CN110221077B - 一种牙鲆弹状病毒检测试纸及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牙鲆弹状病毒检测试纸及其制备方法。所述检测试纸包括载体板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜检测层、吸水垫，所述样品垫和吸水垫分别在载体板的两端，金标垫一端位于样品垫的下方，金标垫上载有胶体金标记的抗牙鲆弹状病毒G蛋白单抗，由杂交瘤细胞株HIRRV‑G‑4D10（CCTCC NO：C201869）所分泌，硝酸纤维素膜上依次划有检测线和质控线，其中检测线靠近样品垫侧，质控线靠近吸水垫侧，检测线包被抗牙鲆弹状病毒M蛋白单抗HIRRV‑M‑1F9和HIRRV‑M‑4D10混合单抗，质控线包被羊抗鼠IgG。本发明能够对牙鲆弹状病毒进行特异性检测，具有快捷迅速、灵敏准确、受影响小、成本低廉等优点，不受专业人员的限制。

Description

一种牙鲆弹状病毒检测试纸及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种牙鲆弹状病毒(hirame rhabdovirus, HIRRV) 的检测试纸及其制备方法，属于免疫学、病毒学及诊断试剂交叉技术领域。

背景技术

牙鲆弹状病毒病是一种高致病性牙鲆疾病，而牙鲆弹状病毒 (hiramerhabdovirus, HIRRV) 是引发该病的病原。牙鲆弹状病毒是一种具有强烈致病性的单股负链RNA病毒，病毒粒子呈弹状，宽约60-80nm，长约为160-180nm，可引起牙鲆，香鱼（Plecoglossus altivelis）等肌肉组织器官及内脏出血，造血器官坏死，从幼鱼到成鱼均可被感染；人工感染真鲷（Pagrosomus major）、黑鲷稚鱼有强烈的致病性，对虹鳟（Oncorhynchus mykiss）也具致病性。发病季节多为冬季和早春，主要在低温条件下（水温≤15℃）发病，水温10℃时为发病高峰期，死亡率可高达60%。牙鲆弹状病毒易感宿主由海水鱼过渡到淡水鱼，流行区域和易感种群均有逐年扩大的趋势，阻碍了全球水产养殖业特别是海水养殖业的健康发展，带来严重的经济损失。通过胶体金试纸条这一检测手段有利于牙鲆弹状病毒防治工作的进行，对于养殖户而言可以有利于养殖户在养殖过程中对于牙鲆弹状病毒采取针对性的预防措施，降低养殖成本的同时提高经济效益。

目前该病毒常用的检测方法（例如组织病理技术、电镜技术、细胞培养技术）在准确性、灵敏性、安全性和花费等方面有各自的优点，但它们不同程度上受到需要专业人员和复杂仪器的限制。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种简便、快速、灵敏度高、特异性强、成本低廉的牙鲆弹状病毒检测试纸，其检测结果肉眼可见，不需要专业仪器设备。

本发明的另一个目的是提供上述牙鲆弹状病毒快速检测试纸的制备方法。

本发明的牙鲆弹状病毒检测试纸，包括：载体板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜检测层、吸水垫，所述样品垫和吸水垫分别位于载体板的两端，硝酸纤维素膜检测层位于所述载体板的中部，所述金标垫一端位于样品垫的下方，另一端位于硝酸纤维素膜的上方，所述金标垫上载有胶体金标记的抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单抗HIRRV-G-4D10，所述硝酸纤维素膜上依次划有检测线和质控线，所述检测线靠近样品垫侧，质控线靠近吸水垫侧；所述检测线包被抗牙鲆弹状病毒M蛋白的单抗HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10混合单抗，质控线包被羊抗鼠IgG。

所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单抗HIRRV-G-4D10由名称为：杂交瘤细胞株HIRRV-G-4D10，保藏号为：CCTCC NO：C201869，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2018年3月29日的杂交瘤细胞分泌的。

所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白单抗HIRRV-G-4D10能与分子量为60 kDa牙鲆弹状病毒蛋白条带发生特异性反应，且具有牙鲆弹状病毒中和活性。

所述抗牙鲆弹状病毒M蛋白的单抗HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10能与分子量为22kDa牙鲆弹状病毒蛋白条带发生特异性反应。

本发明的牙鲆弹状病毒检测试纸的制备方法如下：

（1）单抗HIRRV-G-4D10、HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10的制备：

利用Trizol法提取弹状病毒总RNA反转后获得cDNA，以cDNA产物为模板，PCR扩增G基因片端（61-1524 nt）与M蛋白基因全长，分别连接pET-28a、pET-32a载体构建重组表达质粒pET-28a-G与pET-32a-M，将其导入感受态大肠杆菌后经诱导表达、亲和层析纯化获得重组G蛋白与M蛋白，以亲和纯化的重组G蛋白与M蛋白作为抗原免疫Balb/c小白鼠，采用细胞融合法制备杂交瘤细胞，利用免疫学检测筛选方法，筛选出分泌抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞HIRRV-G-4D10与抗牙鲆弹状病毒M蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10，采用常规方法扩大培养上述所得到的杂交瘤细胞株，腹腔注射BALB/c小鼠取腹水，采用辛酸-硫酸铵法进行纯化获得抗HIRRV的三种单抗。

（2）金标垫的制备：

①胶体金与金标抗体的制备：

采用微波炉-柠檬酸三钠还原法制得颗粒大小为20-30nm的胶体金，用0.1mol/L碳酸钾溶液调节胶体金pH值为8.2，将单抗HIRRV-G-4D10按照18μg/ml加入胶体金中，再加入稳定剂5%的BSA经离心纯化后用金标保存液悬起，即为金标单抗液体。

②载有金标单抗的金标垫的制备：

将制成的金标单抗液体喷涂到玻璃纤维上，冷冻干燥。

（3）硝酸纤维素膜检测层的制备

将调整好浓度的单抗HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10的混合抗体和羊抗小鼠IgG喷涂于硝酸纤维素膜检测层上，分别作为检测线和质控线，晾干后封闭液中浸泡，37℃烘干备用；

（4）牙鲆弹状病毒快速检测试纸条的制作

在载体板上依次贴上硝酸纤维素膜、吸水垫、金标垫和样品垫，进行切条，即成本发明试纸。

利用牙鲆弹状病毒检测试纸对HIRRV进行检测的方法，其步骤如下：

手持试纸的吸水垫一端将样品垫一端浸入待检样品中约10s，浸入深度约0.5cm，平放试纸约10min，肉眼观察结果。

本发明采用双抗体夹心免疫层析原理：即，金标垫上有已被胶体金标记的单抗HIRRV-G-4D10，硝酸纤维素膜检测线处划有混合的HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10抗体，通过毛细管虹吸作用，抗原抗体反应，与金标抗体结合的待测抗原被硝酸纤维素膜检测线上的抗体俘获，于检测线处聚集显色，从而达到检测的效果。

当样品中含有较多的HIRRV，样品扩散至金标垫时，金标单抗将与HIRRV结合，形成大量的金标单抗-HIRRV复合物，当该复合物层析至硝酸纤维素膜检测层的检测线时，预先包被在此处的混合抗HIRRV M蛋白单抗识别复合物中HIRRV，被捕获富集形成金标单抗复合物。游离的金标单抗继续前移，通过包被有羊抗鼠IgG的质控线处形成金标抗体复合物。在质控线处也出现由胶体金颗粒固定并累积显现肉眼可见的红色，其结果是检测线和质控线处均显现红色，表示HIRRV阳性；若检测样品中不含HIRRV，检测线处不显现红色，只在质控线处显现红色，表示HIRRV阴性；若质控线处不显现红色，说明试纸失效或者操作有问题，检测结果无效。

本发明具有以下优点：检测快速，10min左右出现肉眼可见结果，并且能够相对定量检测病原；操作简便，不需要专业人员；检测成本低，无需专业仪器设备，适合养殖现场检测；灵敏度高，特异性强，具可重复性，储存方便，稳定性好（室温下有效期6个月，4℃下有效期12个月）。

附图说明

图1为在大肠杆菌中表达的弹状病毒重组G蛋白与M蛋白的SDS-PAGE图。

图中，泳道M表示蛋白Marker；泳道1表示无IPTG诱导的阴性对照；泳道2表示IPTG诱导的重组pET-28a-G转染的大肠杆菌；泳道3表示纯化的重组G蛋白；泳道4表示无IPTG诱导的阴性对照；泳道5表示IPTG诱导的重组pET-32a-M转染的大肠杆菌；泳道6表示纯化的重组M蛋白。

图2为单克隆抗体对重组G蛋白与M蛋白的蛋白质印迹分析图。

图中，泳道M表示标准分子量蛋白；泳道1表示纯化的牙鲆弹状病毒的SDS-PAGE；泳道2：单克隆抗体HIRRV-G-4D10与纯化的牙鲆弹状病毒反应；泳道3与泳道6：阴性对照；泳道4：单克隆抗体HIRRV-M-1F9与纯化的牙鲆弹状病毒反应；泳道5：HIRRV-M-4D10与纯化的牙鲆弹状病毒反应。

图3为抗牙鲆弹状病毒单克隆抗体HIRRV-G-4D10特异性识别的60kDa病毒蛋白质的质谱分析图。方框内序列是与牙鲆弹状病毒G蛋白序列一致的肽段。

图4为抗牙鲆弹状病毒单克隆抗体HIRRV-M-1F9与HIRRV-M-4D10特异性识别的22kDa病毒蛋白质的质谱分析图。其中， (A) 为22kDa 蛋白肽指纹图谱；(B) 为Mascot 分析 22kDa 蛋白肽指纹图谱结果。

图5为利用单克隆抗体HIRRV-G-4D10结合间接免疫荧光技术检测感染HIRRV的EPC细胞免疫荧光结果图。

图6为利用单克隆抗体HIRRV-M-1F9与HIRRV-M-4D10结合间接免疫荧光技术检测感染HIRRV的EPC细胞免疫荧光结果图。

图7为单克隆抗体HIRRV-G-4D10的病毒微量中和测定实验图。

图8为本发明牙鲆弹状病毒快速检测试纸结构示意图。其中，1、载体板；2、样品垫；3、金标垫；4、硝酸纤维素膜检测层；5、吸水垫；6、检测线；7、质控线。

图9为本发明牙鲆弹状病毒快速检测试纸结果示意图。

判定结果Ⅰ：牙鲆弹状病毒阳性；Ⅱ：牙鲆弹状病毒阴性；Ⅲ，Ⅳ：试纸失效或本次操作出现问题。

图10是本发明的快速诊断试纸对不同稀释度的牙鲆弹状病毒样品实际检测结果图。

其中Ⅰ-Ⅳ稀释度：（1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³ copies/μL）；Ⅴ：PBS阴性对照；Ⅵ：传染性造血器官坏死病病毒；Ⅶ：病毒性出血败血症病毒。

图11为本发明的快速诊断试纸对感染牙鲆弹状病毒不同组织的实际检测结果图。

其中1-5：牙鲆肝脏感染HIRRV第1-5天检测结果；6-10：牙鲆脾脏感染HIRRV第1-5天检测结果；11-15：牙鲆肾脏感染HIRRV第1-5天检测结果；16-20：牙鲆心脏感染HIRRV第1-5天检测结果。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明。

以下实施例所用仪器及试剂：

倒置显微镜(购自OlymPuS公司)；高速冷冻离心机(Sigama公司)；喷膜仪XYZ3060(购自Biodot公司)；半自动贴膜仪LM5000(购自Biodot公司)；切条仪(Bidot公司)；柠檬酸三钠(购自中国上海试剂一厂，分析纯)；氯金酸(购自中国上海试剂一厂，分析纯)；羊抗小鼠工gG(购自Sigama公司)；牛血清白蛋白(购自Sigama公司)；Tween-20(购自Sigama公司)；硝酸纤维素膜(购自Whatman公司)。

实施例1：抗牙鲆弹状病毒G蛋白和M蛋白单克隆抗体的制备：

1. 牙鲆弹状病毒G与M蛋白表达质粒的构建与蛋白表达：

（1）以Trizol法抽提牙鲆弹状病毒的总RNA。

（2）根据引物设计原则及公布的一种牙鲆弹状病毒分离株CNPo2015的G基因（GeneBank：KY363350），利用引物设计软件Primer5.0，结合pET-28(a)质粒的多克隆位点的特点，选择Bam H I和Xho I 的酶切位点处作为目的基因的插入位置，设计牙鲆弹状病毒G蛋白表达引物。

同样根据GenBank 公布的 HIRRV (序列号：FJ376982.1) 和表达载体 pET-32(a)的多克隆位点序列，设计牙鲆弹状病毒M 蛋白特异引物，结合表达载体 pET-32(a)的多克隆位点序列，选择 BamH I和 Sal I 酶切位点处作为目的基因的插入位置（文献参考：TangX, Qin Y, Sheng X, et al. Generation, characterization and application ofmonoclonal antibodies against matrix protein of hirame novirhabdovirus(HIRRV) in flounder[J]. Diseases of aquatic organisms, 2018, 128(3): 203-213.）。

G蛋白序列引物：

上游引物：5’-GAGAATTCCAAACCATCAA GCCTGGAG-3’；

下游引物：5’-GAGTCGACTCGACTGGCGAGGTGGT-3’；

M蛋白序列引物：

上游引物 5’-CGGGATCCATGTCTCTCTTCAAGCGAAC-3’；

下游引物 5’-GCGTCGACTTTCCCCTTTTTGGTTG-3’。

（3）以提取的总RNA为模板，先逆转录合成cDNA第一链，然后进行常规PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，利用DNA片段回收试剂盒对目的基因进行纯化回收。

（4）将质粒pET-28(a)与pET-32(a)和纯化回收的PCR扩增产物分别用限制性内切酶Bam H I和Xho I、BamH I和 Sal I 进行双酶切，使用T4 DNA连接酶对酶切产物进行连接，连接后构建质粒pET-28a-G和pET-32a-M。将重组质粒分别转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，待长出的菌落，使用T7通用引物，采用菌落PCR法筛选阳性菌，并进行测序验证。

（5）将两株阳性克隆菌和含pET-28a与pET-32a的空载体的菌株放入含卡那霉素的LB液体培养基中37℃过夜振荡培养，次日按1:100稀释培养过夜的菌液，继续培养至菌液OD₆₀₀=0.4-0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG）至终浓度为1mmol/L，未加IPTG诱导的菌液作为对照，继续培养6h后，离心收集菌体进行SDS-PAGE分析。

（6）采用上述方法，进行大量诱导。收集菌液，将菌体细胞用缓冲液B（50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% NP-40, pH 8.0）重悬，反复冻融5次后置于冰浴条件下进行超声破碎8 min（Sonics & Materials；振幅39％；pulse on，4 s；pulse off，1 s），1500 g离心30 min收集包涵体沉淀；以Ni离子螯合的亲和层析柱（HisTrap HP 1 ml, GE）对重组蛋白进行纯化，纯化获得的目的蛋白经SDS-PAGE检测纯化情况，剩余的用PBS缓冲液（NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na₂HPO₄ 10 mmol/L，KH₂PO₄ 2 mmol/L，pH 7.2）重悬，-80℃保存备用。

结果显示，诱导后的pET-28a-G菌液蛋白在相对分子质量52 kDa处有明显的条带，而未诱导的菌液蛋白无相应条带。且牙鲆弹状病毒G蛋白理论分子量以及标签蛋白分子量之和与SDS-PAGE凝胶显示的目的蛋白分子量一致。同样，经IPTG诱导的pET-32a-M 重组大肠杆菌全菌蛋白中出现一条大小约为 42 kDa 的特异性蛋白条带，与预期值大小一致，未经 IPTG诱导的重组菌相应条带不明显。经亲和层析纯化后的重组蛋白G有一条分子量为52kDa的目的条带，无其他明显蛋白条带，纯化后的重组蛋白M有一条分子量为42 kDa的目的条带，无其他明显杂带（如图1）。

2. 小鼠抗牙鲆弹状病毒G蛋白与M蛋白单克隆抗体的制备

（1）免疫

用纯化的重组牙鲆弹状病毒G蛋白与M蛋白分别作为抗原。免疫共分4次进行，每次免疫间隔为1周，前三次为腹腔注射，最后一次为尾静脉注射：

①基础免疫：100μg纯化的重组蛋白与福氏完全佐剂等量（V/V）混匀作为抗原；

②加强免疫：100μg纯化的重组蛋白与福氏不完全佐剂等量（V/V）混匀作为抗原；

③二次加强免疫：100μg纯化的重组蛋白与福氏不完全佐剂等量（V/V）混匀作为抗原；

④融合前三天扩增免疫：50μg纯化的重组牙鲆弹状病毒G蛋白与M蛋白分别作为抗原。

（2）细胞融合

①免疫脾细胞的制备：脱颈椎处死免疫小鼠，无菌取出脾脏后，过200目网筛，用RPMI-1640溶液吹打形成单细胞悬液；1000rpm/离心5min，弃去上清液，沉淀用10 mL RPMI-1640溶液重悬，尽量吸出组织块，放在一旁备用；

②SP2/0骨髓瘤细胞的制备：取-80℃冻存的SP2/0细胞，37℃水浴速溶；1000 r/min离心3 min，吸出上清，加入1mL GIT培养基，转移到24孔板中；大约24h细胞长满后，分孔；待分孔至16孔，吸出上清，每孔加1.5ml培养基，4孔的细胞转移到25mm²细胞培养瓶中，37℃下CO₂培养箱培养。48 h左右进入对数生长期，融合前12h更换培养基，选择生长良好和形态典型正处于对数分裂期的SP2/0细胞；

③取约1.0× 10⁸个脾细胞和2.0×10⁷个骨髓瘤细胞悬液进行细胞融合；

④取出4瓶对数生长期的骨髓瘤细胞，滴管吸出废液，加入RPMI 1640培养基，反复吹打使细胞完全脱落；

⑤骨髓瘤与免疫脾细胞混合，吹打混匀，1200 rpm/min，8 min；

⑥滴管尽量吸出上清，轻弹离心管底，使两种细胞充分混合成糊状。放置于事先准备好的37 ℃水浴中；

⑦将50%的PEG1500放在37 ℃生化培养箱中温育，吸取1 mL PEG1500，缓慢加入到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，（90 s内加完，缓慢加，边加边缓慢搅拌，让底部细胞全部悬起来，不要吹打），水浴静置90 s，计时以10 s为界；

⑧从CO₂培养箱取出温育至37 ℃的50Ml的RPMI-1640基础培养液，在5 min内滴加10 mL培养基稀释PEG。用移液枪沿壁缓缓加到融合细胞上，边加边轻轻搅拌，使细胞团块分散；

⑨加入方法：前2min各加1mL，第3、4min加1.5 min，第5min加5 mL。计时以10s为界，一般要先慢后快。沿管壁补加40 mL基础培养基，拧紧盖，吹起沉淀，使细胞混匀。800rpm/ min离心6 min；

⑩弃上清，用10 mL含饲养细胞的RPMI-1640不完全培养基轻轻重悬混匀。滴96孔板，2滴/孔。37 ℃的CO₂培养箱培养；

⑪融合后每天检查细胞生长情况及是否有污染。当融合细胞形成细胞团后，取培养上清进行筛选。

（3）筛选和克隆

筛选：融合后，待杂交瘤细胞群长到96孔培养板的孔底面积1/3时开始检测，采用间接酶联免疫技术筛选阳性杂交瘤细胞。

第一次筛选：

①包被抗原：将纯化的G蛋白与M蛋白分别用碳酸盐包被液（pH 9.6）1:10稀释至10µg/mL，加入96孔酶标板中（50µl/孔），4℃包被过夜；

②吸出包被液，用含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤，每次5min，洗三次；

③每孔加入200µl 3%的牛血清白蛋白(PBS配)，37℃封闭1h；

④同②法洗涤三次；

⑤将杂交瘤细胞培养上清作为第一抗体按每孔50µl加入酶标板，37℃温箱孵育1h；

⑥同②法洗涤三次；

⑦碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠Ig（1:6000稀释）作为第二抗体按每孔50µl加入酶标板，37℃温箱孵育1h；

⑧同②法洗涤三次；然后每孔加入100µl 4-硝基酚磷酸盐（pNPP）应用液，暗处反应5-20min，每孔加入50µl 2M的NaOH，稳定3-5min即可用405nm工作波长测定OD值。以包被含pET-28a与pET-32a空载体的菌落表达的标签蛋白作为阴性对照，测波长为405nm时各孔光吸收值，计算各实验孔与阴性对照光吸收值之比（P/N），当P/N≥2.1时该孔为阳性。

第二次筛选：

①包被抗原：将超速离心浓缩纯化得到的病毒，以1 μg/孔的浓度，加入96孔酶标板中（50µl/孔），4℃包被过夜。加入1 mol/L的EDTA溶液处理，清除内源酶的影响；

②其余步骤同第一次筛选。

克隆：采用有限稀释法对检测出的阳性杂交瘤细胞进行克隆，步骤如下：

①脱颈椎处死小鼠，无菌取出胸腺，在200目网筛上研磨，用RPMI-1640溶液吹打形成单细胞悬液；

②把胸腺细胞悬液1000rpm离心3min，弃去上清液，胸腺细胞沉淀用10ml RPMI-1640(含10%胎牛血清)细胞培养液重悬；

③把要克隆的阳性细胞孔中的细胞用血球记数板记数，然后用培养液以10倍梯度稀释，取出100个杂交瘤细胞，放入胸腺细胞悬液中；

④细胞悬液用滴管吹打均匀，滴加到96孔培养板中，每孔100µl，平均每个孔含有一个杂交瘤细胞；

⑤放入CO₂培养箱中培养；

⑥两周后通过间接酶联免疫技术检测各孔杂交瘤细胞培养上清，把所得阳性克隆孔的杂交瘤细胞按上述方法再克隆一次，以保证形成单克隆。

（4）冻存

取生长旺盛，形态良好的杂交瘤细胞，制成细胞悬液，200g离心5min，去上清，加冻存液（9份RPMI-1640培养基＋1份二甲亚砜），使最终细胞密度为5×10⁶个/ml，将1ml细胞悬液装于2ml冻存管中，拧紧螺盖，然后将冻存管装入盛有棉花的小盒内，放于-80℃超低温冰箱内过夜（8-12小时）后，再浸入液氮内长期保存。获得的生长旺盛，形态良好的3株杂交瘤细胞，其中杂交瘤细胞株HIRRV-G-4D10可分泌抗牙鲆弹状病毒G蛋白单克隆抗体，而杂交瘤细胞株HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10可分泌抗牙鲆弹状病毒M蛋白的单克隆抗体。

3. 单抗的转印免疫印迹法鉴定

（1）十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳：

①将纯化的弹状病毒加入等比例含十二烷基磺酸钠的样品缓冲液，在沸水中煮3-5min；

②将①处理过的样品加入上样孔中，每孔内加样品10µl，在恒流条件下，起始时用低电流(30-40mA)，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，加大电流（50-70mA），电泳至溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳，取出凝胶；

③剪取一块与电泳凝胶相同大小的硝酸纤维素膜(孔径0.22µm)以电转移缓冲液（电转移缓冲液：25mmol/L Tris-Base，192mmol/L甘氨酸，20%甲醇，pH 8.3）润湿，放在电泳后的凝胶上。在硝酸纤维素膜上剪掉一个角，以标志样品顺序的起始端。用润湿的滤纸支持，将第二块润湿的滤纸贴在凝胶片的另一面；按上述放置顺序，使胶块与硝酸纤维素膜及滤纸形成一套夹心的"三明治"；

④将"凝胶三明治"置入盛有电转移缓冲液的电泳槽内，将硝酸纤维素膜面向阳极；电泳恒流200mA，通电5小时；

⑤转移完毕，取出硝酸纤维素膜。

（2）免疫印迹：

①将硝酸纤维素膜用PBS洗10分钟，然后置4%的牛血清白蛋白溶液（PBS配）中封闭1h，37 ℃；

②用PBST洗3次，每次5分钟；

③将硝酸纤维素膜置于杂交瘤细胞培养上清中作为第一抗体，37℃缓慢摇动1小时；以骨髓瘤细胞培养上清孵育硝酸纤维素膜作为阴性对照；

④同②法洗涤三次；

⑤将硝酸纤维素膜加入碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(1:6000稀释)中，37℃缓慢摇动1小时；

⑥同②法洗涤三次；

⑦把硝酸纤维素膜放入碱性磷酸酶发色液（NBT-BCIP发色液）中发色，直到颜色清晰为止；

⑧用去离子水洗涤，以终止反应。将硝酸纤维素膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。

结果表明：抗牙鲆弹状病毒G蛋白单抗HIRRV-G-4D10可与分子量为60 kDa牙鲆弹状病毒蛋白条带发生特异性反应；抗牙鲆弹状病毒M蛋白单抗能与分子量为22 kDa牙鲆弹状病毒蛋白条带发生特异性反应，而阴性对照无条带显色（如图2）。

4. 单抗的质谱分析

（1）从SDS-PAGE胶上切下转印免疫印迹实验中与抗体发生特异性反应的弹状病毒相应的蛋白质条带；

（2）将切下的蛋白条带通过ABI5800（Applied Biosystems）质谱仪进行质谱分析。

质谱分析结果显示：单克隆抗体HIRRV-G-4D10特异性识别的病毒蛋白条带为牙鲆弹状病毒G蛋白，而单克隆抗体HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10特异性识别的病毒蛋白条带为牙鲆弹状病毒M蛋白，结果证实研制的单克隆抗体HIRRV-G-4D10可特异性识别天然病毒的G蛋白（如图3），单克隆抗体HIRRV-M-1F9、HIRRV-M-4D10可特异性识别天然病毒的M蛋白（如图4）。

5. 本发明单抗的间接免疫荧光方法鉴定

（1）用病毒与细胞数量的比值为0.1的比例接种牙鲆弹状病毒，收集感染24h后的细胞，PBS洗涤一次。

（2）把细胞悬液滴在干净的载玻片上，滴30µl，自然风干。放入丙酮中固定15min，PBS洗涤一次。

（3）将载玻片用3%的牛血清白蛋白(PBS配)封闭，37℃孵育1h；

（4）以杂交瘤上清（杂交瘤培养液）为第一抗体， 37℃湿盒中孵育1h；

（5）取出载玻片，用0.01M PBS洗三次，每次5min；

（6）以异硫氰酸荧光素标记的羊抗小鼠抗体为第二抗体，加在细胞样品上，37℃湿盒中孵育45min同（5）法洗三次；

（7）用1%的4',6-二脒基-2-苯基吲哚溶液染核，同（5）法洗三次。

（8）在盖玻片上滴加一滴抗荧光衰减淬灭剂，将细胞爬片倒扣在载玻片上，倒置荧光显微镜下观察是否出现了荧光信号。

结果显示：单抗HIRRV-G-4D10、HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10均能与感染牙鲆弹状病毒的EPC细胞发生特异性结合，呈现荧光阳性信号，而未感染牙鲆弹状病毒的EPC细胞中则没有观察到荧光信号。说明单克隆抗体HIRRV-G-4D10、HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10均可特异性识别在EPC细胞中增殖的HIRRV病毒粒子（如图5、图6）。

6. 抗牙鲆弹状病毒G蛋白单克隆抗体病毒中和活性的测定

（1）在96孔板中培养EPC细胞，生长至90％。

（2）将杂交瘤细胞培养上清液（单抗HIRRV-G-4D10）分别与等体积（50μL）含有100TCID₅₀/孔的牙鲆弹状病毒稀释剂混合，在20 ℃条件下，孵育2小时。

（3）将孵育后的病毒与单抗混合物加到EPC单层细胞上，孵育1小时。

（4）除去接种物并加入含有2％FBS的M199培养基，以骨髓瘤细胞培养上清孵育牙鲆弹状病毒设为对照组，实验重复三次。

（6）在感染后1，2，3，4和5天，通过显微镜每天观察细胞的状态。在拍摄细胞病变情况时，细胞以含4％多聚甲醛的PBS在室温下固定1小时，用0.1％结晶紫染色。

结果发现，单抗HIRRV-G-4D10与HIRRV孵育感染EPC细胞，可明显延缓EPC细胞的病变进程，相同时间点细胞病变程度显著低于对照组，表明单抗HIRRV-G-4D10具有明显的HIRRV中和活性，但不能完全中和HIRRV对EPC的感染（如图7）。将分泌具有HIRRV中和活性单克隆抗体的杂交瘤细胞株送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，其名称为：杂交瘤细胞株HIRRV-G-4D10，保藏号为：CCTCC NO：C201869，保藏日期为：2018年3月29日。

实施例2：牙鲆弹状病毒快速检测试纸的制备：

1. 单抗HIRRV-G-4D10、10HIRRV-M-1F9、HIRRV-M-4D10的复苏、传代，腹腔注射8、12周龄BALB/C小鼠无菌液体石蜡，每只小鼠注射0.3mL。一周后，用RPMI 1640将培养的杂交瘤细胞从细胞培养板上轻轻吹洗下来，收集至10mL无菌离心管中，1000rpm离心3min，用适量RPMI 1640将细胞沉淀轻轻重悬混匀，每只小鼠腹腔注射0.5mL杂交瘤细胞液。密切观察小鼠状态，7、10天后小鼠腹部明显膨大，收集腹水于无菌离心管中。

2. 腹水的纯化：按照每毫升腹水加入33ul的正辛酸，吸取适量的正辛酸，一滴一滴地缓慢的滴加。搅拌30 min后，可以看到有白色沉淀出现。将其放置在4℃冰箱过夜，第二天用离心机以12 000 r/min、离心30 min，取上清。上清用0.45um滤膜进行过滤，加入1/10体积的含0.2 mmol/LEDTA的10×PBS（200 mL的10×PBS加入0.015gEDTA）。用1mol/L的NaOH调节pH值至7.4。在4℃的冰浴条件下，边搅拌边缓慢地向每毫升液体中加入0.258 g的硫酸铵粉末，持续搅拌30 min，液体中会不断地产生沉淀，然后静置2 h。用离心机在4℃条件下以12000 r/min、离心30 min，按每毫升腹水加200uLPBS，使离下的沉淀溶于相对应的PBS中。将溶液倒入透析袋中，放于4℃冰箱，在超纯水中进行透析，每隔4h更换一次透析液，大约更换3-4次。将透析好的溶液放在冻干机中进行冻干，变成粉末后，溶于超纯水。SDS-PAGE检测抗体的纯度。

3. 金标抗体的制备：

（1）胶体金的制备：先用自来水把制备胶体金玻璃器皿上的灰尘冲洗干净，晾干，然后浸入重铬酸钾洗液中浸泡 24 h，自来水冲洗 3～5 次，洗掉洗液。依次用去离子水、超纯水分别洗 3～5 次，烘干备用。取0.01%氯金酸溶液100mL，放入微波炉中，高档火沸腾2min，迅速一次性加入一定量的1%柠檬酸三钠溶液，放入微波炉中，中低档火继续加热3min，冷却至室温补足失水，制成颗粒大小为20-30nm的胶体金。用0.1mol/L碳酸钾溶液调节pH值为8.2，4℃保存。

（2）金标抗体的制备：取胶体金按合适的比例加入单抗HIRRV-G-4D10，缓慢搅动30min后，再向其中加入BSA至终浓度为1%，继续搅拌20min。经3000rp，4℃离心20min，去除沉淀取上清液，再将上清液经13500rpm，4℃离心30min，弃去上清液得沉淀，沉淀用金标抗体洗涤液（含1%BSA的0.01mol/LPBS，pH7.4）洗涤，离心，吸去上清液得到的沉淀即为金标单抗A。将沉淀悬浮于金标抗体保存液（含1%蔗糖，1%BSA，0.1%Tween-20和0.02%叠氮钠的0.01mol/L PBS，pH7.4）中，4℃保存。

4. 金标垫3的制备：将金标单抗液体均匀喷涂到玻璃纤维上，冷冻干燥。

5. 硝酸纤维素膜检测层4的制备：将单抗HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10按照2:1的浓度比用0.01mol/LpH7.4PBS调整为1mg/ml，用喷膜仪将其喷涂于硝酸纤维素膜检测层4上，作为检测线6。同样将羊抗小鼠 IgG的浓度调整为500μg/ml，将其喷涂于硝酸纤维素膜检测层4上作为质控线7，两线相距5mm，质控线7靠近吸水垫5，检测线6靠近样品垫2，37 ℃干燥；3% BSA 的 PBS 中 37 ℃封闭 1 h，PBST 洗涤 3 次，每次 5 min，37 ℃干燥；4 ℃密封干燥保存。

6. 本发明的牙鲆弹状病毒检测试纸的制作

组装时戴上手套，撕下载体板上的不干胶封条，在载体板1的一侧顺次粘贴上硝酸纤维素膜检测层4、金标垫3、样品垫2和吸水垫5，组装成试纸板。在试纸板的样品垫2和金标垫3表面贴上彩色不干胶纸。其中硝酸纤维素膜检测层4的上边缘重叠在吸水垫5下边缘之下，硝酸纤维素膜检测层4下边缘重叠在金标垫3上边缘之下，样品垫2的上边缘重叠在金标垫3下边缘之上（如图8）。将贴有不干胶纸的试纸板放入切条机槽内切割成3mm宽的试纸，将切好的试纸放入装有干燥剂的铝箔袋内封口，即成本发明试纸。

实施例3：牙鲆弹状病毒检测试纸的使用方法

（1）检测样品的制备：取待检牙鲆组织肝、脾、肾、心脏等，按1:10（W/V）与缓冲液混合，加入适量石英砂用研钵研磨，7000-8000rpm冰浴匀浆，取上清液作为检测样品。

（2）牙鲆弹状病毒检测试纸的使用：将试纸平放在桌面上，在样品孔滴加待测样品，5-10min观察结果。

（3）结果判断：

①阳性结果：硝酸纤维素膜检测层4检测线6与质控线7均出现红色条带，证明所检测的样品已被HIRRV感染；

②阴性结果：硝酸纤维素膜检测层4检测线6未出现红色条带，质控线7出现红色条带，证明未被HIRRV感染；

③无效结果：硝酸纤维素膜检测层4检测线6与质控线7均未出现红色条带，表示操作出现问题或者试纸条已失效（如图9）。

试纸条显色结果可以看出，牙鲆肝（1-5）与心脏（16-20）在第四天能够检测出HIRRV阳性；脾（6-10）与肾（11-15）在第三天检测到HIRRV阳性；随着感染时间的增加，显色有所加深（如图10）。

实施例4：牙鲆HIRRV快速检测试纸的特异性、灵敏度、重复性、稳定性测试：

1. 特异性

选择2组样品，第一组样品：传染性造血器官坏死病病毒提取液。第二组样品：病毒性出血败血症病毒提取液。用试纸条检测以上2组样品，检测结果显示，第一、二组样品均为阴性（如图11 Ⅵ、Ⅶ）。

2. 灵敏度

将牙鲆弹状病毒提取液用PBS进行梯度稀释（1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³（copies/μL）），用试纸条进行检测。检测结果显示，稀释度为（1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴（copies/μL）)的牙鲆弹状病毒能够使试纸条的检测线和质控线处均出现红线，结果为阳性。稀释度为1×10³（copies/μL）的牙鲆弹状病毒只有质控线显色，结果为阴性（如图11 Ⅰ-Ⅳ）。

3. 重复性

用不同批次的试纸检测以上4组样品，每个批次试纸重复检测6次，结果无明显差异。

4. 稳定性

将试纸放入室温与4℃下，每15天用试纸检测以上4组样品一次。结果：室温下保存时有效期：6个月，4℃下保存时有效期为12个月。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种牙鲆弹状病毒检测试纸，包括载体板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜检测层、吸水垫，所述样品垫和吸水垫分别位于载体板的两端，硝酸纤维素膜检测层位于所述载体板的中部，所述金标垫一端位于样品垫的下方，另一端位于硝酸纤维素膜检测层的上方，其特征在于所述金标垫上载有胶体金标记的抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体HIRRV-G-4D10，所述硝酸纤维素膜检测层上依次喷涂有检测线和质控线，所述检测线靠近样品垫侧，质控线靠近吸水垫侧；所述检测线包被抗牙鲆弹状病毒M蛋白的单克隆抗体HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10的混合单克隆抗体，质控线包被羊抗小鼠IgG，所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体HIRRV-G-4D10由保藏号为CCTCC NO：C201869的杂交瘤细胞株分泌；所述单克隆抗体HIRRV-G-4D10、HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10是通过以下方法制备的：利用Trizol法提取牙鲆弹状病毒总RNA逆转录后获得cDNA，以cDNA产物为模板，PCR扩增G基因的61-1524 nt片段与M蛋白基因全长，分别连接pET-28a、pET-32a载体构建重组表达质粒pET-28a-G与pET-32a-M，将其导入感受态大肠杆菌后经诱导表达、亲和层析纯化获得重组G蛋白与M蛋白，以亲和纯化的重组G蛋白与M蛋白作为抗原免疫Balb/c小白鼠，采用细胞融合法制备杂交瘤细胞，利用免疫学检测筛选方法，筛选出分泌抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株HIRRV-G-4D10与抗牙鲆弹状病毒M蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10，采用常规方法扩大培养所得到的杂交瘤细胞株，腹腔注射BALB/c小鼠取腹水，采用辛酸-硫酸铵法进行纯化获得抗HIRRV的三种单克隆抗体。

2.如权利要求1所述的牙鲆弹状病毒检测试纸，其特征在于所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体HIRRV-G-4D10能与分子量为60 kDa牙鲆弹状病毒蛋白条带发生特异性反应。

3.如权利要求1所述的牙鲆弹状病毒检测试纸，其特征在于所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体HIRRV-G-4D10具有牙鲆弹状病毒中和活性。

4.一种制备如权利要求1所述的牙鲆弹状病毒检测试纸的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）单克隆抗体HIRRV-G-4D10、HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10的制备：

利用Trizol法提取牙鲆弹状病毒总RNA逆转录后获得cDNA，以cDNA产物为模板，PCR扩增G基因的61-1524 nt片段与M蛋白基因全长，分别连接pET-28a、pET-32a载体构建重组表达质粒pET-28a-G与pET-32a-M，将其导入感受态大肠杆菌后经诱导表达、亲和层析纯化获得重组G蛋白与M蛋白，以亲和纯化的重组G蛋白与M蛋白作为抗原免疫Balb/c小白鼠，采用细胞融合法制备杂交瘤细胞，利用免疫学检测筛选方法，筛选出分泌抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株HIRRV-G-4D10与抗牙鲆弹状病毒M蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10，采用常规方法扩大培养所得到的杂交瘤细胞株，腹腔注射BALB/c小鼠取腹水，采用辛酸-硫酸铵法进行纯化获得抗HIRRV的三种单克隆抗体；所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体HIRRV-G-4D10由保藏号为CCTCC NO：C201869的杂交瘤细胞分泌；

（2）金标垫的制备：

① 胶体金与金标抗体的制备：

采用微波炉-柠檬酸三钠还原法制得颗粒大小为20-30nm的胶体金，用0.1mol/L碳酸钾溶液调节胶体金pH值为8.2，将抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体HIRRV-G-4D10按照18μg/ml加入胶体金中，再加入稳定剂5%的BSA经离心纯化后用金标保存液悬起，即为金标单克隆抗体液体；

② 载有金标单克隆抗体的金标垫的制备：

将制成的金标单克隆抗体液体喷涂到玻璃纤维上，冷冻干燥；

（3）硝酸纤维素膜检测层的制备：

将调整好浓度的抗牙鲆弹状病毒M蛋白的单克隆抗体HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10的混合单克隆抗体和羊抗小鼠IgG喷涂于硝酸纤维素膜检测层上，分别作为检测线和质控线，晾干后封闭液中浸泡，37℃烘干备用；

（4）牙鲆弹状病毒检测试纸的制作：

在载体板上依次贴上硝酸纤维素膜检测层、吸水垫、金标垫和样品垫，进行切条，即成牙鲆弹状病毒检测试纸。

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