CN108823175A - 一种人副流感ⅲ型病毒抗原保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人副流感Ⅲ型病毒抗原保存方法，首先将人副流感Ⅲ型病毒按0.001~0.01MOI接种于长满单层的Vero细胞上，然后于37℃、5%CO2培养；接种后第5天，ELISA法检测上清中病毒效价，合格后收取病毒悬液；使用灭活剂对病毒悬液进行灭活，灭活合格后，进行10倍浓缩，然后加入冻存保护剂，‑20℃保存。本发明所用的冻存保护剂由10%BSA+40%甘油配制而成。本发明的优点在于保存方法简单，使用成分简单的冻存保护剂对其进行冻存处理后再进行‑20℃保存，使用时经过反复冻融，病毒抗原效价仍保持稳定，不影响后期的使用。

Description

一种人副流感Ⅲ型病毒抗原保存方法
技术领域
本发明涉及抗原的保存，尤其是涉及一种人副流感Ⅲ型病毒抗原保存方法。
背景技术
人类副流感病毒(HPIVs)常常引起儿童下呼吸道感染，其致病性仅次于呼吸道合胞病毒 (RSV)。人类副流感病毒不仅与RSV一样，可以造成反复发作的上呼吸道感染（如感冒和喉咙痛），它还能造成严重的反复感染的下呼吸道疾病（如肺炎，支气管炎和细支气管炎），特别是在老年人中和有免疫缺陷的人群中。
从血清学上人类副流感病毒可分为I型、Ⅱ型、Ⅲ型、IV型，其中IV型又分a和b两个亚型。这些病毒颗粒大小不一（平均直径大小在150纳米～300纳米之间），形态各异。
目前为止，对于人类副流感Ⅲ型病毒引起的呼吸道感染还没有特效药物，也没有制造出疫苗，所以对于疾病的前期诊断尤为重要。疾病诊断时采用商业销售的诊断试剂盒，其中人副流感Ⅲ型病毒抗原是其重要的组成成份。由于人副流感Ⅲ型病毒抗原为生物活性材料，工厂大规模制备时，需要-20℃保存，且会存在多次冻融的情况，而多次冻融后抗原的效价会明显降低，影响后期的使用。所以采用一种新的能在反复冻融后还能有效保护抗原效价的保存方法就显得尤为必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种反复冻融后还能有效保护抗原效价的人副流感Ⅲ型病毒抗原保存方法。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的人副流感Ⅲ型病毒抗原保存方法包括下述步骤：
第一步，将人副流感Ⅲ型病毒按0.001~0.01MOI接种于长满单层的Vero细胞上，然后于37℃、5%CO2培养；
第二步，接种后第5天，ELISA法检测上清中病毒效价，合格后收取病毒悬液；
第三步，使用灭活剂对病毒悬液进行灭活，灭活合格后，进行10倍浓缩，然后加入冻存保护剂，-20℃保存。
本发明所用的冻存保护剂由10%BSA+40%甘油配制而成。
本发明的优点在于保存方法简单，使用成分简单的冻存保护剂对其进行冻存处理后再进行-20℃保存，使用时经过反复冻融，病毒抗原效价仍保持稳定，不影响后期的使用。
BSA(牛血清白蛋白)又称第五组分，是牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent；在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用，防止酶的分解和非特异性吸附，不仅能减轻有些酶的变性，还能减轻一些不利的环境因素如加热、表面张力及化学因素引起的变性能，对蛋白、病毒抗原有很好的保护作用。同时，人副流感Ⅲ型病毒抗原在冻存过程中，因冰晶的产生，会对效价造成影响。
甘油溶于水，与水混合后，溶液的冰点会降低：溶液中添加10%的甘油时，冰点为-1.6℃，当添加30%的甘油时，冰点降为-9.5℃，添加50%的甘油时，冰点降为-23℃，当添加66.7%的甘油时，溶液的冰点可降为-46.5℃；本发明即是利用甘油的这一特点，添加了40%的甘油，大大减少了人副流感Ⅲ型病毒抗原保存时冰晶的形成，相应的也减少了对抗原形成的损伤，保护抗原的效价稳定。
具体实施方式
下面对本发明方法作更加详细的说明,以方便本领域技术人员对本申请的进一步理解。
本发明的人副流感Ⅲ型病毒抗原保存方法包括下述步骤：
第一步,将人副流感Ⅲ型病毒于37℃快速融化后，按0.01MOI计算病毒接种量，将所需体积的毒种接种于长满单层的Vero细胞上，并补加含有2%小牛血清的病毒维持液，于37℃、5%CO2培养；
第二步，接种后第5天，无菌抽取培养上清，使用ELISA夹心法检测上清中病毒效价，当酶免吸光值达到3.57时，病毒效价合格，收取病毒悬液上清；
第三步, 收取的病毒培养液灭活完成后，使用中空纤维柱进行10倍的超滤浓缩；浓缩完成后，取出2管1ml样品：
其中1管加入终体积50%的DMEM培养基，另1管加入终体积50%冻存保护剂（10%BSA+40%甘油）。将两个样品同步冻融3次（终浓度为5倍），其中-20℃每次冻存2小时后，放置37℃复融30分钟。
每次冻融后留样检测抗原效价，汇总数据见表1。
表1
注：浓缩前——病毒悬液浓缩前留样检测数据，作为冻融的对照。
结论：将经过冻融3次的数据进行对比可以看出，加入50% DMEM培养基的抗原，冻融1次后，效价下降明显。而加入50%冻存保护剂的抗原，经过反复冻融，效价保持稳定，没有下降，基本与浓缩前相当，说明本发明方法对人副流感Ⅲ型病毒抗原有良好的保存效果，虽经反复冻融，但效价保存稳定，不会影响后期使用。

Claims (2)

1.一种人副流感Ⅲ型病毒抗原保存方法，其特征在于：包括下述步骤：
第一步，将人副流感Ⅲ型病毒按0.001~0.01MOI接种于长满单层的Vero细胞上，然后于37℃、5%CO2培养；
第二步，接种后第5天，ELISA法检测上清中病毒效价，合格后收取病毒悬液；
第三步，使用灭活剂对病毒悬液进行灭活，灭活合格后，进行10倍浓缩，然后加入冻存保护剂，-20℃保存。
2.根据权利要求1所述的人副流感Ⅲ型病毒抗原保存方法，其特征在于：所述冻存保护剂由10%BSA+40%甘油配制而成。
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