CN112048572B - 基于lamp技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒 - Google Patents

基于lamp技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN112048572B
CN112048572B CN202010976813.XA CN202010976813A CN112048572B CN 112048572 B CN112048572 B CN 112048572B CN 202010976813 A CN202010976813 A CN 202010976813A CN 112048572 B CN112048572 B CN 112048572B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
seq
primer group
dna
artificial sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010976813.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN112048572A (zh
Inventor
葛辉
周宸
林琪
吴建绍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fisheries Research Institute Of Fujian (fujian Aquatic Disease Prevention Center)
Original Assignee
Fisheries Research Institute Of Fujian (fujian Aquatic Disease Prevention Center)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fisheries Research Institute Of Fujian (fujian Aquatic Disease Prevention Center) filed Critical Fisheries Research Institute Of Fujian (fujian Aquatic Disease Prevention Center)
Priority to CN202010976813.XA priority Critical patent/CN112048572B/zh
Publication of CN112048572A publication Critical patent/CN112048572A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112048572B publication Critical patent/CN112048572B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于LAMP技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒，属于水产病原检测试剂开发技术领域。本发明的试剂盒包括内参质控引物组和待检测病原引物组；该试剂盒针对对虾常见病原微生物：IHHNV病毒、白斑综合症病毒、肝肠胞虫、对虾虹彩病毒、对虾急性肝胰腺坏死病‑副溶血弧菌等设计；可用于同时检测多种病原；而且内参质控引物组的添加可以排除反应试剂失效、扩增模板的核酸提取质量对检测结果的影响；保证检测结果的准确性；适用于基层养殖户虾苗和亲虾的筛选采购与海关快速检疫通关。

Description

基于LAMP技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒
技术领域
本发明属于水产病原检测试剂开发技术领域，具体涉及一种基于LAMP技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒。
背景技术
中国是全球最大的对虾生产国；中国对虾产量约占世界对虾总产量的40％；且对虾养殖量呈逐年上升趋势。然而，对虾养殖病害也在不断发生。目前，对虾养殖业危害最严重的病原主要为：对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)；传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV)；虹彩病毒病(Shrimp hemocyte iridescent virus，SHIV)；急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND)；对虾肝肠胞虫病(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)。
此外，我国亲虾严重依赖进口；我国对虾种业从国外引进种虾培育生产一代苗约占20％左右，国内通过遗传育种手段自主培育亲虾占生产用亲虾不到10％，其余绝大部分使用“菜虾”作为亲虾。进口亲虾需经海关隔离检疫后才能放行，目前海关检疫大多采用实验室应用最广泛的聚合酶链式反应(PCR)，该技术检测时间长、灵敏性不够，不利于多种病原同时检测和鲜活亲虾的快速放关；其他病原检测技术如组织病理切片观察、病毒分离培养、抗原血清反应、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、核酸杂交技术等依赖精密仪器、检测成本高、灵敏性和特异性差，操作程序繁琐，难以适用于海关检疫。此外，使用“菜虾”作为亲虾可降低成本；但个别苗场主打SPF一代虾苗，却在其中掺杂“土苗”，导致虾苗品质良莠不齐；因目前尚无适合养殖基层的多病原现场快速检测试剂，虾农对虾苗病害的认识不够；低质低价的虾苗涌入种苗市场，扰乱虾苗市场正常的生产经营。
近年来，分子生物学技术的快速发展，高效、简便且特异性强的核酸扩增技术——环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)应运而生。在对虾养殖中，关于白斑综合征病毒、传染性皮下坏死病毒、肝胰腺坏死症、虹彩病毒、嗜水气单胞菌、桃拉综合症病毒、肝肠胞虫等，都有LAMP检测方法的报道，均证实LAMP是一种简单快速灵敏的诊断方法。然而，目前关于对虾病原的LAMP试剂盒的研究多数集中在不同病原检测试剂盒的开发、灵敏性和特异性的优化以及两种不同病原同时检测方面。对于多种病原同时检测的研究较少；而且现有大多数LAMP检测的扩增过程均是在一个类似PCR仪的反应器中进行，用户检测成本高，检测结果不够直观，不能可视化展示，结果的测定方法复杂。例如，中国专利申请201910090452.6公开了一种水产养殖动物病毒的高通量定量检测试剂盒，该试剂盒包括14种水产养殖动物病毒的LAMP检测引物组，通过离心式微流控芯片技术，在2-3h内实现14种水产养殖动物病毒的检测，具有通量高、快速检测的优点；然而该方法没有摆脱对昂贵仪器的依赖，不适于海关检疫和基层养殖户的推广使用。
此外，由于LAMP反应易受检测试剂(例如反应酶失活)、扩增模板的核酸提取质量(例如提取的核酸被严重降解或因操作失误未将核酸提取出来)等因素的影响，因此，设置LAMP反应检测的内参质控显得尤为重要；目前，关于内参质控的报道多见于人类疾病检测，而关于水产病原检测的内参质控鲜有报道。而且现有的内参质控引物组多数只针对于同一种生物，适用于多种生物的内参质控引物组的报道较少。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于LAMP技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒，该试剂盒包括内参质控引物组和待检测病原引物组；该试剂盒针对对虾常见病原微生物：IHHNV病毒、白斑综合症病毒、肝肠胞虫、对虾虹彩病毒、对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌等设计；可用于同时检测多种病原；而且内参质控引物组的添加可以排除反应试剂失效、扩增模板的核酸提取质量对检测结果的影响；保证检测结果的准确性；适用于基层养殖户虾苗和亲虾的采购与海关快速检疫通关。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
基于LAMP技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒，包括内参质控引物组、待检测病原引物组；所述的内参质控引物组是根据SEQ ID No:1所示的核酸序列设计，并且包含引物组正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、环引物LF和环引物LB。
在上述方案的基础上，所述内参质控引物组如SEQ ID No:2～SEQ ID No:7、SEQID No:8～SEQ ID No:13、SEQ ID No:14～SEQ ID No:19、SEQ ID No:20～SEQ ID No:25所示核酸序列组中的至少一组。
在上述方案的基础上，所述待检测病原引物组为IHHNV病毒引物组、白斑综合症病毒引物组、肝肠胞虫引物组、对虾虹彩病毒引物组、对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌引物组中的至少一组。
在上述方案的基础上，所述IHHNV病毒引物组为SEQ ID No:26～SEQ ID No:30、SEQ ID No:31～SEQ ID No:36所示核酸序列组中的任意一组。
在上述方案的基础上，所述白斑综合症病毒引物组为SEQ ID No:37～SEQ ID No:41、SEQ ID No:42～SEQ ID No:46、SEQ ID No:47～SEQ ID No:51所示核酸序列组中的任意一组。
在上述方案的基础上，所述肝肠胞虫引物组为SEQ ID No:52～SEQ ID No:56、SEQID No:57～SEQ ID No:62、SEQ ID No:63～SEQ ID No:67所示核酸序列组中的任意一组。
在上述方案的基础上，所述对虾虹彩病毒引物组为SEQ ID No:68～SEQ ID No:72、SEQ ID No:73～SEQ ID No:78、SEQ ID No:79～SEQ ID No:83所示核酸序列组中的任意一组。
在上述方案的基础上，所述对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌引物组为SEQ IDNo:84～SEQ ID No:87、SEQ ID No:88～SEQ ID No:93所示核酸序列组中的任意一组。
在上述方案的基础上，所述LAMP法检测对虾常见病原微生物的试剂盒，还包含反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)和显色染料。
在上述方案的基础上，所述显色染料为钙黄绿素、HNB、酚红试剂中的任意一种。
本发明基于LAMP技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒中，各引物组可在60～65℃范围内的任何温度值下，恒温反应，优选的反应温度为63℃。
本发明技术方案的优点：
本发明的内参质控引物组能够将对虾基因组DNA中的18S核糖体RNA的基因序列扩增出；本发明内参质控引物组的设计能够避免在试剂盒使用过程中因核酸提取失败或检测试剂失效对检测结果的影响；在实际检测过程中，当内参质控引物组未出现扩增时，即指示检测结果无效，无论病原微生物的检测引物组是否出现扩增。
此外，本发明中的内参质控引物组与待测病原微生物的检测引物组在同一温度下反应；可实现同一反应条件下同时检测多个病原的目的；试剂盒对单个样品5种以上病原的检测时间在1.5小时内完成；检测结果肉眼可以区分，不需要紫外灯或者其他设备辅助；剂盒整个检测过程不依赖昂贵仪器和复杂设备，操作简单，适合养殖、检疫一线人员使用。
基于LAMP技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒可以同时对对虾常见的5种病原进行检测，对5种病原的最低检出限分别为IHHNV病毒0.53～5.3copies/μL、白斑综合症病毒0.225～2.25copies/μL、肝肠胞虫27-83copies/μL、对虾虹彩病毒2.38-23.8copies/μL、对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌0.21-2.1copies/μL；且5种病原微生物的检测引物组特异性强，各病原之间没有交叉反应。
附图说明
图1不加FD时引物组NCZK-1的初步扩增结果；
图2不加FD时引物组NCZK-2的初步扩增结果；
图3不加FD时引物组NCZK-3的初步扩增结果；
图4不加FD时引物组NCZK-4的初步扩增结果；
图5添加FD时引物组NCZK-1的全标本扩增结果；
图6自然光下添加FD时引物组NCZK-1的全标本扩增结果；
图7紫外光下添加FD时引物组NCZK-1的全标本扩增结果；
图8添加FD时引物组NCZK-2的全标本扩增结果；
图9自然光下添加FD时引物组NCZK-2的全标本扩增结果；
图10紫外光下添加FD时引物组NCZK-2的全标本扩增结果；
图11添加FD时引物组NCZK-3的全标本扩增结果；
图12自然光下添加FD时引物组NCZK-3的全标本扩增结果；
图13紫外光下添加FD时引物组NCZK-3的全标本扩增结果；
图14添加FD时引物组NCZK-4的全标本扩增结果；
图15自然光下添加FD时引物组NCZK-4的全标本扩增结果；
图16紫外光下添加FD时引物组NCZK-4的全标本扩增结果；
图17添加FD时引物组NCZK-3、NCZK-4特殊标本扩增结果；
图18添加FD时引物组NCZK-3部分标本二次扩增结果；
图19添加FD时引物组NCZK-4部分标本二次扩增结果；
图20本发明试剂盒的检测效果验证；
图21本发明试剂盒的检测实例。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
采用虾类、蟹类、鱼类和参类等多个物种的18S核糖体RNA的基因序列与SEQ IDNo:1所示的凡纳滨对虾18S核糖体RNA基因序列进行多重比对；当采用的比对序列较多时，则无法获得具有高度保守区域的序列；因此，经筛选最终采用Macrobrachium rosenbergii18S(GQ131934)、Penaeus indicus 18S(MH400902)、Penaeus semisulcatus 18S(DQ079766)、Procambarus clarkii 18S(AF436001)、Scylla paramamosain 18S(KC902763)与SEQ ID No:1所示序列进行多重比对；筛选获得SEQ ID No:1所示序列的高度保守区域；根据保守区域采用PrimerExplorer V4软件设计内参质控LAMP引物组；本发明共设计了四组引物分别记为NCZK-1、NCZK-2、NCZK-3、NCZK-4，每套引物分别包含两条内引物(FIP和BIP)、两条外引物(F3和B3)和两条环引物(LF和LB)。
本发明所设计的内参质控引物组序列如下：
Figure BDA0002686024440000041
Figure BDA0002686024440000051
本发明的上述引物组序列均是由上海生工生物工程有限公司合成。
实施例2四套内参质控引物组的扩增分析
模板准备：分别提取克氏原螯虾、澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼、双斑东方鲀、斜带石斑鱼、龙胆石斑鱼、凡纳滨对虾、糙海参、花刺参、仿刺参等11个物种的基因组DNA，用于NCZK-1、NCZK-2、NCZK-3、NCZK-4四套引物组的扩增分析。
1、将NCZK-1、NCZK-2、NCZK-3、NCZK-4引物组合分别以克氏原螯虾、澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼、凡纳滨对虾的基因组DNA为模板，并且以水作为阴性对照，在63℃下进行LAMP反应60分钟，反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
LAMP反应体系(25μL)为：
Figure BDA0002686024440000052
其中所述2×反应缓冲液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100和0.8M甜菜碱。
反应结果如图1-4和表1所示，NCZK-1、NCZK-2、NCZK-3三套引物，在未加FD的情况下能将选定澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼和凡纳滨对虾检测出，而克氏原螯虾未检测出，水对照正常。NCZK-4引物未加FD情况下能将克氏原螯虾、澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼和凡纳滨对虾都检测出，水对照正常。
表1各引物组扩增时间
Figure BDA0002686024440000061
注：“——”表示未出现扩增；“\”表示未进行试验；上述时间是以各引物开始反应起峰时间为准。
2、采用NCZK-1、NCZK-2、NCZK-3、NCZK-4引物组合分别以克氏原螯虾、澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼、双斑东方鲀、斜带石斑鱼、龙胆石斑鱼、凡纳滨对虾、糙海参、花刺参、仿刺参的基因组DNA为模板，并且以水作为阴性对照，在添加FD的条件下，63℃下进行LAMP反应70分钟，反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。
LAMP反应体系(25μL)为：
Figure BDA0002686024440000062
其中所述2×反应缓冲液为：20mM Tris-HCl pH 8.8，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100和0.8M甜菜碱。
结果如图5-16所示：
其中，图6、7，图9、10，图12、13，图15、16，从左到右各管内的模板分别为：克氏原螯虾、澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼、双斑东方鲀、斜带石斑鱼、龙胆石斑鱼、凡纳滨对虾、糙海参、花刺参、仿刺参、水。
加入FD的引物组NCZK-1，只能检测出凡纳滨对虾，其余十种都未出现扩增；加入FD的引物组NCZK-2，可以检测出澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼、双斑东方鲀、斜带石斑鱼、龙胆石斑鱼、凡纳滨对虾、糙海参等，对克氏原螯虾、花刺参、仿刺参等未见扩增；加入FD的引物组NCZK-3，未检出克氏原螯虾和双斑东方鲀，其余都检测出，阴性对照水扩增正常；加入FD的引物组NCZK-4，未检出糙海参，克氏原螯虾55分钟左右开始出峰，阴性对照水扩增正常。
表2各引物组扩增时间
Figure BDA0002686024440000071
注：“——”表示未出现扩增；上述时间是以各引物开始反应起峰时间为准。
3、采用NCZK-3、NCZK-4引物组合，进一步验证2中未扩增出的模板；其中NCZK-3组以克氏原螯虾、双斑东方鲀、仿刺参的基因组DNA为模板，NCZK-4组以克氏原螯虾、糙海参、花刺参的基因组DNA为模板，两者均以水作为阴性对照，在添加FD的条件下，63℃下进行LAMP反应70分钟，反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。反应体系同2。
结果如图17所示：
本次试验将反应时间延长至70分钟，结果显示两组引物的阴性对照水均未出现扩增；表明阴性对照正常，试验结果可信；
加入FD的引物NCZK-3，仍未检出克氏原螯虾和双斑东方鲀；加入FD的引物NCZK-4，仍未检出糙海参，但克氏原螯虾52分钟左右被检测出。
表3各组引物扩增时间
Figure BDA0002686024440000072
注：“——”表示未出现扩增；“\”表示未进行试验；上述时间是以各引物开始反应起峰时间为准。
4、采用NCZK-3、NCZK-4引物组合，分别以澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼、斜带石斑鱼、龙胆石斑鱼、凡纳滨对虾、仿刺参基因组DNA为模板，并且以水作为阴性对照，在63℃下进行LAMP反应70分钟，反应结束后，通过观察扩增曲线分析扩增结果。反应体系同2。
结果如图19所示：
加入FD的引物NCZK-3，未检出斜带石斑鱼，其余都检测出。水对照正常。
加入FD的引物NCZK-4，都检测出。水对照正常。
表4各引物组扩增时间
Figure BDA0002686024440000081
注：“——”表示未出现扩增；上述时间是以各引物开始反应起峰时间为准。
综上，当用于检测凡纳滨对虾时，NCZK-1、NCZK-2、NCZK-3、NCZK-4引物组合均适合；当用于检测克氏原螯虾时，只有NCZK-4引物组合合适；对于澳洲淡水龙虾、拟穴青蟹、大黄鱼、斜带石斑鱼、龙胆石斑鱼；除NCZK-1外，NCZK-2、NCZK-3、NCZK-4引物组合均适合；针对于双斑东方鲀只有NCZK-2、NCZK-4引物组合适；针对于糙海参只有NCZK-2、NCZK-3合适，其中，NCZK-2扩增时间较长，以NCZK-3效果较好；针对于花刺参和仿刺参NCZK-3、NCZK-4引物组较为合适。
实施例3
基于LAMP技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒，包括：内参质控引物组和IHHNV病毒引物组、白斑综合症病毒引物组、肝肠胞虫引物组、对虾虹彩病毒引物组、对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌引物组中的至少一组；还包含反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)和显色染料；其中，显色染料为钙黄绿素、HNB、酚红试剂中的任意一种。
所述的内参质控引物组为实施例1所述的NCZK-1、NCZK-2、NCZK-3、NCZK-4中的任意一组；
所述IHHNV病毒引物组为IHHNV-1、IHHNV-2中的一组：
Figure BDA0002686024440000082
Figure BDA0002686024440000091
所述白斑综合症病毒引物组为WSSV-1、WSSV-2、WSSV-3中的任意一组：
Figure BDA0002686024440000092
所述肝肠胞虫引物组为EHP-1、EHP-2、EHP-3中的任意一组：
Figure BDA0002686024440000093
所述对虾虹彩病毒引物组为SHIV-1、SHIV-2、SHIV-3中的任意一组：
Figure BDA0002686024440000101
所述对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌引物组为AHPND-1、AHPND-2中任意一组：
Figure BDA0002686024440000102
实施例4
1、本发明基于LAMP技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒的效果验证取一排八联排管，依次标记各管为1-8，各个管中的引物、模板如下所示：
Figure BDA0002686024440000103
Figure BDA0002686024440000111
其中采用的虾核酸为提取的凡纳滨对虾的基因组DNA，所述IHHNV阳性质粒、WSSV阳性质粒、EHP阳性质粒、SHIV阳性质粒、AHPND阳性质粒分别为专利申请201711252452.9、201810770090.0、201911107097.5、202010883027.5和202010882807.8中所记载的阳性质粒；上述各管除8号管不添加Bst DNA聚合酶外，各管中依次加入反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)和显色染料；所述显色染料为酚红试剂；反应体系中各组分的添加量和浓度参照实施例2反应体系。
将上述八联排管置于63℃，恒温反应60分钟；观察反应后各管溶液变化，判断反应结果，如图20所示：1-6号管均观察到颜色变化，表明出现扩增；而7和8号管未发生颜色变化，未出现扩增情况。
2、应用实例
从不同的养殖场采集4批对虾样本；分别提取基因组DNA，采用本发明对虾常见病原微生物的试剂盒进行检测，其中采用的引物组为：IHHNV-2、WSSV-2、EHP-3、SHIV-1、AHPND-2、NCZK-4；除引物组外各管中依次加入模板、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O(RNase-free)和显色染料；所述显色染料为酚红试剂；反应体系中各组分的添加量和浓度参照实施例2反应体系；此外，单独设置一排阴性对照组，阴性对照组各管中采用水替代模板，其它组分与试验组相同；上述各反应管置于63℃，恒温反应60分钟；观察反应后各管溶液颜色变化。
结果如图21所示：第一排为阴性对照组，阴性对照未发生颜色变化；第二至五排依次为第1-4批次的对虾样本的检测组；各排管从左边向右引物组依次为：IHHNV-2、WSSV-2、EHP-3、SHIV-1、AHPND-2、NCZK-4；除阴性对照组外，各排最后一管反应后均发生颜色变化，说明各排检测结果可信；第1批和第2批的样本均携带有IHHNV病毒和虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌；第3批样本携带虾虹彩病毒和虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌；第4批样本除肝肠胞虫外其他4种病原均有检测出；上述检测结果说明本发明试剂盒检测方便，可同时检测5种病原，大大缩短检测时间，灵敏性高、特异性好。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心）
<120> 基于LAMP技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒
<160> 93
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 854
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)
<400> 2
tgccttatca gctatcgatt gtaggttaaa cgcctacaat ggctatcacg ggtaacgggg 60
aatcagggtt cgattccgga gagggagcct gagaaacggc taccacatct aaggaaggca 120
gcaggcgcgc aaattaccca ctcccggcac ggggaggtag tgacgaaaaa tactgttgcg 180
agccccgaac ggggcctcgc aattggaatg agtacacttt aaatccttgt acgaggatcg 240
agtggagggc aagtctggtg ccagccgccg cggtaattcc agctccacta gcgtatatta 300
aagttgttgc ggttgaaacg ctcgtagttt gacttctgct ccggaccggc ggtccgcctt 360
agcggcggct actgccgggt tccgagctgt gtccccgccg gcgcacatgg ggtttttatg 420
cccttaaccg ggtgtcccct tgtggccggc acgtttactt tgaaaaaatt agagtgctca 480
gagcaggctg gtttttgctt acagcccgaa tggtcgtgca tggaatgatg gaacaggacc 540
tcggttctat tttgtcggtt tttcggaacc cgaggtaatg attaatagaa gcagacgggg 600
gcattcgtac tgcgacgcta gaggtgaaat tcttagaccg tcgcatgacg acctactgcg 660
aaagcatctg ccaaggatgt tttcattgat caagaacgaa agttagaggt tcgaaggcga 720
tcagataccg ccctagttct aaccttaaac gatgctgact agcgatccgc cgcagttatt 780
cccatgaccc ggcgggtagc ttccgggaaa ccaaagtctt tgagttccgg gggaagtatg 840
gttgcaaacc tgaa 854
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 2
cggggaatca gggttcga 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 3
gtggagctgg aattaccgc 19
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 4
ttcgtcacta cctccccgtg cctgagaaac ggctaccaca t 41
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 5
cgaacggggc ctcgcaattg acttgccctc cactcga 37
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 6
cgggagtggg taatttgcgc 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 7
acactttaaa tccttgtacg agga 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 8
ttcttagacc gtcgcatgac 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 9
cccccggaac tcaaagact 19
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 10
cggtatctga tcgccttcga accgacctac tgcgaaagca tct 43
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 11
atgctgacta gcgatccgcc ttggtttccc ggaagctac 39
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 12
tcgttcttga tcaatgaaaa catcc 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 13
gcagttattc ccatgacccg 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 14
gccggcacgt ttactttga 19
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 15
tcgtcatgcg acggtcta 18
<210> 16
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 16
accgaggtcc tgttccatca ttcagagcag gctggttttt gc 42
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 17
ttgtcggttt ttcggaaccc gatctagcgt cgcagtacga at 42
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 18
cacgaccatt cgggctgta 19
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 19
ttaatagaag cagacggggg c 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 20
tcgattgtag gttaaacgcc t 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 21
ctccactcga tcctcgtaca 20
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 22
ccttccttag atgtggtagc cgttggtaac ggggaatcag ggt 43
<210> 23
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 23
gcacggggag gtagtgacga tcattccaat tgcgaggcc 39
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 24
ggctccctct ccggaat 17
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Penaeus vannamei)
<400> 25
tgttgcgagc cccgaac 17
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus)
<400> 26
ggtgaccact ggcacatc 18
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus)
<400> 27
tggccaagac caaaatacga a 21
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus)
<400> 28
tctggcagca aaggtaactc ccacatactg cggacaccca 40
<210> 29
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus)
<400> 29
cgaagctgaa gcgactacgg tacgccgttc aataccgtat ctga 44
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus)
<400> 30
cgaggattgt agctctatgt ctgg 24
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus)
<400> 31
aaccctccac cagacaaga 19
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus)
<400> 32
tgtagacatc tgtgtgggtc t 21
<210> 33
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus)
<400> 33
cggcgcacat ggttgtctat gatcaccagc gacgacttcc t 41
<210> 34
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus)
<400> 34
ttcaacaaga gcaagcccaa ggacttgatc cttcggcgtg tt 42
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus)
<400> 35
cttttcgtat tcttggaaga gtcct 25
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosisvirus)
<400> 36
ggagggatcc acataatgaa gacg 24
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 37
cctcatctca gaagccatga a 21
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 38
ggtagaggat acggcagct 19
<210> 39
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 39
ggcgcatgag gcgaatggta cacacactaa tttccggcaa g 41
<210> 40
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 40
cggccctctc gcctttgatc accttgttcg gcgttct 37
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 41
gtcaaaggga gatacattcg aaga 24
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 42
cgaatacgcc atgtcccac 19
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 43
tcttggacat gttcatcacg t 21
<210> 44
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 44
tgcgaaagag gataccagat gctcaagcaa aattgtaact gcccct 46
<210> 45
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 45
cgcccagaag tctccatgga agactaataa gcttgttggc ctga 44
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 46
tgagggagta aaagtgtggt gga 23
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 47
ggaacaactt atcgccga 18
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 48
gatgttgttt cgctatcttc a 21
<210> 49
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 49
cgctttctgg tacagattca gctcttggaa aggttatcgt ga 42
<210> 50
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 50
acaccaagga aatgattgat agacttccat tgattctact cctcc 45
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(white spot syndrome virus)
<400> 51
aggctctgac gacctct 17
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 52
tgagtagaag ggtcgagtgt a 21
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 53
accatgctcc ctatccgt 18
<210> 54
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 54
agttggaatt accgcggctg caccttgacg tgaagcaatt gg 42
<210> 55
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 55
tgcagttaaa gggtccgtag tcgtccgcta ctctcaacaa actc 44
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 56
tggcaccaaa acttgccct 19
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 57
tgagtttgtt gagagtagcg g 21
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 58
cccagcattg tcggcatag 19
<210> 59
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 59
gctttcgcct ccgttggtcc gagcatggta taggtgggc 39
<210> 60
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 60
gacgtatctg gggatcaagg acggctagaa ctacagcggt gtc 43
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 61
aggtggggtc ttgagatttc attc 24
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 62
aaggctagag tatcgaaagt gatt 24
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 63
tttcgggctc tggggata 18
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 64
tcgccccatc aatttccaac 20
<210> 65
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 65
agcacaatcc actcctggta gtggctcgca agggtgaaac t 41
<210> 66
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 66
tcaacgcggg aaaacttacc agggcaccac tcttgtctac ctc 43
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Enterocytozoon hepatopenaei)
<400> 67
tccttccgtc aatttcgctt t 21
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 68
cgggagatgg tgttagatgg 20
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 69
cgttgcttga tcggcatc 18
<210> 70
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 70
gcccaatacg aatcgtttcc cgtagtcatg gatgaaccaa atgc 44
<210> 71
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 71
tgttccaacg aggaaaggaa acgtgctgga agcttgttgc a 41
<210> 72
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 72
cctttaacgt tcccgaactg a 21
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 73
ccccaacatt gaaatcagag 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 74
tttgcctttt tacccgtaat 20
<210> 75
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 75
cctgtccaaa atagaatgac cttgtattat tttctagatc aggccagt 48
<210> 76
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 76
agagggaaat aacgggaaaa cgggagatgt gttgaattta attgca 46
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 77
tgtgatttcc accaacgaat aca 23
<210> 78
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 78
cgttatttga gaaaatgttg ggaa 24
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 79
ccatggataa aaatttcaca gaa 23
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 80
acggtaaagc tgagatttcc 20
<210> 81
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 81
tcacacttcc tgatagtctt ccatccgaaa tggtaaaacc cct 43
<210> 82
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 82
gccagagatt gtaacggtag ctagatggat acactgatct tcga 44
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Shrimp hemocyte iridescent virus)
<400> 83
cttcgtaccg aaacgaaaac ga 22
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Acute hepatopancreatic necrosis disease)
<400> 84
tgataatgca ttctatcatc agc 23
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Acute hepatopancreatic necrosis disease)
<400> 85
atttgaaaga ccaaatgaaa cc 22
<210> 86
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Acute hepatopancreatic necrosis disease)
<400> 86
gtgagcacct tcttagtggt aatagttgta attaacaatg gcgctag 47
<210> 87
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Acute hepatopancreatic necrosis disease)
<400> 87
tgacggaatt taaccctaac aatgcgcttt gaaagcatag ttaggatc 48
<210> 88
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Acute hepatopancreatic necrosis disease)
<400> 88
caataccaat ggggtgcg 18
<210> 89
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Acute hepatopancreatic necrosis disease)
<400> 89
tcgttagtca tgtgagcac 19
<210> 90
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Acute hepatopancreatic necrosis disease)
<400> 90
cagggcgttg taaatggtaa gtctggaaag tggctaaatc ac 42
<210> 91
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Acute hepatopancreatic necrosis disease)
<400> 91
gcattctatc atcagcgtat tgttgagtgg taatagattg tacagaaac 49
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Acute hepatopancreatic necrosis disease)
<400> 92
ttcatcacgt tgtaccacat 20
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Acute hepatopancreatic necrosis disease)
<400> 93
attaacaatg gcgctagtcg 20

Claims (1)

1.基于LAMP技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒，其特征在于，包括内参质控引物组、待检测病原引物组、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、ddH2O和显色染料；
所述的内参质控引物组是根据SEQ ID No:1所示的核酸序列设计，并且包含引物组正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、环引物LF和环引物LB；所述内参质控引物组如SEQ ID No:20~ SEQ ID No:25所示；
所述待检测病原引物组由IHHNV病毒引物组、白斑综合症病毒引物组、肝肠胞虫引物组、对虾虹彩病毒引物组和对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌引物组组成；其中，所述IHHNV病毒引物组为SEQ ID No:26~ SEQ ID No:30、SEQ ID No:31~ SEQ ID No:36所示核酸序列组中的任意一组；所述白斑综合症病毒引物组为SEQ ID No:37~ SEQ ID No:41、SEQID No:42~ SEQ ID No:46、SEQ ID No:47~ SEQ ID No:51所示核酸序列组中的任意一组；所述肝肠胞虫引物组为SEQ ID No:52~ SEQ ID No:56、SEQ ID No:57~ SEQ ID No:62、SEQID No:63~ SEQ ID No:67所示核酸序列组中的任意一组；所述对虾虹彩病毒引物组为SEQID No:68~ SEQ ID No:72、SEQ ID No:73~ SEQ ID No:78、SEQ ID No:79~ SEQ ID No:83所示核酸序列组中的任意一组；所述对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌引物组为SEQ IDNo:84~ SEQ ID No:87、SEQ ID No:88~ SEQ ID No:93所示核酸序列组中的任意一组；
所述ddH2O无RNA酶影响；
所述显色染料为钙黄绿素、酚红试剂中的任意一种。
CN202010976813.XA 2020-09-17 2020-09-17 基于lamp技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒 Active CN112048572B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010976813.XA CN112048572B (zh) 2020-09-17 2020-09-17 基于lamp技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010976813.XA CN112048572B (zh) 2020-09-17 2020-09-17 基于lamp技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112048572A CN112048572A (zh) 2020-12-08
CN112048572B true CN112048572B (zh) 2023-04-28

Family

ID=73603105

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010976813.XA Active CN112048572B (zh) 2020-09-17 2020-09-17 基于lamp技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112048572B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112760361A (zh) * 2021-02-04 2021-05-07 宁波大学 一种检测虾肝肠胞虫的引物以及试剂盒
CN112795702A (zh) * 2021-03-07 2021-05-14 珠海市迪奇孚瑞生物科技有限公司 虾血细胞虹彩病毒lamp检测引物组、试剂盒及方法
WO2022217125A2 (en) * 2021-04-09 2022-10-13 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Isothermal amplification-based detection of shrimp pathogens
CN113897463B (zh) * 2021-11-29 2023-11-07 中国科学院合肥物质科学研究院 同时检测对虾wssv、ihhnv、ehp、shiv多重荧光pcr检测试剂盒及方法
CN115710605A (zh) * 2022-10-31 2023-02-24 宁波大学 用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007084499A2 (en) * 2006-01-13 2007-07-26 San Diego State University Disease control in shrimp
CN107868849A (zh) * 2017-12-01 2018-04-03 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） 检测对虾ihhnv病毒的引物组及其应用
CN108342511A (zh) * 2018-05-08 2018-07-31 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） 检测细胞肿大虹彩病毒的引物组及其应用
CN108842002A (zh) * 2018-07-13 2018-11-20 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） 检测白斑综合症病毒的引物组及其应用
CN110106283A (zh) * 2019-01-30 2019-08-09 宁波大学 一种水产养殖动物病毒的高通量定量检测试剂盒
CN110144417A (zh) * 2019-05-21 2019-08-20 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种检测凡纳滨对虾的ehp病原的引物及试剂盒和方法
CN110616272A (zh) * 2019-11-13 2019-12-27 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） 检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007084499A2 (en) * 2006-01-13 2007-07-26 San Diego State University Disease control in shrimp
CN107868849A (zh) * 2017-12-01 2018-04-03 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） 检测对虾ihhnv病毒的引物组及其应用
CN108342511A (zh) * 2018-05-08 2018-07-31 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） 检测细胞肿大虹彩病毒的引物组及其应用
CN108842002A (zh) * 2018-07-13 2018-11-20 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） 检测白斑综合症病毒的引物组及其应用
CN110106283A (zh) * 2019-01-30 2019-08-09 宁波大学 一种水产养殖动物病毒的高通量定量检测试剂盒
CN110144417A (zh) * 2019-05-21 2019-08-20 中国水产科学研究院黄海水产研究所 一种检测凡纳滨对虾的ehp病原的引物及试剂盒和方法
CN110616272A (zh) * 2019-11-13 2019-12-27 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） 检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Penaeus vannamei 18S ribosomal RNA gene, partial sequence";Tang,K.F.J.等;《GenBank》;19990923;参见AF186250.1全文 *
凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死综合征研究进展;蒋葛等;《动物医学进展》;20180420;第39卷(第4期);全文 *
南美白对虾4种病原体可视化快速检测试剂盒(生物芯片法)的研发;宋居易等;《江苏农业学报》;20200630;第36卷(第3期);全文 *
对虾白斑综合征病毒可视化环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法的建立;吴丽云;《渔业研究》;20191225;第41卷(第6期);全文 *
对虾白斑综合征病毒和传染性皮下及造血器官坏死病毒双重LAMP检测方法的建立和临床应用分析;张娜等;《水产科技情报》;20200320;第47卷(第2期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112048572A (zh) 2020-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112048572B (zh) 基于lamp技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒
CN110616272B (zh) 检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒
CN111394445B (zh) 用于斑鳢性别鉴定的Indel标记及应用
CN113186319B (zh) 检测鰤鱼诺卡氏菌的引物、试剂盒及方法
CN112011647B (zh) 一种lamp法检测水产病原用内参质控引物组及其应用
Mougin et al. Development of a mreB-targeted real-time PCR method for the quantitative detection of Vibrio harveyi in seawater and biofilm from aquaculture systems
CN114657264A (zh) 一种胡子鲇性别特异性分子标记引物及其应用
CN111850153B (zh) 检测对虾急性肝胰腺坏死病-副溶血弧菌的引物组及含有该引物组的试剂盒
CN113151430A (zh) 一种中国对虾雌性特异性引物及其应用
CN116694826A (zh) 一种同时检测wssv、ihhnv、ehp和nhp的多重pcr引物探针组合及方法
CN106868198B (zh) 一种同时检测鲇形目鱼类四种致病菌的多重pcr引物组及监测方法
CN113502334B (zh) 一种快速鉴定日本对虾遗传性别的分子标记c27449及其应用
CN112176080B (zh) 特异性检测剑麻紫色卷叶病植原体的巢式pcr引物组、试剂盒及检测方法
CN112094854B (zh) 一种检测中华鳖黄病毒的特异性引物、探针及试剂盒
CN110616279B (zh) 一种同步定量检测3种重要虾类病原的试剂盒
CN102108415B (zh) 狗鱼幼鱼弹状病毒反转录环酶恒温扩增检测方法和试剂盒
CN113403427B (zh) 一种反转录多重套式pcr检测引物
CN106636427B (zh) 一种鉴定脊尾白虾近交家系的微卫星标记引物及方法
CN105603097A (zh) 用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物及鉴定方法和应用
CN113337626B (zh) 检测对虾vpahpnd急性菌株和亚急性菌株的方法
CN112725459B (zh) 与中国对虾耐高pH相关的SNP标记的核心序列、引物及应用
CN113789370B (zh) 一种斑点叉尾鮰养殖池塘施肥方式的鉴别方法
CN101942507B (zh) 环介导恒温扩增技术快速检测链状亚历山大藻的方法
CN112226534B (zh) 用于检测新型冠状病毒增殖活动的引物组、试剂盒及其应用
CN113373244B (zh) 一种基于snp位点特异性引物延伸反应快速检测斑点叉尾鮰遗传性别的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant