抗体不高于2)5头间隔14日免疫2次,未免疫对照组3头,二免14日以后以107.0TCID50/ml牛副流感病毒PBIV3-B株第10代强毒4ml鼻腔内喷雾接种,以确定中和抗体滴度与免疫攻毒保护的相关性。试验结果表明,当血清中和抗体效价在不低于1∶16时,犊牛攻毒保护率可80%以上。因而确定疫苗效力检验时,检验标准为二次免疫14日后,其血清中和抗体效价不低于1∶16。
5.2.2最小免疫剂量和最小使用剂量试验
将安全性试验合格的3批牛副流感病毒灭活疫苗151211、151212和151213,按照不同剂量1ml/头份、2ml/头份、4ml/头份、6ml/头份分别免疫2~6月龄的健康犊牛(PBIV3中和抗体不高于2),于第二次免疫后14日采血进行中和抗体检测。结果显示,以2ml/头份剂量免疫犊牛28日后中和抗体效价平均值不低于1∶16,而4ml/头份以上剂量免疫犊牛28日后中和抗体效价均不低于1∶32。根据中和抗体效价与攻毒保护相关性试验结果,确定在免疫后28日牛副流感病毒中和抗体效价达到1∶16以上时,可以完全保护牛传染性鼻气管炎病毒强毒的攻击。考虑到疫苗的保存、运输和使用过程中可能存在的效价降低因素。本发明将牛副流感病毒灭活疫苗(PBIV3-B株)的最小免疫剂量确定为2ml/头份,使用剂量确定为4.0ml/头份。
5.2.3免疫豚鼠与免疫牛中和抗体相关性试验
将实验室生产的3批牛副流感病毒灭活疫苗151211、151212和151213分别免疫豚鼠和犊牛,进行中和抗体效价检测,分析豚鼠与犊牛的中和抗体相关性。结果表明,当豚鼠免疫0.5ml/只、犊牛免疫2ml/头,28日后其血清中和抗体效价均不低于1∶16,二者有明显的平行关系。试验结果证明可以用实验动物豚鼠代替靶动物(牛)进行效力检验。
因此,根据以上结果,本发明将本产品的效力检验标准定为:
用体重350g~400g成年豚鼠(PBIV3中和抗体效价不高于1∶2)5只,各肌肉注射疫苗0.5ml,28日后,连同对照豚鼠4只,一并采血,测定PBIV3中和抗体效价。对照豚鼠中和抗体效价应不高于1∶2,免疫豚鼠至少应有4只出现抗体反应,且中和抗体效价应不低于1∶32。
用3月龄健康易感犊牛(IBRV中和抗体效价不高于1∶2)5头,各深部肌肉注射疫苗2ml,28日后,连同对照牛4头,一并采血,测定IBRV中和抗体效价。对照牛中和抗体效价应不高于2,注苗牛应全部出现抗体反应,且中和抗体效价应不低于1∶16。
6抗体消长规律与免疫持续期试验
将安全性试验合格的3批牛副流感病毒灭活疫苗151211、151212和151213分别免疫健康犊牛、妊娠牛和成年牛。为进一步掌握免疫效力及免疫持续期,制定合理的免疫程序,保证免疫牛群保持高而持久的抗体水平,对免疫牛不同时间进行抗体检测,以掌握其抗体消长规律。
试验结果表明,牛群免疫2ml/头份,2~3周后加强免疫一次,28日后其血清中和抗体不低于1∶16,免疫后抗体高峰在4~6个月内,其后抗体水平逐渐下降,至12个月仍达1∶16,为保证疫苗的免疫保护效果,确定其免疫持续期为10个月。
7免疫程序的确定
根据牛群免疫后的抗体消长规律、免疫期,同时结合临床上牛传染性鼻气管炎病毒感染的实际情况,本发明确定了牛副流感病毒灭活疫苗(PBIV3-B株)的免疫程序为:每年免疫两次。每次免疫均为2ml/头(成年牛加倍)。
8疫苗的保存期
本发明对实验室制备的3批灭活疫苗(151211、151212和151213)保存期进行了试验研究,将3批疫苗在2~8℃条件下保存9、12、15、18个月,在各个时间段分别取样对其性状、安全性及免疫效力检测。结果显示,3批疫苗在2~8℃条件下保存18个月性状不发生明显变化,无菌检验和安全性都符合质量标准的要求。效力检验中151211批疫苗保存18个月样品免疫豚鼠后有一只豚鼠中和抗体效价为1∶16;151212和151212批疫苗保存18个月样品免疫牛后均有一头牛血清中和抗体效价为1∶16,但免疫牛平均中和抗体水平为1∶16,考虑到疫苗在运输和使用过程中造成的效价损耗,本发明将疫苗的保存期定为2~8℃条件下保存15个月。
9与国内同类商品苗的免疫效力比较
将实验室试制的3批疫苗151211、151212和151213与市售疫苗A(批号:20151201)和B(批号:20150917),分别免疫350g~400g健康豚鼠及5~6月龄健康犊牛,28日后其血清中和抗体效价均不小于1∶16,达到攻毒保护要求,实验室制备的疫苗中和抗体平均值略高于市售A疫苗,明显高于市售B疫苗。
分别在免疫前、免疫后3、6、9、12个月静脉采血分离血清,检测抗体产生情况。结果表明:在免疫后6个月内,实验室试制的疫苗和市售A和B疫苗免疫牛,中和抗体效价均在1∶16以上,均能达到攻毒保护要求。而6个月后市售B疫苗免疫牛中和抗体下降明显。
注射3批疫苗151211、151212和151213的接种部位不存在脓肿、结痂等不良反应,而市售A和B疫苗免疫接种部位存在2%以上的上述不良反应。
以上所述仅为本发明的优选实施例,对本发明而言仅是说明性的,而非限制性的;本领域普通技术人员理解,在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变,修改,甚至等效变更,但都将落入本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一株牛副流感病毒,其特征在于,所述牛副流感病毒命名为牛副流感病毒PBIV3-B株,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其菌种保藏编号为:CGMCCNo.14293。
2.权利要求1所述的牛副流感病毒在制备牛副流感病毒灭活疫苗中的应用。
3.一种牛副流感病毒灭活疫苗,其特征在于含有灭活后的权利要求1所述的牛副流感病毒。
4.如权利要求3所述的灭活疫苗,其特征在于所述的灭活是指将权利要求1所述的牛副流感病毒采用0.2%的β-丙内酯在4℃条件下灭活24小时,然后室温灭活24小时水解残留的β-丙内酯。
5.权利要求3或4所述的灭活疫苗在制备预防由牛副流感病毒引起的疾病的生物制品药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于所述的疾病为健康阴性牛发生的呼吸道疾病。
Priority Applications (1)
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CN201710560660.9A CN107338227B (zh) | 2017-07-10 | 2017-07-10 | 牛副流感病毒pbiv3-b株及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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