CN115710605A - 用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列及其应用 - Google Patents

用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列及应用，特点是包括根据致急性肝胰腺坏死病弧菌的毒力基因PirA与PirB、虾肝肠胞虫的核糖体RNA序列分别设计一对引物序列和一条探针序列，其中用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirA的上下游及探针引物序列为SEQ ID NO.1～NO.3所示；用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirB的上下游及探针引物序列为SEQ ID NO.4～NO.6所示；用于检测虾肝肠胞虫的上下游及探针引物序列为SEQ ID NO.7～NO.9所示；优点是特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低和无假阴性结果。

Description

用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物 与探针序列及其应用
技术领域
本发明涉及对虾致病菌检测领域，尤其是涉及一种用于检测对虾高致病性副溶血弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列及其应用。
背景技术
急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreas necrosis disease，AHPND)是一种新出现的、危害极大的对虾疫病。该病爆发速度快、传播范围广，患病对虾死亡率可达90%以上，排塘率高达80%。目前，认为该病病原为一类含有特殊质粒的弧菌，称之为致急性肝胰腺坏死病，绝大多数报道是高致病性副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus, VPAHPND)。VPAHPND含有一个69 kb (PVA1)的质粒，能编码一种二元毒素pirA和pirB，该质粒能够在不同弧菌之间转移。pirA和pirB毒素蛋白被认为是引起AHPND的主要致病因子。肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei，EHP)也是近年来养殖对虾中常见的病害之一。感染该病原的对虾表现为生长缓慢、个体较小，一旦感染将很难清除，整塘虾个头参差不齐，也被认为是白便综合征的主要元凶之一。EHP属于微孢子虫科、肠胞虫属，主要感染对虾的肠道表皮及肝胰腺，可导致虾免疫力降低，继而引起继发感染，出现肠炎、组织坏死、红体等多种病症。上述两种病原也常伴随发生，导对虾养殖业造成了极大的经济损失。
针对上述对虾病原的检测，传统方法主要依赖于以显微技术为支撑的分离培养与形态观察。当前，以聚合酶链式反应（PCR）及其延伸出的多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术等，常被世界动物卫生组织（WOAH）推荐作为传统检测方法的有效补充。上述PCR等方法在对虾生物性疾病的临床检测中发挥了重要作用，但随着疫病复杂化等原因，这些方法体现出了明显的局限性，比如，这些方法需配备PCR仪、荧光定量PCR仪、凝胶成像系统等昂贵精密仪器，易接触到溴化乙锭(EB)等有毒物质，对检测人员的专业性要求较高。以重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)为代表的等温扩增技术，克服了热循环等造成的仪器的复杂程度，在微生物的即时快速检测中展示出一定的应用前景。尽管针对单一病原的快速检测技术得到了快速发展，病原的检测与鉴定越发变得快速和准确，但多病原的混合感染也已成为一种常态，多种病原针对同一宿主也可引起相似的症状或体征变化。在面对频繁出现的多病原混合感染时，单一病原检测方法重复性操作较多，检测过程冗余繁琐，费时费力，限制着检测的时效和工效，极易导致错过最佳预防或治疗时机。目前，国内外还没有公开用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列及其应用的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快，检测灵敏度和准确性高的用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列，根据致急性肝胰腺坏死病弧菌的毒力基因PirA与PirB、虾肝肠胞虫的核糖体RNA序列（SSU rRNA）分别设计一对引物序列和一条探针序列，其中用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirA的引物序列是：
上游引物VPAHPND-RPA-FA: CGTAGTGTAGACATTGAGAATACGGGACGTG；
下游引物VPAHPND-RPA-RA: CTGATGATAGAATGCATTATCAGGGCGTTG；
用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirA的探针序列是：
VPAHPND-RPA-PA: CTGGCGGCTGGAAAGTGGCTAAATCACATG/FAM-dT//THF/G/ BHQ1-dT/ACAACGTGATGAAAC/C3spacer/；
用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirB的引物序列是：
上游引物VPAHPND-RPA-FB: TACTCATTACTTGATTGGACTTGAAGAGAAC；
下游引物VPAHPND-RPA-RB: CGATACATCATCATAAAGCTTATCAATATTAC；
用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirB的探针序列是：
VPAHPND-RPA-PB: CAACTGTAAGTCTTCAAATTACTTACATGGC/FAM-dT//THF/G
/BHQ1-dT/GGTCTGGATTATAAG/C3spacer/；
用于检测虾肝肠胞虫的引物序列是：
上游引物EHP-RPA-F: AGCCATTGAGTTTGTTGAGAGTAGCGGAAC；
下游引物EHP-RPA-R: CTTAGTTTTCGGGCTCTGGGGATAGTACGC；
用于检测虾肝肠胞虫的探针序列是：
EHP-RPA-P:TAGAACTACAGCGGTGTCTAATCACTTTCGA/FAM-dT//THF/C/BQH-dT/CTAGCCTTCGTCCTTG/C3spacer/，其中，探针序列经过荧光基团（FAM）、淬灭基团（BHQ1）、核酸外切酶exo识别位点四氢呋喃（THF）以及3’端阻断物C3spacer修饰。
上述用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列的应用，具体检测步骤如下：
（1）微流控芯片的点制：首先将根据致急性肝胰腺坏死病弧菌的毒力基因PirA与PirB、虾肝肠胞虫的核糖体RNA序列（SSU rRNA）设计的三对引物依次点至芯片各反应池，并脱水处理，每个反应池内的引物包含检测靶标DNA序列对应的上游引物和下游引物终浓度各2 pmol；
（2）配置反应体系：反应体系各成分分别为：12 μL RPA反应缓冲液 (rehydrationbuffer)，1 μL 280 mM醋酸镁溶液(magnesium acetate)，1 μL的10 µM探针溶液，加双蒸水补足反应体系，1个单元所需的总体系为20 µL；
（3）微流控芯片上的RPA反应：将步骤（2）的反应体系与1 µL样品模板混合后，通过进样孔，一次性加入进芯片，将芯片放置在等温扩增微流控芯片核酸分析仪上，进行RPA反应，反应结果以荧光曲线的形式实时呈现，反应结束后由该仪器自行完成结果判定，其中阳性结果以“+”表示，阴性结果以“-”表示。
步骤（3）所述的RPA反应进行核酸扩增的温度为39 ℃，反应时间为20 min。依据上述序列，建成的等温扩增微流控芯片检测体系，优化的反应温度为39℃，反应时间20 min，达到的效果是以10copies/μL浓度下的致急性肝胰腺坏死病弧菌与虾肝肠胞虫的特异性靶标序列质粒标准品或同等病原浓度级别下基因组DNA为模板，可完成对致急性肝胰腺坏死病弧菌与虾肝肠胞虫的检测与鉴定。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1. 检测指标数多：本方法一次性可以检测并鉴定出致急性肝胰腺坏死病弧菌、虾肝肠胞虫两种对虾重要病原微生物；同时能够鉴别出致急性肝胰腺坏死病弧菌中毒力基因PirA与PirB的携带情况，有助于判断菌株致病力；
2.检测时间短：通过微流控芯片上进行的RPA反应，实现实时荧光即时检测，或反应结束后终点判读，实现对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的快速检测。DNA样本加入芯片后，整个扩增反应时间为20 min，大幅度提高了检测效率；
3. 灵敏度高：以致急性肝胰腺坏死病弧菌与虾肝肠胞虫的特异性靶标序列质粒标准品为模板，本方法可以检测到10copies/μL；以虾肝肠胞虫的基因组DNA为模板，本方法可以检测到0.1个虫体/μL的基因组DNA；
4. 特异性强：应用于致急性肝胰腺坏死病弧菌与虾肝肠胞虫检测/鉴定的引物序列均是根据各自物种的目标基因的不同保守区域设计，具有更强的特异性；同时，引入包含有荧光基团（FAM）、淬灭基团（BHQ1）、核酸外切酶exo识别位点四氢呋喃（THF）以及3’端阻断物C3spacer的1条特殊探针，提升了检测特异性；
5. 结果判断简单：可通过出现的荧光曲线实时判读结果，也可以借助仪器配套的人工智能判读软件判读；
6. 对人身和环境更加安全，检测过程中不涉及EB等有毒试剂。
综上所述，使用本发明的用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列，具有检测物种数和样本数多、操作简单快捷，高灵敏度和特异性等优势，有利于对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌与虾肝肠胞虫的即时检测和快速鉴定，可满足现场疫源地检测的需要。
附图说明
图1为等温扩增微流控芯片及相关检测设备，其中A：微流控芯片简图；B：微流控芯片分解图；C：微流控芯片详细视图及布局；D：微流控检测平台检测流程；
图2为用于VPAHPND-PirA等温扩增微流控芯片检测的引物和探针的特异性实验结果：NC：阴性对照；以含有毒力基因PirA和PirB的高致病性副溶血弧菌的gDNA (103 pg/μL)为模板；
图3为VPAHPND-PirB等温扩增微流控芯片检测的引物和探针的特异性实验结果：NC：阴性对照；以含有毒力基因PirA和PirB的高致病性副溶血弧菌的gDNA(103 pg/μL)为模板；
图4为虾肝肠胞虫等温扩增微流控芯片检测的引物和探针的特异性实验结果：NC：阴性对照；以虾肝肠胞虫的gDNA(103 pg/μL)为模板；
图5为用于致急性肝胰腺坏死病弧菌与虾肝肠胞虫等温扩增微流控芯片检测的引物和探针的灵敏度结果；将致急性肝胰腺坏死病弧菌的PirA/B重组质粒、虾肝肠胞虫的SSUrRNA重组质粒的DNA标准品稀释得到浓度分别为107-100 copies/μL的反应模板；将虾肝肠胞虫利用显微镜法计数后，提取基因组DNA标准品，并进行10倍梯度稀释，根据虫体的显微镜计数进行换算，分别得到103-10-2 个虫体/μL的反应模板。
图6为致急性肝胰腺坏死病弧菌与虾肝肠胞虫等温扩增微流控芯片检测方法的多指标同步检测的结果；测试时除了使用高致病性副溶血弧菌弧菌与虾肝肠胞虫的检测靶标重组质粒DNA之外，还选择了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）、白斑综合症病毒（WSSV），以及虾血细胞虹彩病毒（SHIV）三种对虾重要病原的检测靶标重组质粒DNA作为等温扩增微流控芯片检测的模板。TM1：选择VPAHPND、EHP、IHHNV、WSSV、SHIV5种病原的靶标序列重组质粒DNA以及阳性内对照PC混合后作为模板；TM2：选择VPAHPND、EHP两种病原的靶标序列重组质粒DNA以及阳性内对照PC混合后作为模板。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
等温扩增微流控芯片检测致急性肝胰腺坏死病弧菌与虾肝肠胞虫的方法的建立
1. 引物设计：根据致急性肝胰腺坏死病弧菌的两个毒力基因PirA与PirB的序列、虾肝肠胞虫的核糖体RNA序列（SSU rRNA）分别设计一对引物序列和一条探针序列，建立等温扩增微流控芯片检测体系，完成致急性肝胰腺坏死病弧菌与虾肝肠胞虫的检测，其中，用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirA的引物序列是：
上游引物VPAHPND-RPA-FA: CGTAGTGTAGACATTGAGAATACGGGACGTG；
下游引物VPAHPND-RPA-RA: CTGATGATAGAATGCATTATCAGGGCGTTG；
用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirA的探针序列是：
VPAHPND-RPA-PA: CTGGCGGCTGGAAAGTGGCTAAATCACATG/FAM-dT//THF/G/ BHQ1-dT/ACAACGTGATGAAAC/C3spacer/；
用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirB的引物序列是：
上游引物VPAHPND-RPA-FB: TACTCATTACTTGATTGGACTTGAAGAGAAC；
下游引物VPAHPND-RPA-RB: CGATACATCATCATAAAGCTTATCAATATTAC；
用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirB的探针序列是：
VPAHPND-RPA-PB: CAACTGTAAGTCTTCAAATTACTTACATGGC/FAM-dT//THF/G
/BHQ1-dT/GGTCTGGATTATAAG/C3spacer/；
用于检测虾肝肠胞虫的引物序列是：
上游引物EHP-RPA-F: AGCCATTGAGTTTGTTGAGAGTAGCGGAAC；
下游引物EHP-RPA-R: CTTAGTTTTCGGGCTCTGGGGATAGTACGC；
用于检测虾肝肠胞虫的探针序列是：
EHP-RPA-P: TAGAACTACAGCGGTGTCTAATCACTTTCGA/FAM-dT//THF/C/BQH-dT/
CTAGCCTTCGTCCTTG/C3spacer/。其中，探针序列经过荧光基团（FAM）、淬灭基团（BHQ1）、核酸外切酶exo识别位点四氢呋喃（THF）以及3’端阻断物C3spacer等修饰。
2. DNA的制备
利用血球计数板在显微镜下计数高致病性副溶血弧菌、虾肝肠胞虫的数量，取适量使用DNA提取试剂盒（Omega, Norcross, GA, USA）提取高致病性副溶血弧菌、虾肝肠胞虫等实验所用细菌的基因组DNA，将提取的DNA溶解于50 μL 双蒸水中，并使用Nanodrop2000分光光度计（Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）进行浓度测定。所得基因组DNA用作等温扩增微流控芯片扩增的模板，-30℃贮存备用。
以高致病性副溶血弧菌、虾肝肠胞虫的基因组DNA为模板，分别进行PCR扩增特异性靶标基因的部分片段，将扩增子克隆到pMD19-T Simple载体中（TaKaRa，中国大连）并进行测序（Sangon Biotech，中国上海）。重组质粒DNA使用质粒提取试剂盒I（Omega Bio-tek,Norcross, GA, USA）进行提取，并使用Nanodrop 2000分光光度计进行浓度测定。所得重组质粒标准品用作等温扩增微流控芯片扩增的模板，-30℃贮存备用。
3. 微流控芯片的设计与点制
使用的微流控芯片（由宁波爱基因科技有限公司提供）为蝶式芯片，直径为81 mm，厚度为2.5 mm。芯片的材质为聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)。芯片由两层组成，即芯片基板和热封膜，二者结合以形成集成和密封的腔室和通道。芯片分为八个相同的独立单元，每个单元配有一个进样孔、一个出风口、四个球阀和四个反应池（图 1）。反应池体积为5 μL。在芯片点制过程中，首先将选好的三对引物依次点至芯片各反应池，并脱水处理。每个反应池内的引物包含检测靶标DNA序列对应的上游引物和下游引物各2 pmol，以不含DNA的无菌水作为阴性对照。对芯片进行封膜，保证芯片的密闭性。
4. 配置反应体系：12 μL rehydration buffer（由潍坊安普未来生物科技有限公司提供），1 μL magnesium acetate (280 mM) （由潍坊安普未来生物科技有限公司提供），1 μL探针，加双蒸水补足反应体系，1个单元所需的总体系为20 µL。
5. 微流控芯片上的RPA反应：将上述反应体系与1 µL样品模板混合后，通过进样孔，一次性加入进芯片，将芯片放置在恒温扩增微流控芯片核酸分析仪(宁波爱基因科技有限公司)上，进行RPA反应。该仪器采用末端检测法进行荧光信号采集，反应结果以荧光曲线的形式实时呈现，反应结束后由该仪器自行完成结果判定，其中阳性结果以“+”表示，阴性结果以“-”表示。利用RPA反应进行核酸扩增的温度为39 ℃，反应时间为20 min。
具体实施例二
使用本发明的引物和探针进行对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌、虾肝肠胞虫等温扩增微流控芯片检测的特异性测定
采用上述具体实施例一的步骤2病原基因组DNA和重组质粒DNA的提取方法，提取对虾高致病性副溶血弧菌、虾肝肠胞虫、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）、白斑综合症病毒（WSSV），以及虾血细胞虹彩病毒（SHIV）的基因组DNA。利用设计的引物，分别以上述5种病原的基因组DNA为模板。其中，高致病性副溶血弧菌、虾肝肠胞虫的基因组DNA为103 pg/μL，病毒的重组质粒DNA为10-1 pg/μL。按上述具体实施例一的步骤3、4和5进行等温扩增微流体芯片反应，验证引物的特异性，蒸馏水作为阴性对照。结果如图2、3、4所示，致急性肝胰腺坏死病弧菌、虾肝肠胞虫的3对引物和探针，能够特异性的仅在使用对应靶标DNA时出现扩增，各引物和探针组合之间无交叉反应，使用IHHNV、WSSV，以及SHIV的DNA为模板时也没有明显扩增。同时发现一张芯片上，同个指标的阳性扩增时间基本趋于一致。
具体实施例三
使用本发明的引物进行对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌、虾肝肠胞虫等温扩增微流控芯片检测的灵敏度测定
采用上述具体实施例一的步骤2重组质粒DNA标准品的制备方法，制备对虾高致病性副溶血弧菌、虾肝肠胞虫靶标序列的重组质粒DNA标准品，并进行10倍梯度稀释，稀释获得的浓度分别为107-100 copies/μL。以稀释的各浓度为模板，按上述具体实施例一的步骤3、4和5进行等温扩增微流体芯片反应，确定其灵敏度。结果如图5所示，微流控芯片针对3个靶标序列的检测灵敏度均为10 copies/μL的重组质粒DNA。
采用上述具体实施例一的步骤2基因组DNA的制备方法，制备虾肝肠胞虫的基因组DNA标准品，并进行10倍梯度稀释，稀释获得的系列浓度，根据虫体的显微镜计数进行换算，分别为103-10-2 个虫体/μL。以稀释的各浓度为模板，按上述具体实施例一的步骤3、4和5进行等温扩增微流体芯片反应，确定本发明针对虾肝肠胞虫基因组DNA的检测灵敏度。结果如图5所示，微流控芯片针对虾肝肠胞虫的检测灵敏度为0.1个虫体/μL的基因组DNA。
具体实施例四
用本发明等温扩增微流控芯片技术进行多指标同步检测的测定。
采用上述具体实施例一的步骤2重组质粒DNA标准品的制备方法，制备对虾高致病性副溶血弧菌、虾肝肠胞虫靶标序列、IHHNV、WSSV，以及SHIV的重组质粒DNA标准品，并进行10倍梯度稀释。选择10倍灵敏度浓度，即102 copies/μL用于多指标同步检测。分为两个组合，组合1（TM1）：对虾高致病性副溶血弧菌、虾肝肠胞虫、IHHNV、SHIV、WSSV、PC（阳性内对照）和NC（阴性对照）；组合2（TM2）：对虾高致病性副溶血弧菌、虾肝肠胞虫、PC和NC。混合后的DNA为模板，依据具体实施例一步骤4和步骤5，进行微流控芯片检测。结果如图6所示，在模板浓度为10倍芯片灵敏度浓度的条件下，各模板间未出现互相干扰的情况，两组样本均能获得预期的扩增。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列，其特征在于根据致急性肝胰腺坏死病弧菌的毒力基因PirA与PirB、虾肝肠胞虫的核糖体RNA序列分别设计一对引物序列和一条探针序列，其中用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirA的引物序列是：
上游引物VPAHPND-RPA-FA: CGTAGTGTAGACATTGAGAATACGGGACGTG；
下游引物VPAHPND-RPA-RA: CTGATGATAGAATGCATTATCAGGGCGTTG；
用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirA的探针序列是：
VPAHPND-RPA-PA: CTGGCGGCTGGAAAGTGGCTAAATCACATG/FAM-dT//THF/G/ BHQ1-dT/ACAACGTGATGAAAC/C3spacer/；
用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirB的引物序列是：
上游引物VPAHPND-RPA-FB: TACTCATTACTTGATTGGACTTGAAGAGAAC；
下游引物VPAHPND-RPA-RB: CGATACATCATCATAAAGCTTATCAATATTAC；
用于检测致急性肝胰腺坏死病弧菌毒力基因PirB的探针序列是：
VPAHPND-RPA-PB: CAACTGTAAGTCTTCAAATTACTTACATGGC/FAM-dT//THF/G
/BHQ1-dT/GGTCTGGATTATAAG/C3spacer/；
用于检测虾肝肠胞虫的引物序列是：
上游引物EHP-RPA-F: AGCCATTGAGTTTGTTGAGAGTAGCGGAAC；
下游引物EHP-RPA-R: CTTAGTTTTCGGGCTCTGGGGATAGTACGC；
用于检测虾肝肠胞虫的探针序列是：
EHP-RPA-P: TAGAACTACAGCGGTGTCTAATCACTTTCGA/FAM-dT//THF/C/BQH-dT/
CTAGCCTTCGTCCTTG/C3spacer/。
2.根据权利要求1所述的用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列的应用，其特征在于具体检测步骤如下：
（1）微流控芯片的点制：首先将根据致急性肝胰腺坏死病弧菌的毒力基因PirA与PirB、虾肝肠胞虫的核糖体RNA序列设计的三对引物依次点至芯片各反应池，并脱水处理，每个反应池内的引物包含检测靶标DNA序列对应的上游引物和下游引物终浓度各2 pmol；
（2）配置反应体系：反应体系各成分分别为：12 μL RPA反应缓冲液，1 μL 280 mM醋酸镁溶液，1 μL的10 µM探针溶液，加双蒸水补足反应体系，1个单元所需的总体系为20 µL；
（3）微流控芯片上的RPA反应：将步骤（2）的反应体系与1 µL样品模板混合后，通过进样孔，一次性加入进芯片，将芯片放置在等温扩增微流控芯片核酸分析仪上，进行RPA反应，反应结果以荧光曲线的形式实时呈现，反应结束后由该仪器自行完成结果判定，其中阳性结果以“+”表示，阴性结果以“-”表示。
3.根据权利要求2所述的用于检测对虾致急性肝胰腺坏死病弧菌及虾肝肠胞虫的引物与探针序列的应用，其特征在于步骤（3）所述的RPA反应进行核酸扩增的温度为39 ℃，反应时间为20 min。
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CN106636471A (zh) * 2017-01-16 2017-05-10 山东省海洋生物研究院 同时检测对虾wssv、ahpnd、ehp、ihhnv的多重pcr检测方法和试剂盒
CN112048572A (zh) * 2020-09-17 2020-12-08 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） 基于lamp技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒
CN113234814A (zh) * 2021-06-29 2021-08-10 江苏海洋大学 一种用于同时检测虾急性肝胰腺坏死症和肝肠孢子虫的多重rpa引物和探针组合物及检测方法
CN115044691A (zh) * 2022-07-14 2022-09-13 湛江海关技术中心 用于对虾急性肝胰腺坏死病和肝肠胞虫的检测的引物探针组合、试剂盒及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (3)

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