CN113337626B - 检测对虾vpahpnd急性菌株和亚急性菌株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测对虾VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的方法，属于病原检测技术领域。本发明针对VPAHPND毒力因子PirA和PirB设计引物，并利用该引物进行多重PCR扩增，并且引物具有特异性强和灵敏度高的特点；通过该引物构建的多重PCR方法操作简单且便于实施，该方法能够实现对于对虾VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的准确鉴别，利于对不同对虾养殖场鉴别AHPND做出技术指导，以便于及时针对性的对AHPND进行防控和治疗。
Description
技术领域
本发明涉及病原检测技术领域，涉及一种检测对虾VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的方法。
背景技术
对虾急性肝胰腺坏死综合症是近年来影响对虾养殖最为严重的疾病之一。早期该病主要发生于对虾苗期，统称为早期死亡综合症(Early mortality syndrome，EMS)。该病的肝胰腺坏死症状与对虾其它早期死亡症状存在明显不同，因此，联合国粮农组织和亚太地区水产养殖联盟(NACA)将之命名为肝胰腺坏死综合症(Hepatopancreas necrosissyndrome，HPNS)或急性肝胰腺坏死综合症(Acute hepatopancreasnecrosis disease，AHPND)。
迄今为止，AHPND只发生于凡纳滨对虾、斑节对虾和中国明对虾。已有的研究显示，在凡纳滨对虾虾苗、幼虾阶段等都能检测到病原的存在。但近几年来，AHPND的发生季节不明显，放苗60天后常有发生。高温季节、放养密度高等对虾发病率较高，养殖集中区域发病率较高，单养池塘的对虾患病几率和受影响程度均高于虾鱼混养池塘。
2013年5月1日全球水产养殖联盟(GAA)宣布，亚利桑那大学研究团队经过数月的调查研究发现了导致AHPND的病原体。美国莱特纳教授领导的研究小组发表声明：由未知因子引起的在中国和东南亚暴发的AHPND其病原已经被确定：一种副溶血弧菌(VPAHPND)。Sirikharin等纯化VPAHPND的菌液上清用来感染健康对虾，48h内引起健康对虾极高的死亡率，SDS琼脂糖凝胶电泳发现两段分子量分别为12kDa和50kDa的蛋白PirA、PirB。Lee将接合缺少PirvpAB操纵子的pVA1-like质粒的VP菌株进行回归感染实验，结果未出现感染现象，进一步证明了PirA和PirB是AHPND发生的主要毒力因子的观点。
PCR技术是分子生物学的基础，自其问世以来，便应用于现代生物学的各个方面，且在常规PCR的基础上，发展了其它PCR技术，如逆转录PCR(touch down)、降落PCR等等。多重PCR是一种特殊的PCR技术，它在同一反应体系中加入两对及两对以上的引物，可以同时检测多个目的基因，产生多个目的条带。多重PCR已成为鉴定病毒，细菌和寄生虫的有效工具，目前虽然已经有针对AHPND进行多重PCR的方法报道，但是都是针对AHPND是否发生进行鉴定，而并没有对引起AHPND的病原进行分型的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测对虾VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的方法，针对VPAHPND毒力因子PirA和PirB设计引物组合，采用多重PCR方法扩增PirA和PirB，实现对虾VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的准确鉴定，为不同地区对虾养殖AHPND的控制提供技术指导。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一种检测VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的引物，包括用于检测VPAHPND毒力因子PirA和PirB的引物对，所述引物对为：
PirA-F：5’-CGTGGGGAGCTTACCATTCA-3’；
PirA-R：5’-AAACCACGACTAGCGCCATT-3’；
PirB-F：5’-AAACTTCGGTTATGCTGCGG-3；
PirB-R：5’-CACCAACTACGAGCACC CAT-3’。
优选的是，包括以煮沸后的菌液上清为模板DNA，利用多重PCR方法对VPAHPND毒力因子PirA和PirB进行扩增的步骤。
优选的是，扩增反应体系为25μL，包括10×PCR缓冲液2.5μL，dNTPs mixture 2μL，4种引物各0.5μL，模板DNA 1μL，rTaq酶0.20μL。
优选的是，扩增反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃40s，30个循环；72℃5min。
本发明还提供一种检测VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的试剂盒，包括所述的引物。
本发明还提供一种所述的试剂盒在检测VPAHPND急性菌株和亚急性菌株中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明针对VPAHPND的毒力因子PirA和PirB设计扩增引物对，并确定扩增反应体系和反应条件的参数，再通过该所设计的扩增引物对进行多重PCR，实现准确鉴别PirA和PirB二者构成的二元毒素的具体分型，对于急性和亚急性VPAHPND菌株的有效鉴别提供理论支持，利于不同对虾养殖场以及海洋水产科研机构对鉴别AHPND做出技术指导，以便于及时针对性的进行防控和治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为AHPND病原菌副溶血弧菌VPAHPND的特异性引物准确性验证结果；A和B分别为PirA和PirB扩增结果，其中M为100bpDNA ladder；P为VPAHPND；N为非VPAHPND；
图2为AHPND病原菌副溶血弧菌VPAHPND的特异性引物灵敏度验证结果；A和B分别为PirA和PirB扩增结果，其中M为100bpDNAladder；1-5泳道：106-102cfu/g重组质粒DNAPCR产物；
图3为VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的PCR检测结果；其中，M：100bp DNAladder；急：VPAHPND急性菌株；亚急：VPAHPND亚急性菌株。
具体实施方式
现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
AHPND是南美白对虾养殖中的多发疾病，对广西、广东和福建等南美白对虾主养区造成了严重冲击。研究发现VPAHPND感染的虾出现了不同死亡率。墨西哥菌株strain M1-1感染的虾呈现亚急性死亡，与其它两株泰国菌株3HP和5HP相比，死亡率较低，致病机理尚未明确。本发明对不同地区爆发AHPND养殖场调查后发现发生AHPND的不同养殖对虾群体出现了急性和亚急性两种病程，VPAHPND菌株间存在毒力差异。
而基于AHPND病原为副溶血弧菌VPAHPND，该病原菌的毒力因子是由PirA、PirB形成二元毒素引起，最终导致对虾肝小管细胞坏死脱落。而VPAHPND可分为PirA+PirB+、PirA-PirB+、PirA+PirB-三类，根据文献和攻毒试验结果发现：PirA+PirB+、PirA-PirB+型VPAHPND感染病虾表现出明显的肝胰腺坏死现象，PirA+PirB-型VPAHPND感染对虾未表现出肝胰腺坏死现象，因此，PirA+PirB+、PirA-PirB+型VPAHPND可分型为急性菌株，PirA+PirB-型VPAHPND可分型为亚急性菌株。本发明基于上述分型，针对PirA、PirB设计可扩增引物对并进行了验证，具体见以下实施例。
实施例1AHPND病原菌副溶血弧菌VPAHPND的特异性引物设计使用Primer premier6.0软件进行引物设计，目的基因分别为PirA基因(GenBank序列号NC_025152.1：17198-17533)和PirB(NC_025152.1：17546-18862)，PirA基因扩增大小设置在150-200bp，PirB基因扩增大小设置在350-400bp。引物由上海生工公司合成。具体引物序列如表1所示。
表1引物序列
上述引物可以制备成用于检测检测对虾VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的检测试剂盒，该检测试剂盒还包括10×PCR缓冲液，dNTPs mixture，4类引物(PirA-F、PirA-R、PirB-F、PirB-R)，rTaq酶。优选25μL反应体系，包括以下组分用量：10×PCR缓冲液2.5μL，dNTPs mixture 2μL，4类引物(10mmol/L)各0.5μL，rTaq酶(5U/μL)0.20μL。
实施例2检测对虾VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的多重PCR方法
由江苏省海洋研究所提供数株急性菌株、亚急性菌株(急性菌株：72h内死亡率达50％；亚急性：72h内死亡率不足50％)。现以3株VPAHPND和3株非VPAHPND，利用实施例1设计的引物构建多重PCR方法进行菌株鉴定。
取上述的3株VPAHPND和3株非VPAHPND，分别加水煮沸后过滤取上清液，作为模板DNA，进行多种PCR扩增反应。
扩增反应体系为25μL，包括：10×PCR缓冲液2.5μL，dNTPs mixture 2μL，4类引物(10mmol/L)各0.5μmol/L，模板DNA1μL，rTaq酶(5U/μL)0.20μL。
反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃40s，30个循环；72℃5min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，观察有无目标条带。
结果如图1所示：采用PirA-F和PirA-R对PirA进行扩增，以及PirB-F和PirB-R对PirB进行扩增，结果显示VPAHPND菌株中PirA和PirB均能扩增出清晰的条带，说明本发明设计的引物可以用于PirA和PirB扩增。如图3所示，混合加入上述四种引物，结果显示图谱中365bp处有条带则为急性菌株；若仅在173bp处有条带则为亚急性菌株；若都无条带则为非致病菌株，说明本发明所设计的四种引物可以准确鉴别VPAHPND菌株和非VPAHPND菌株，并且还能具体区别VPAHPND急性菌株和亚急性菌株。
实施例3AHPND病原菌副溶血弧菌VPAHPND的特异性引物灵敏度的验证
将不同浓度的急性和亚急性菌液添加至对虾肝胰腺匀浆样品中，匀浆终样品浓度依次为106cfu/g、105cfu/g、104cfu/g、103cfu/g、102cfu/g。将混合样品作为测试模板，利用天根生化科技(北京)有限公司DNA提取试剂盒提取组织样品DNA。反应体系和反应程序同实施例2，琼脂糖凝胶中进行电泳，确定在肝胰腺组织中每种菌株检出的灵敏度。
结果图2所示，在对PirA和PirB扩增图谱中，PirA泳道1-5在173bp处均能出现清晰的扩增条带，PirB泳道1-5在365bp处均能出现清晰的扩增条带。说明VPAHPND病原菌可在102cfu/g水平被本实验体系检测到。
实施例4AHPND病原菌副溶血弧菌VPAHPND的特异性引物及其多重PCR检测方法的应用
在江苏省如东和大丰等地对虾养殖合作社和虾苗淡化厂采集疑似AHPND南美白对虾的养殖对虾样品和正常虾苗，冷藏带回实验室。在江苏省海洋水产研究所进行AHPND病原检测验证。
首先，利用天根生化科技(北京)有限公司DNA提取试剂盒提取虾苗中的DNA。
然后，采用实施例2中的PCR反应体系和反应条件对提取的DNA进行多重PCR扩增检测，以VPAHPND病原菌作为阳性对照，水作为阴性对照。
结果显示：在采集的30份样品中，其中，21份样品中在365bp处均出现了清晰的条带，说明这些样品发生了AHPND，并且由VPAHPND急性菌株引发；而其余9份在173bp处出现了清晰的条带，说明这些样品发生了AHPND，并且由VPAHPND亚急性菌株引发。
上述检测结果，说明本发明设计的检测对虾VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的引物和多重PCR方法，能够实现大样本检测，并且特异性强、准确率高，适合于在对虾养殖业中进行推广应用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 江苏省海洋水产研究所
<120> 检测对虾VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgtggggagc ttaccattca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
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<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaacttcggt tatgctgcgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caccaactac gagcacccat 20
Claims (2)
1.一种检测VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的方法，其特征在于，包括以煮沸后的菌液上清为模板DNA，利用多重PCR方法对VPAHPND毒力因子PirA和PirB进行扩增的步骤；
所述方法不以疾病的诊断和/或治疗为目的；
所述扩增的引物对为：
PirA-F：5’-CGTGGGGAGCTTACCATTCA-3’；
PirA-R ：5’-AAACCACGACTAGCGCCATT-3’；
PirB-F：5’-AAACTTCGGTTATGCTGCGG-3；
PirB-R：5’-CACCAACTACGAGCACC CAT-3’；
所述扩增的反应体系为25μL，包括10×PCR 缓冲液2.5μL，dNTPs mixture 2μL，4种引物各0.5μL，模板DNA 1μL，rTaq 酶0.20μL；
所述扩增的反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s，30 个循环；72℃ 5 min；
所述急性菌株为72h内死亡率达50%；所述亚急性菌株为72h内死亡率不足50%；
PirA+PirB+、PirA-PirB+型VPAHPND分型为急性菌株，PirA+PirB-型VPAHPND分型为亚急性菌株；
图谱中365bp处有条带则为急性菌株；若仅在173bp处有条带则为亚急性菌株；若都无条带则为非致病菌株。
2.一种检测毒力因子PirA和PirB的引物对在非诊断和/或治疗目的的检测VPAHPND急性菌株和亚急性菌株中的应用；
所述引物对为：
PirA-F：5’-CGTGGGGAGCTTACCATTCA-3’；
PirA-R ：5’-AAACCACGACTAGCGCCATT-3’；
PirB-F：5’-AAACTTCGGTTATGCTGCGG-3；
PirB-R：5’-CACCAACTACGAGCACC CAT-3’；
利用所述引物对扩增所述VPAHPND急性菌株和亚急性菌株的毒力因子PirA和PirB，所述扩增的反应体系为25μL，包括10×PCR 缓冲液2.5μL，dNTPs mixture 2μL，4种引物各0.5μL，模板DNA 1μL，rTaq 酶0.20μL；所述扩增的反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30s，72℃ 40 s，30 个循环；72℃ 5 min；
所述急性菌株为72h内死亡率达50%；所述亚急性菌株为72h内死亡率不足50%；
PirA+PirB+、PirA-PirB+型VPAHPND分型为急性菌株，PirA+PirB-型VPAHPND分型为亚急性菌株；
图谱中365bp处有条带则为急性菌株；若仅在173bp处有条带则为亚急性菌株；若都无条带则为非致病菌株。
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