CN101974621B - 一种牛巴贝斯虫lamp检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种牛巴贝斯虫的LAMP检测方法，通过被检标本DNA提取、设置LAMP检测试剂盒、LAMP扩增、扩增产物分析，通过被检标本出现的颜色变化与阳性对照和阴性对照比对判定。本发明提供的方法，可非常方便快速、准确地检测出被检标本中的牛巴贝斯虫，也可用于牛巴贝斯虫的分子流行病学调查及疗效监测。本方法的模板制备步骤简单费用低，并能提高检测方法的特异性及敏感性。通过加入适量SYBR GREEN I染料即可通过肉眼观测结果，仪器要求简单，耗时短，结果判定简单，特异性和灵敏度高，可满足临床检测的需要，前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术，尤其涉及牛巴贝斯虫LAMP检测方法。
背景技术
牛巴贝斯虫是一类经蜱传播，红细胞内寄生的原虫，属于复顶亚门，由该类寄生虫引起的巴贝斯虫病，在世界上许多地区发生和流行，我国各地也常有发生，给畜牧业和国民经济造成巨大损失。牛感染该虫后，常出现贫血、发热、血红蛋白尿、共济失调等症状，严重时引起死亡。该病已经造成了巨大的经济损失，并呈范围扩大趋势，因而引起国内外学者的广泛关注。目前，血液样品的血涂片镜检技术仍是诊断牛巴贝斯虫病最合适的方法，但是该方法具有很大的一个缺点-低敏感性，因此不能应用于外周血内寄生虫含量很低动物以及感染耐过后的带虫动物的检测。血清学检查也是牛巴贝斯虫流行病学研究行之有效的方法，但是该类方法不能区别动物是正处于感染中还是已经感染耐过，不能鉴定带虫动物以及贮存宿主。而且在检测牛的巴贝斯虫病过程中发现，牛巴贝斯虫与双芽巴贝斯虫之间常出现交叉反应。敏感性更高的方法，例如常规PCR检测技术、反向线性斑点杂交技术(RBL)以及PCR-ELISA等也已经见诸于报道，但是这些方法存在假阳性率高的缺点。另外，出于经济和实际应用等原因，大部分方法并不适合于流行病学的实验室诊断，尤其是实时定量PCR技术，必须使用较昂贵的实验条件以及需要较高的专业技术，而且由于PCR仪需处于高温度、高湿度，甚至多灰尘的环境中，往往使得结果缺乏稳定性和规律性。基于DNA水平的分子诊断，其敏感性与靶基因扩增的数目是息息相关的。因此选择一个在基因组中高拷贝数的基因作为靶基因将会大大提高现有PCR方法的敏感性。Salem等报道，他们在利用细胞色素b基因作为靶基因建立的PCR方法检测牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫时发现，该方法要比利用18SrRNA作为靶基因建立的方法灵敏20％。本研究根据LAMP的基本原理，针对B.bovis的细胞色素b为靶基因的6个特异性区域，结合其它巴贝斯虫cytb基因的相关信息，设计4条特异性引物，建立一种简便、高效、实用的DNA检测方法。该方法可用于牛巴贝斯虫病现场快速检测，应用前景广阔。
发明内容
本发明提供一种牛巴贝斯虫的LAMP检测方法，通过以下技术方案实现：
(1)被检标本DNA提取：取200μl无菌抗凝血液，Trizol试剂裂解后常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，4℃保存备用；
(2)设置LAMP检测试剂盒：由Dof管、阳性对照、阴性对照、Bst DNA聚合酶、SYBR GREEN I染料、dNTP、甜菜碱、10×LAMP Buffer组成；
(3)LAMP扩增：在Dof管中加入处理后的标本DNA，同时设阴、阳性对照，每管反应体系为：1mmol/L FIP，1mmol/L BIP，0.2mmol/L F3，0.2mmol/LB3，4mmol/L MgSO4，0.8mmol/L dNTP，0.8mmol/L betaine，10×LAMP Buffer，1μLDNA模板；加入8U Bst DNA聚合酶大片段，混匀后稍离心；置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：62℃水浴反应60min，接着80℃终止5min；
(4)扩增产物分析：将扩增产物中加入1∶10稀释的SYBR GREEN I(10000×)1μL，肉眼观察颜色变化，被检标本出现的颜色变化与阳性对照和阴性对照比对，以判定标本为牛巴贝斯焦虫阳性或阴性。
所述步骤(2)中Dof管含10×LAMP Buffer、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP及MgSO4。引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP分别是按下述碱基序列由DNA合成仪合成的DNA片段：
引物F3 5’＞GGTTGGGCAATGCGTTAT＜3’
引物B3 5’＞TGTCCGTAAGGAAGAACAT＜3’
引物FIP 5’＞CACAATCCCTTTAGCATATGTAGCA
GGGCCCTTTCACGCTCAATGTGTTTC＜3’
引物BIP 5’＞GTACTCAAGCAGATATCTACCATGGGG
GCCCAACCTAAGAAAGCAATAGCCATA＜3’
所述步骤(3)中阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，所述阴性对照为双重蒸馏水。
发明的优点是提供了一种检测牛巴贝斯虫的标准方法，可快速、准确地检测出被检标本中的牛巴贝斯虫，也可用于牛巴贝斯虫的分子流行病学调查及疗效监测。本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，常规的方法需经溶菌酶、蛋白酶K、SDS(十二烷基硫酸钠)、CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)等试剂处理，时间长费用高。本方法检测非常方便快捷，并能提高检测方法的特异性及敏感性。通过加入适量SYBR GREEN I染料即可通过肉眼观测结果，反应体系呈绿色为阳性，橙色则为阴性，同时该方法成本低廉，仪器要求简单，耗时短，结果判定简单，特异性和灵敏度高，可满足临床检测的需要，前景广阔
附图说明
图1为本发明方法获得的产物加入适量SYBR GREEN I染料通过肉眼观测结果。
图2为应用本发明进行牛巴贝斯虫病的流行病学调查结果。
具体实施例
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例一
设置LAMP检测试剂盒，该试剂盒包括：
(1)Dof管：反应管内含10×LAMP Buffer、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP及MgSO4。引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP分别是按下述碱基序列由DNA合成仪合成的DNA片段：
引物F3 5’＞GGTTGGGCAATGCGTTAT＜3’
引物B3 5’＞TGTCCGTAAGGAAGAACAT＜3’
引物FIP 5’＞CACAATCCCTTTAGCATATGTAGCA
GGGCCCTTTCACGCTCAATGTGTTTC＜3’
引物BIP 5’＞GTACTCAAGCAGATATCTACCATGGGG
GCCCAACCTAAGAAAGCAATAGCCATA＜3’
(2)阳性对照：该对照为含有目的基因片段的重组质粒，构建方法是：将扩增产物克隆至pUCm-T转化DH5-α感受态细胞，经酶切鉴定及测序后获得阳性重组质粒，该质粒含牛巴贝斯虫1092bp基因片段。
(3)阴性对照，该对照为双重蒸馏水；
(4)Bst DNA聚合酶；
(5)SYRB GREEN I染料；
(6)甜菜碱溶液(10M)。
实施例二
1.标本的采集：严格无菌采集可疑病牛的血样不少于500μl，4℃或冷冻保存；
2.被检标本DNA提取：取200μl无菌抗凝血液，加入100μl Trizol试剂，充分混匀后加入等体积的Tris饱和酚/氯仿混合液抽提，上清用2倍体积的无水乙醇沉淀2小时，70％的乙醇洗涤后干燥，沉淀用10-20μl TE缓冲液溶解后，4℃保存备用；
3.参照实施例一设置LAMP检测试剂盒；
4.LAMP扩增：在Dof管中加入处理后的标本DNA，同时设阴、阳性对照，每管反应体系为：1mmol/L FIP，1mmol/L BIP，0.2mmol/L F3，0.2mmol/LB3，4mmol/L MgSO4，0.8mmol/L dNTP，0.8mmol/L betaine，10×LAMP Buffer，1μLDNA模板。加入8U Bst DNA聚合酶大片段，混匀后稍离心。置水浴锅中进行扩增，扩增条件为：62℃水浴反应60min，接着80℃终止5min。
5.扩增产物分析：将扩增产物中加入1∶10稀释的SYBRGREEN I(10000×)1μL，肉眼观察颜色变化，被检标本出现的颜色变化与阳性对照和阴性对照比对，以判定标本为牛巴贝斯虫阳性或阴性。结果参见图1，其中1为阳性对照，6为阴性对照，2为被检标本阳性，3、4、5为被检样标本阴性。
实施例三
方法基本同实施例一，随机无菌采集牛血样，提取DNA，LAMP方法扩增，电泳观察。结果参见图2，其中1为阳性对照，2为阴性对照，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19、20、21、22、23、24为被检标本阴性，16为被检标本阳性。阳性率为4.55％。
Claims (1)
1.一种牛巴贝斯虫LAMP检测用试剂盒，其特征在于，该试剂盒由Dof管、阳性对照、阴性对照、Bst DNA聚合酶、SYBR GREEN I染料、10M甜菜碱溶液组成，其中Dof管含10×LAMP缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、引物F3、引物B3、引物FIP、引物BIP及MgSO4，所述引物序列为：
引物F3：5’-GGTTGGGCAATGCGTTAT-3’
引物B3：5’-TGTCCGTAAGGAAGAACAT-3’
引物FIP：
5’-CACAATCCCTTTAGCATATGTAGCAGGGCCCTTTCACGCTCAATGTGTTTC-3’
引物BIP：
5’-GTACTCAAGCAGATATCTACCATGGGGGCCCAACCTAAGAAAGCAATAGCCATA-3’
所述阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，所述阴性对照为双重蒸馏水。
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