CN101323884A - 一种牙鲆弹状病毒的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水产动物病原的检测与诊断技术领域的一种牙鲆弹状病毒的检测方法，采用实时定量逆转录－聚合酶链式反应技术检测鱼类牙鲆弹状病毒，先设计特异性引物序列和荧光探针序列，然后提取待测样品的核酸；再进行实时定量逆转录－聚合酶链式反应，同时利用体外转录含有目的扩增片段的核糖核酸作为标准品绘制标准曲线；最后根据仪器软件计算得到的待测样品的循环阀值判定待测样品中是否含有牙鲆弹状病毒并进行定量；本发明可广泛应用于牙鲆、鲈鱼、大菱鲆、真鲷等养殖场的疫病监控及进出口贸易中牙鲆弹状病毒的检测，与现有技术相比，具有检测快速、效率高、定量准确、特异性强、检测范围广、灵敏度高等特点。
Description
技术领域：
本发明属于水产动物病原的检测与诊断技术领域，涉及一种牙鲆弹状病毒的检测方法，特别是一种采用实时定量逆转录-聚合酶链式反应(简称RT-PCR)技术检测鱼类牙鲆弹状病毒的方法。
背景技术：
牙鲆弹状病毒(Hirame rhabdovirus，简称HRV)病毒粒子呈枪弹形，大小为80nm×160-180nm，1986年日本首次报道。我国黄海、渤海近岸等地养殖的牙鲆已被发现有此病症。发病季节为冬季和早春，鱼体发病时，水温一般都在15℃以下。本病主要危害牙鲆，人工感染对真鲷、黑鲷有强烈的致病性，从香鱼和无备平鮋中也分离到此病毒，对虹鳟也有致病作用。幼苗期和仔鱼期的鱼体易患此病。感染牙鲆弹状病毒的病鱼体表和鳍充血或出血，腹部膨胀，内有腹水。解剖鱼体，肌肉、肠黏膜的固有层出血，生殖腺的结缔组织充血或出血。
中国国家质量监督检验检疫总局与韩国海洋水产部于2005年发布的《中韩进出口活水生动物检验检疫协议》中规定，我国出口到韩国的鲈鱼、真鲷、大菱鲆、牙鲆等鱼类必须进行牙鲆弹状病毒的检验检疫。因此，迫切需要建立快速、灵敏、准确的牙鲆弹状病毒的检测方法，打破国外技术壁垒，为国家贸易服务。目前鱼类病毒的检测方法主要包括细胞学诊断技术、免疫学诊断技术、分子生物学诊断技术三大类：细胞学诊断技术主要包括采用细胞培养分离病毒、组织病理切片及电镜观察，其操作繁琐，检测周期长，且灵敏度低；免疫学诊断技术主要包括免疫荧光检测、免疫点杂交，其方法具有特异性强、敏感性高的优点，但方法相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测；分子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)，比较快速、灵敏，但是需要琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色观察结果，溴化乙锭是致癌物，对人体和环境有危害，并且交叉污染问题比较严重；另外PCR只能进行定性检测，不能对病毒进行定量检测。
现有的牙鲆弹状病毒检测方法一般采用细胞学诊断方法，而实时定量PCR技术目前已被广泛应用于检测水产动物病原，如细菌(对虾弧菌、贝副溶血弧菌)、对虾病毒(对虾白斑综合症病毒、涛拉综合征病毒、黄头病毒)、鱼类病毒(传染性造血器官坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、传染性胰脏坏死病毒、真鲷虹彩病毒)等，据检索，目前尚未见采用实时定量RT-PCR技术检测牙鲆弹状病毒的报道。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术中的缺点，寻求提供一种利用荧光探针定量检测牙鲆弹状病毒的灵敏度高，特异性好，定量快速准确的方法，为国内水产养殖业和国际鱼类贸易的可持续健康发展提供技术支撑。
为了实现上述目的，本发明的主要原理是采用荧光探针法实时定量PCR技术，在反应体系中包括一对PCR引物和一条荧光探针；荧光探针可以与模板特异性地结合，结合位点在两条引物之间，荧光探针的5′端标记有荧光报告基团(R)，3′端标记有荧光淬灭基团(Q)。当探针完整的时候，报告基团所发射的能量由于荧光共振能量转移(FRET)而被淬灭基团吸收，因此反应体系中检测不到荧光信号；在PCR反应过程中，引物和探针都与模板结合，Taq酶发挥5’-3’外切核酸酶活性，将荧光探针切断从而使荧光报告基团远离淬灭基团，因此产生仪器可以检测到的荧光信号；随着PCR循环次数的增加，释放出来的荧光信号不断增加，荧光信号强度与扩增产物的数量呈正比关系，仪器记录荧光信号强度，最终计算出循环阈值(简称Ct值)；Ct值是指荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，Ct值与模板的初始拷贝数成反比，初始拷贝数越多，Ct值越小；利用已知拷贝数的标准品制备出标准曲线，再根据样品的Ct值对样品中的牙鲆弹状病毒进行定量检测。
本发明的技术方案是先设计特异性引物序列和荧光探针序列，然后提取待测样品的核酸；再进行实时定量逆转录-聚合酶链式反应，同时利用体外转录含有目的扩增片段的核糖核酸(简称RNA)作为标准品绘制标准曲线；最后根据仪器软件计算得到的待测样品的循环阀值判定待测样品中是否含有牙鲆弹状病毒并进行定量。
本发明所述的设计特异性引物序列和荧光探针序列是：选取牙鲆弹状病毒的糖蛋白(Glyprotein)基因保守序列，利用已有的Primer Express 2.0软件设计特异性引物和荧光探针序列为：
正向引物：5′-ACCGCCAAGAGTGTCCTTAGAG-3′
反向引物：5′-TGGAGCACTTCCCTTCAATAAAA-3′
荧光探针：5′-FAM-TCCTTACACCCTGGGATTCCTTGATTCTG-TAMRA-3′。
荧光探针的5′端标记荧光报告基团6-羧基荧光素(6-Carboxyfluorescein，FAM)，3′端标记荧光淬灭基团6-羧基四甲基罗丹明(6-Carboxytetramethylrhodamine，简称TAMRA)，扩增片断长度为76bp。
本发明所述的提取待测样品的核酸是：采用传统的TRIZOL法或者商业化的RNA提取试剂盒提取待测样品的RNA之后用核酸分析仪进行OD260/OD280检测。
本发明所述的进行实时定量RT-PCR反应是：在PCR反应管中加入待测样品的核酸、实时定量RT-PCR反应液，正向引物、反向引物、荧光探针，补充水至25μL；反应程序为：48℃-52℃反应30-60min；95℃反应10min；之后95℃反应15sec-30sec，57℃-63℃再反应30sec-1min；进行40个循环；其中，实时定量RT-PCR反应体系中各组分构成比例为：12.5μL2×实时定量RT-PCR反应液，10μmol/L正向引物1-2μL、10μmol/L反向引物1-2μL，10μmol/L的荧光探针0.5-1μL，100ng/μL-200ng/μL待测样品的RNA1-5μL，补充双蒸水至25μL。
本发明所述的利用体外转录含有目的扩增片段的RNA作为标准品绘制标准曲线是：先将PCR产物电泳后切下含有目的片段的凝胶，用凝胶纯化试剂盒纯化，与pGEM-T载体4℃过夜连接，转化感受态细胞，转化产物涂平板培养，挑取白斑PCR产物鉴定阳性后测序，根据测序结果将筛选的阳性克隆接种到含氨苄青霉素的溶菌肉汤培养基，过夜培养，制备质粒脱氧核糖核酸纯化后，经过NcoI酶切后，利用T7启动子体外转录制备RNA模板，乙醇沉淀后于紫外分光光度计测定OD260定量，并梯度稀释，为1×107-1×101拷贝/μL；将梯度稀释的标准品进行实时定量RT-PCR反应；定量PCR仪器计算Ct值，根据标准品的浓度和Ct值，由仪器软件自动绘制出标准曲线。
本发明所述的根据仪器软件得到的待测样品的Ct值判定待测样品中是否含有牙鲆弹状病毒并进行定量是：利用实时定量PCR仪器收集荧光信号，再利用仪器软件处理数据，得到待测样品的循环阈值；当待测样品的Ct值≤35.0时，判定待测样品中含有牙鲆弹状病毒，其病毒含量通过Ct值和标准曲线由定量PCR仪器软件自动计算，否则判定待测样品中不含有牙鲆弹状病毒。
本发明适用于对牙鲆弹状病毒进行快速检测，可广泛应用于鱼类特别是牙鲆、鲈鱼、大菱鲆、真鲷等养殖场的疫病监控及进出口贸易中牙鲆弹状病毒的检测。与现有技术相比，本发明的有益效果包括：一是检测快速、效率高：采用一步法实时定量RT-PCR反应，即反转录(RT)和聚合酶链反应(PCR)在同一管中进行，大大减少交叉污染和加样误差，并节约了时间；该检测方法在反应结束后，可立即通过仪器软件进行结果判定，不需要琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色观察结果，减少了环境污染和样品交叉污染，从核酸提取到结果判定仅需要4小时；一次可以进行96个样品的检测，具有高效性。二是可实现准确定量：通过体外转录制备RNA作为标准品，可以对逆转录和PCR扩增同时进行对照，这样建立的标准曲线更直接、准确；再通过样品的Ct值，可以对待测样品中的牙鲆弹状病毒进行定量，准确度高，做到了真正意义上的定量检测。三是特异性强：特异性引物和荧光探针只与牙鲆弹状病毒特异性地结合，与弹状病毒科的其他病毒都没有交叉反应。四是检测范围广，灵敏度高：在标准品浓度为1×107-102拷贝之间，都有扩增反应，检测范围可达6个数量级；检测限达100个RNA拷贝，灵敏度高。
具体实施方式：
下面通过具体实施例作进一步阐述。
实施例1：以患病牙鲆样品为例对牙鲆弹状病毒进行定量检测。
五尾牙鲆样品采自黄海岸某养殖场，具有感染牙鲆弹状病毒的典型临床症状，体表和鳍充血或出血，腹部膨胀，内有腹水。解剖鱼体，肌肉、肠黏膜的固有层出血，生殖腺的结缔组织充血或出血。
本实施例具体检测步骤包括：
(1)设计特异性引物序列和荧光探针序列：
在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/中搜索牙鲆弹状病毒的序列，利用已有的DNALASERGENE 7.1软件分析比较各个基因序列的保守性，结果表明牙鲆弹状病毒的糖蛋白基因序列比较保守；因此，以糖蛋白基因为目标基因，利用Primer Express2.0软件设计特异性引物序列和荧光探针序列；设计的引物其退火温度(简称Tm)值在57℃-63℃之间，不具有二级结构，两条引物的Tm值相差2℃以内，且不形成引物二聚体；荧光探针的Tm值比引物高8℃-10℃；特异性引物包括正向引物和反向引物，荧光探针为Taqman探针，设计的实时定量RT-PCR的特异性引物序列和荧光探针序列如下：
正向引物：5′-ACCGCCAAGAGTGTCCTTAGAG-3′
反向引物：5′-TGGAGCACTTCCCTTCAATAAAA-3′
荧光探针：5′-FAM-TCCTTACACCCTGGGATTCCTTGATTCTG-TAMRA-3′。
扩增片断长度为76bp。
设计好特异性引物序列和荧光探针序列后，通过TAKARA商业公司，采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行特异性引物和荧光探针的合成与荧光标记；荧光探针的5′端标记荧光报告基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA。
(2)提取待测样品的核酸：
解剖牙鲆，取脑、肾、脾等组织进行匀浆，采用RNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST ViralRNA/DNA Extraction Kit Ver 3.0)，按照说明书进行RNA的提取，之后用核酸分析仪进行检测，结果表明样品核酸的OD260/OD280在1.8-2.0之间，调整RNA浓度为100ng/μL。
(3)进行实时定量RT-PCR反应：
在PCR反应管中加入1μL待测样品RNA，12.5μL 2×实时定量RT-PCR反应液，10μmol/L正向引物1μL、10μmol/L反向引物1μL，，10μmol/L荧光探针1μL，补充水至25μL；采用美国产的ABI 7900HT型定量PCR仪器进行反应，实时定量RT-PCR反应程序为：48℃反应40min；95℃反应10min；之后95℃反应15sec，58℃再反应40sec并进行40个循环。
(4)制备含有目的扩增片段的体外转录RNA作为标准品以绘制标准曲线：
按照常规分子克隆操作方法，首先PCR产物电泳后切下含有目的片段的凝胶，用TAKARA公司的凝胶纯化试剂盒纯化，与pGEM-T载体4℃过夜连接，转化感受态细胞，转化产物涂平板培养，挑取白斑PCR产物鉴定阳性后送TAKARA公司测序，根据测序结果将筛选的阳性克隆接种到含氨苄青霉素的LB培养基过夜培养，制备质粒DNA纯化后，经过NcoI酶切后，利用T7启动子体外转录制备RNA模板，乙醇沉淀后于核酸分析仪测定OD260定量。
将标准品进行10倍系列稀释，分别得到浓度为1×107、1×106、1.5×105、1×104、1×103、1.×102拷贝/μL的标准品；以各个浓度的标准品为模板，进行实时定量RT-PCR反应，每个浓度做2个平行样；实时定量RT-PCR反应体系和反应程序与牙鲆样品的相同，只是将待测样品RNA替换为标准品；ABI7900HT型定量PCR仪器在反应过程中自动收集荧光信号，反应结束后，利用仪器自带的SDS2.1软件进行数据分析，得到Ct值，见表1。
表1标准品的浓度及Ct值
| 样品名称 | 样品类型 | 循环阈值(Ct) | 设定浓度(拷贝) |
| 标准品1-1 | 标准品 | 17.09322 | 1×107 |
| 标准品1-2 | 标准品 | 17.08698 | 1×107 |
| 标准品2-1 | 标准品 | 20.60087 | 1×106 |
| 标准品2-2 | 标准品 | 20.43348 | 1×106 |
| 标准品3-2 | 标准品 | 24.00242 | 1×105 |
| 标准品3-2 | 标准品 | 24.04337 | 1×105 |
| 标准品4-4 | 标准品 | 27.62923 | 1×104 |
| 标准品4-2 | 标准品 | 27.62998 | 1×104 |
| 标准品5-1 | 标准品 | 31.4509 | 1×103 |
| 标准品5-2 | 标准品 | 30.97895 | 1×103 |
| 标准品6-1 | 标准品 | 34.44735 | 1×102 |
| 标准品6-2 | 标准品 | 34.14649 | 1×102 |
上述结果表明，反应体系中标准品为1×107-1×102个拷贝，6个数量级的范围内都有反应，表明该实时定量RT-PCR检测方法检测浓度范围广，灵敏度高。
根据标准品拷贝数与Ct值的关系，定量PCR仪器的SDS 2.1分析软件自动绘制出标准曲线：Ct＝-3.471gX+41.44，相关系数R2＝0.9918，即为RNA浓度(X)与Ct值的线性关系。
(5)根据待测样品的Ct值判定待测样品中牙鲆弹状病毒的含量并进行定量：
标准品浓度最低为100个拷贝，对应的Ct值约为34.85，因此建立检测的判定标准为：以Ct值＝35作为临界值，若待测样品的Ct值≤35.0，则判定样品中含有牙鲆弹状病毒，并根据其Ct值标准曲线进行定量；若待测样品的Ct值＞35.0，则判定样品中不含有牙鲆弹状病毒。
经实时定量RT-PCR检测，五尾牙鲆待测样品的Ct值都小于35.0，表明样品都含有牙鲆弹状病毒；根据待测样品的Ct值，利用标准曲线，定量计算出牙鲆样品的牙鲆弹状病毒拷贝数，见表2。
表2五尾牙鲆样品的牙鲆弹状病毒的定量PCR检测结果
| 样品名称 | 样品类型 | 循坏阈值(Ct) | 牙鲆弹状病毒量(拷贝) |
| 牙鲆1 | 待测样品 | 17.09322 | 4.163897×106 |
| 牙鲆2 | 待测样品 | 17.08698 | 7.56×102 |
| 牙鲆3 | 待测样品 | 20.60087 | 7.3620×104 |
| 牙鲆4 | 待测样品 | 20.43348 | 4.569×103 |
| 牙鲆5 | 待测样品 | 24.00242 | 2.1732×104 |
实施例2：分析外观健康的真鲷是否感染牙鲆弹状病毒。
真鲷样品采自黄海南边岸某养殖场，共六尾，外观正常，无牙鲆弹状病毒的症状，检测体内是否携带牙鲆弹状病毒。
(1)本实施例的设计特异性引物序列和荧光探针序列：同实施例1。
(2)本实施例的提取待测样品的核酸：
采用传统的TRIZOL法进行核酸的提取。解剖真鲷，取脑、肾、脾等组织进行匀浆，加入600μL裂解液，颠倒混匀，再加入200μL氯仿，混匀器上震荡混匀5sec。于4℃12000rpm离心15min。吸取上清液500μL，加入400μL异丙醇，-20℃放置30分钟。12000rpm离心15min，倒去上清；然后加入600μL75％乙醇，洗涤沉淀，于12000rpm离心5min，轻轻倒去上清。将RNA沉淀室温干燥3min后，加入20μL水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA。2000rpm离心5sec，在冰上保存备用。之后用核酸分析仪进行检测，结果表明样品核酸的OD260/OD280在1.8-2.0之间，调整RNA浓度为100ng/μL。
(3)本实施例进行实时定量RT-PCR反应：
在PCR反应管中加入1μL待测样品RNA，12.5μL2×实时定量RT-PCR反应液，10μmol/L正向引物1.5μL，10μmol/L反向引物1.5μL，10μmol/L荧光探针0.5μL，补充水至25μL。采用德国产的EPPENDORF型定量PCR仪器进行反应，实时定量RT-PCR反应程序为：48℃反应40min；95℃反应10min；之后95℃反应20sec，58℃再反应50sec进行40个循环。
(4)本实施例制备含有目的扩增片段的体外转录RNA作为标准品以绘制标准曲线：同实施例1。
(5)根据仪器软件得到的待测样品的Ct值来判定待测样品中的牙鲆弹状病毒并定量：
经实时定量RT-PCR检测，仪器给定的六尾真鲷样品的Ct值都大于35.0，判定外观正常的真鲷样品都不含有牙鲆弹状病毒。
Claims (6)
1、一种牙鲆弹状病毒的检测方法，其特征在于先设计特异性引物序列和荧光探针序列，然后提取待测样品的核酸；再进行实时定量逆转录一聚合酶链式反应，同时利用体外转录含有目的扩增片段的核糖核酸作为标准品绘制标准曲线；最后根据计算得到的待测样品的循环阀值判定待测样品中是否含有牙鲆弹状病毒并进行定量。
2、根据权利要求1所述的牙鲆弹状病毒的检测方法，其特征在于所述的设计特异性引物序列和荧光探针序列是：选取牙鲆弹状病毒的糖蛋白基因保守序列，利用已有的软件设计特异性引物和荧光探针序列为：
正向引物：5′-ACCGCCAAGAGTGTCCTTAGAG-3′
反向引物：5′-TGGAGCACTTCCCTTCAATAAAA-3′
荧光探针：5′-FAM-TCCTTACACCCTGGGATTCCTTGATTCTG-TAMRA-3′。
荧光探针的5′端标记荧光报告基团6-羧基荧光素，3′端标记荧光淬灭基团6-羧基四甲基罗丹明，扩增片断长度为76bp。
3、根据权利要求1所述的牙鲆弹状病毒的检测方法，其特征在于所述的提取待测样品的核酸是：采用传统的TRIZOL法或者商业化的RNA提取试剂盒提取待测样品的RNA之后用核酸分析仪进行OD260/OD280检测。
4、根据权利要求1所述的牙鲆弹状病毒的检测方法，其特征在于所述的进行实时定量RT-PCR反应是：在PCR反应管中加入待测样品的核酸、实时定量RT-PCR反应液，正向引物、反向引物、荧光探针，补充水至25μL；反应程序为：48℃-52℃反应30-60min；95℃反应10min；之后95℃反应15sec-30sec，57℃-63℃再反应30sec-1min；进行40个循环；其中，实时定量RT-PCR反应体系中各组分构成比例为：12.5μL2×实时定量RT-PCR反应液，10μmol/L正向引物1-2μL、10μmol/L反向引物1-2μL，10μmol/L的荧光探针0.5-1μL，100ng/μL-200ng/μL待测样品的RNA 1-5μL，补充双蒸水至25μL。
5、根据权利要求1所述的牙鲆弹状病毒的检测方法，其特征在于所述的利用体外转录含有目的扩增片段的RNA作为标准品绘制标准曲线是：先将PCR产物电泳后切下含有目的片段的凝胶，用凝胶纯化试剂盒纯化，与pGEM-T载体4℃过夜连接，转化感受态细胞，转化产物涂平板培养，挑取白斑PCR产物鉴定阳性后测序，根据测序结果将筛选的阳性克隆接种到含氨苄青霉素的溶菌肉汤培养基，过夜培养，制备质粒脱氧核糖核酸纯化后，经过Nco I酶切后，利用T7启动子体外转录制备RNA模板，乙醇沉淀后于紫外分光光度计测定OD260定量，并梯度稀释，为1×107-1×101拷贝/μL；将梯度稀释的标准品进行实时定量RT-PCR反应；定量PCR仪器计算Ct值，根据标准品的浓度和Ct值，由仪器软件自动绘制出标准曲线。
6、根据权利要求1所述的牙鲆弹状病毒的检测方法，其特征在于所述的根据仪器软件得到的待测样品的Ct值判定待测样品中是否含有牙鲆弹状病毒并进行定量是：利用实时定量PCR仪器收集荧光信号，再利用仪器软件处理数据，得到待测样品的循环阈值；当待测样品的Ct值≤35.0时，判定待测样品中含有牙鲆弹状病毒，其病毒含量通过Ct值和标准曲线由定量PCR仪器软件自动计算；当Ct值＞35.0时，判定待测样品中不含有牙鲆弹状病毒。
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