CN102337342B

CN102337342B - 用于诊断和鉴别牛巴贝斯虫种类的试剂盒及制备方法

Info

Publication number: CN102337342B
Application number: CN 201110324308
Authority: CN
Inventors: 罗建勋; 殷宏; 刘爱红; 关贵全; 刘军龙; 刘志杰; 杨吉飞; 李有全; 马米玲; 任巧云; 牛庆丽
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2011-10-21
Filing date: 2011-10-21
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2031-10-21
Also published as: CN102337342A

Abstract

本发明公开一种用于检测被检牛只是否感染牛巴贝斯虫、区分感染何种巴贝斯虫的检测试剂盒，以及这种试剂盒的制备方法和使用方法。本发明的诊断和鉴别牛巴贝斯虫种类的试剂盒中包括有SQL №1至SQL №20共二十个牛的巴贝斯虫特异引物。

Description

用于诊断和鉴别牛巴贝斯虫种类的试剂盒及制备方法

技术领域

本发明涉及一种动物寄生虫的检测鉴别技术，确切讲本发明用于检测被检牛只是否感染牛巴贝斯虫的检测试剂盒，以及这种试剂盒的制备方法和使用方法。

背景技术

巴贝斯虫病(Babesiosis)又称蜱传热，红尿热等，是由媒介蜱传播的巴贝斯科巴贝斯属的多种巴贝斯虫寄生于牛、羊、马、犬及其它野生动物红细胞内所引起的疾病的总称，临床上多以发热、贫血、黄疸、血红蛋白尿和死亡为主要特征，严重威胁着畜牧业的发展(McCosker PJ.The global importance ofbabesiosis.In：Ristic M and kreier J.P(editors)，Babesiosis.New York：Academic Press，1981，pp1-24.)。由于本类疾病均以蜱为传播媒介，一旦传入，要消灭它便极为困难，往往成为地方流行性疾病而长期存在，因而传染病控制水平较高的国家十分重视血液原虫病的研究。鉴于本类疾病危害严重，国际兽医局(OIE)国际委员会于1985年通过议案，建议各成员国加强蜱传性血液原虫病的协作研究，建立国际性防制措施，以减少经济损失。我国是世界上巴贝斯虫病流行最严重的国家之一(Yin H，Lu WS，Luo JX.Babesiosis in China.Tropical Animal Health and Production，1997，29：11S-15S.)，目前已有十多个省(区)报道有本病的存在，且潜伏的病原种类较为复杂，已知感染黄牛的主要病原有5种，即，牛巴贝斯虫(Babesia bovis)、双芽巴贝斯虫(B.bigemina)、卵形巴贝斯虫(B.ovata)、大巴贝斯虫(B.major)和牛巴贝斯虫未定种(B.U.sp)。本病在我国分布广泛、致病力强、危害严重。遗憾的是，截至目前，全球还没有一个国家完全消灭和根治牛巴贝斯虫病。由于不同的病原其传播媒介也不同，故其病原的致病性也不一样，其中牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫由牛蜱属的微小牛蜱传播；卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫则由血蜱属的蜱传播；而牛巴贝斯虫未定种则由我国北方广泛分布的璃眼蜱属的蜱传播。目前所公认，牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫的致病性最强，危害最为严重，且两种病原常呈混合感染状态，卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种的致病性较弱，该病对畜牧业造成重大的经济损失和严重影响人类健康。

牛巴贝斯虫病对养牛业则造成了巨大的经济损失(McCosker，1981)，由于巴贝斯虫传播的特性和血液原虫疫苗研究的滞后性，对于巴贝斯虫病的预防至今还没有一种很好的实用方法，因此感染初期的诊断就显得尤为重要。目前，牛巴贝斯虫病的诊断主要有下列几种手段：(1)血液样品的血涂片镜检技术，(2)血清学检查，如：补体结合试验(CFT)、间接荧光抗体试验(IFAT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等，(3)分子检测技术，如常规PCR检测技术、反向线性斑点杂交技术(RBL)以及PCR-一ELISA等。但是这些方法都具有同一个不可避免的缺点——需要先进的仪器和专业培训的技术人员，而且检测中耗时较多。因此，为控制牛巴贝斯虫病在我国的大规模爆发，建立一种简单可靠、敏感性高的分子生物学诊断方法是必要的，尤其是早期诊断。故在我国对本病进行及时的鉴别诊断和有效控制是相当必要的。

中国发明专利申请201110041865.9和200910005006.7分别公开了一种用于检测巴贝斯虫的试剂盒及检测方法，但这些技术只能对用于检测某一特定各类的巴贝斯虫。截至目前，在我国已发现的感染黄牛的巴贝斯虫共五个种，即，牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和牛巴贝斯虫未定种，但至今没有任何一种方法能完全区分开这五个种，特别是在发生混合感染时。由于其病原形态接近，有些媒介蜱也相同，用传统分类学对病原进行分类就遇到一些难以解决的问题。因此，建立一种有效的分子生物学方法，鉴别诊断牛巴贝斯虫病的不同病原在临床与研究中有着特殊意义，但现阶段尚无一种简单有效的手段。

发明内容

本发明提供一种能快速鉴别诊断我国已经发现的五种牛巴贝斯虫，即，牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和牛巴贝斯虫未定种的LAMP检测试剂盒，同时提供这种试剂盒的使用方法。该发明依据牛梨形虫核糖体18S rRNA和转录间隔区ITS两种苷酸序列设计特异性引物，建立能分别检测与区分这五种寄生虫的LAMP方法，本发明的试剂盒及使用方法可准确地检测与区分我国五种牛的巴贝斯虫，填补这一领域的空白。该方法具有敏感性高、特异性强、诊断迅速等诸多优点，且与别的梨形虫没有交叉反应，其所检测的五种牛巴贝斯虫敏感性分别在10^-5-10^-6之间。同时可克服现有技术的不足，无需复杂的仪器，操作技术简单快速，不需要复杂的操作系统，可以在普通实验室条件下实施检测。

本发明用于诊断和鉴别牛巴贝斯虫种类的试剂盒中包括有如下十四对牛的巴贝斯虫特异引物：

1)两对牛巴贝斯虫特异引物分别为，

BbF3：CACTAGCACCACACCAGTG(SQL №1)，

BbB3：CAAAAGGGGGTGCATCTCG(SQL №2)，

BbFIP：GCGTTGCTAGTAGTGGCACCGGAATTCCAGCTTCCACCCAACGAG(SQL №3)，

BbBIP：GCTACCCTAGTAGCCGGTTGGGGAATTCGAGCTTAACCCGGGTCGT(SQL №4)；

2)两对双芽巴贝斯虫特异引物分别为，

BbiF3：ACTTGCAGACTTCTGCGATT(SQL №5)，

BbiB3：AGAAATTGGGGCGACAAGG (SQL №6)，

BbiFIP：CAGGATTGGGGGCTCACTGAAAGAATTCGTAACAAACACACCGCCTCT(SQL №7)，

BbiBIP：GGCCCCGGCCCATTTATAACGGAATTCAGGAGCACGGACACATTCA(SQL №8)；

3)两对卵形巴贝斯虫特异引物分别为：

BoF3：AAGGACGCAGCGAATTGC(SQL №9)，

BoB3：AAAACGACGCCCAATCGC(SQL №10)，

BoFIP：GAGCAGAGGCGGTGTGTTTGTTGAATTCACGCAGTATGACTTGCAGAC(SQL№11)，

BoBIP：GAGCAGAGGCGGTGTGTTTGTTGAATTCACGCAGTATGACTTGCAGAC(SQL №12)；

4)两对大巴贝斯虫特异引物分别为：

BmF3：CCACCGGGTCTAGTCTAGG(SQL №13)，

BmB3：CAACGGAGGGGTAGGAGAG(SQL №14)，

BmFIP：CGTCAAAACCCGGCAGGTCAGAATTCGAGCCTGTGTCCAAATCTCG(SQL №15)，

BmBIP：CATGTTTCCCACTGCAACGTGCGAATTCAACGGCCTGGAATGGAATC(SQL №16)；

5)两对牛巴贝斯虫未定种特异引物分别为：

BUF3：GCTCGCACGCGGTACT(SQL №17)，

BUB3：CGCAAACCGCACAAACC(SQL №18)，

BUFIP：AGACGACGCCCACTCGCGAGAATTCCGTTTCAGTGAGCAGCTTGT(SQL №19)，

BUBIP：AGACGACGCCCACTCGCGAGAATTCCGTTTCAGTGAGCAGCTTGT(SQL №20)。

为方便鉴别区分工作，本发明的试剂盒内最好有如下内容：

a)标准牛巴贝斯虫阳性基因组DNA；

b)标准牛双芽巴贝斯虫阳性基因组DNA；

c)标准牛卵形巴贝斯虫阳性基因组DNA；

d)标准牛大巴贝斯虫阳性基因组DNA；

e)标准牛巴贝斯虫未定种阳性基因组DNA；

f)标准牛环形泰勒虫阳性基因组DNA；

g)标准牛瑟氏泰勒虫阳性基因组DNA；

h)标准牛中华泰勒虫阳性基因组DNA；

i)标准牛边虫阳性基因组DNA；

j)标准巴贝斯虫阴性牛基因组DNA；

k)灭菌超纯水；

l)LAMP反应缓冲液；

m)DNA聚合酶；

在试剂盒中的各特异引物可以是混合物，即：

1)由40pmol的BbFIP和BbBIP，5pmol的BbF3和BbB3组成的牛巴贝斯虫特异引物混合物；

2)由40pmol的BbiFIP和BbiBIP，5pmol的BbiF3和BbiB3组成的牛双芽巴贝斯虫特异引物混合物；

3)由40pmol的BoFIP和BoBIP，5pmol的BoF3和BoB3组成的牛卵形巴贝斯虫特异引物混合物；

4)由40pmol的BmFIP和BmBIP，5pmol的BmF3和BmB3组成的牛大巴贝斯虫特异引物混合物；

5)由40pmol的BUFIP和BUBIP，5pmol的BUF3和BUB3组成的牛巴贝斯虫未定种特异引物混合物；

本发明试剂盒的使用方法是首先从待检牛只静脉采血，提取血样的基因组DNA。将此基因组DNA与DNA聚合酶、缓冲液、灭菌超纯水以及牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和牛巴贝斯虫未定种特异引物混合物按比例混合均匀，扩增后立刻灭活，取扩增产物以TAE为缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶中，在75伏电压下电泳检测，根据特定泳道是否出现特异性电泳带型得出被检牛只是否患有牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫或牛巴贝斯虫未定种。

本发明鉴别诊断五种牛的巴贝斯虫的检测方法是：以牛巴贝斯虫核糖体RNA内转录间隔区基因为靶基因，利用专用软件设计出五种牛的巴贝斯虫的特异性LAMP引物，待检动物采血提取基因组DNA，将所得DNA分别与反应缓冲液、灭菌超纯水、五种牛的巴贝斯虫特异性引物反应混合物及DNA聚合酶混匀，进行扩增，扩增产物灭活后加入上样缓冲液，再置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳检测，根据电泳后是否出现特定带型即可得出被检动物是否感染五种牛的巴贝斯虫中的任何一种。

在本发明的检测方法中所用的上样缓冲液为：0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青，40％蔗糖水溶液，所用的含溴化乙锭的琼脂糖凝胶为由0.04M Tris-乙酸和0.001M EDTA组成的TAE缓冲液配制的2％琼脂糖(0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯青、40％蔗糖水溶液和2％琼脂糖为质量/体积比，即g/v；0.04M Tris-乙酸和0.001M EDTA为摩尔浓度)，其中含0.5μg/mL的溴化乙锭。

本发明实际上是一种采用环介导的恒温扩增技术的检测方法(LAMP)，这种方法是日本科学家Notomi T.等于2000年发明的敏感性很高的DNA扩增技术(Loop-mediated isotheral amplification method，LAMP)(Notomi，T.，Okayama，H.，Masubuchi，H.，Yonekawa，T.，Watanabe，K.，Amino，N.，Hase，T.，2000.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Research 28，E63.)。采用本发明的方法鉴别诊断五种牛的巴贝斯虫时不需要复杂的仪器设备，只需要常规的水浴锅就可以完成检测，可在普通的实验室进行，而且可得到具有高敏感性的检测结果。

附图说明

图1：牛巴贝斯虫LAMP引物的特异性扩增电泳图，图中：M，标准DNAMarker2000；1，牛巴贝斯虫；2，牛双芽巴贝斯虫；3，牛卵形巴贝斯虫；4，牛大巴贝斯虫；5，牛巴贝斯虫未定种；6，牛环形泰勒虫；7，瑟氏泰勒虫；8，中华泰勒虫，9，牛基因组DNA；10，巴贝斯虫阴性牛基因组DNA；11，灭菌超纯水。

图2：牛双芽巴贝斯虫LAMP引物的特异性扩增电泳图，图中：M，标准DNAMarker2000；1，牛双芽巴贝斯虫；2，牛巴贝斯虫；3，牛卵形巴贝斯虫；4，牛大巴贝斯虫；5，牛巴贝斯虫未定种；6，牛环形泰勒虫；7，瑟氏泰勒虫；8，中华泰勒虫，9，牛边虫阳性基因组DNA；10，巴贝斯虫阴性牛基因组DNA；11，灭菌超纯水。

图3：牛卵形巴贝斯虫LAMP引物的特异性扩增电泳图，图中：M，标准DNAMarker2000；1，牛卵形巴贝斯虫；2，牛巴贝斯虫；3，牛双芽巴贝斯虫；4，牛大巴贝斯虫；5，牛巴贝斯虫未定种；6，牛环形泰勒虫；7，瑟氏泰勒虫；8，中华泰勒虫，9，牛边虫阳性基因组DNA；10，巴贝斯虫阴性牛基因组DNA；11，灭菌超纯水。

图4：牛大巴贝斯虫LAMP引物的特异性扩增电泳图，图中：M，标准DNAMarker2000；1，牛大巴贝斯虫；2，牛巴贝斯虫；3，牛双芽巴贝斯虫；4，牛卵形巴贝斯虫；5，牛巴贝斯虫未定种；6，牛环形泰勒虫；7，瑟氏泰勒虫；8，中华泰勒虫，9，牛边虫阳性基因组DNA；10，巴贝斯虫阴性牛基因组DNA；11，灭菌超纯水。

图5：牛巴贝斯虫未定种LAMP引物的特异性扩增电泳图，图中：M，标准DNA Marker2000；1，牛巴贝斯虫未定种；2，牛巴贝斯虫；3，牛双芽巴贝斯虫；4，牛卵形巴贝斯虫虫；5，牛大巴贝斯；6，牛环形泰勒虫；7，瑟氏泰勒虫；8，中华泰勒虫，9，牛边虫阳性基因组DNA；10，巴贝斯虫阴性牛基因组DNA；11，灭菌超纯水。

具体实施方式

以下提供本发明的具体实施方式。

本发明的诊断和鉴别牛巴贝斯虫的试剂盒所使用的引物及试剂如下：

1)特异引物

牛巴贝斯虫引物：

BbF3：CACTAGCACCACACCAGTG(SQL №1)

BbB3：CAAAAGGGGGTGCATCTCG(SQL №2)

BbFIP：GCGTTGCTAGTAGTGGCACCGGAATTCCAGCTTCCACCCAACGAG(SQL №3)

BbBIP：GCTACCCTAGTAGCCGGTTGGGGAATTCGAGCTTAACCCGGGTCGT(SQL №4)

双芽巴贝斯虫：

BbiF3：ACTTGCAGACTTCTGCGATT(SQL №5)

BbiB3：AGAAATTGGGGCGACAAGG(SQL №6)

BbiFIP：CAGGATTGGGGGCTCACTGAAAGAATTCGTAACAAACACACCGCCTCT(SQL №7)

BbiBIP：GGCCCCGGCCCATTTATAACGGAATTCAGGAGCACGGACACATTCA(SQL №8)

卵形巴贝斯虫：

BoF3：AAGGACGCAGCGAATTGC(SQL №9)

BoB3：AAAACGACGCCCAATCGC(SQL №10)

BoFIP：GAGCAGAGGCGGTGTGTTTGTTGAATTCACGCAGTATGACTTGCAGAC(SQL №11)

BoBIP：GAGCAGAGGCGGTGTGTTTGTTGAATTCACGCAGTATGACTTGCAGAC(SQL №12)

大巴贝斯虫：

BmF3：CCACCGGGTCTAGTCTAGG(SQL №13)

BmB3：CAACGGAGGGGTAGGAGAG(SQL №14)

BmFIP：CGTCAAAACCCGGCAGGTCAGAATTCGAGCCTGTGTCCAAATCTCG(SQL №15)

BmBIP：CATGTTTCCCACTGCAACGTGCGAATTCAACGGCCTGGAATGGAATC(SQL №16)

牛巴贝斯虫未定种：

BUF3：GCTCGCACGCGGTACT(SQL №17)

BUB3：CGCAAACCGCACAAACC(SQL №18)

BUFIP：AGACGACGCCCACTCGCGAGAATTCCGTTTCAGTGAGCAGCTTGT(SQL №19)

BUBIP：AGACGACGCCCACTCGCGAGAATTCCGTTTCAGTGAGCAGCTTGT(SQL №20)

2)牛巴贝斯虫特异性引物反应混合物(40pmol的BbFIP和BbBIP，5pmol的BbF3和BbB3)。

3)牛双芽巴贝斯虫特异性引物反应混合物(40pmol的BbiFIP和BbiBIP，5pmol的BbiF3和BbiB3)。

4)牛卵形巴贝斯虫特异性引物反应混合物(40pmol的BoFIP和BoBIP，5pmol的BoF3和BoB3)。

5)牛大巴贝斯虫特异性引物反应混合物(40pmol的BmFIP和BmBIP，5pmol的BmF3和BmB3)。

6)牛巴贝斯虫未定种特异性引物反应混合物(40pmol的BUFIP和BUBIP，5pmol的BUF3和BUB3)。

7)2×LAMP反应缓冲液(40mM Tris-HCl(pH 8.8)，20mM KCl，16mM MgSO₄，20mM(NH4)₂SO₄，0.2％Tween 20，1.6M betaine和2.5mM dNTP)。

8)Bst DNA聚合酶(MO275L，BioLabs)。

9)标准牛巴贝斯虫阳性基因组DNA；

10)标准牛双芽巴贝斯虫阳性基因组DNA；

11)标准牛卵形巴贝斯虫阳性基因组DNA；

12)标准牛大巴贝斯虫阳性基因组DNA；

13)标准牛巴贝斯虫未定种阳性基因组DNA；

14)标准牛环形泰勒虫阳性基因组DNA；

15)标准牛瑟氏泰勒虫阳性基因组DNA；

16)标准牛中华泰勒虫阳性基因组DNA；

17)标准牛边虫阳性基因组DNA；

18)标准巴贝斯虫阴性牛基因组DNA；

19)灭菌超纯水

20)6×上样缓冲液(0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青，40％蔗糖水溶液)。

21)1×TAE缓冲液(0.04M Tris-乙酸，0.001M EDTA)。

22)2％琼脂糖(用1×TAE缓冲液配制)

其具体的检测操作方法如下：

(一)感染牛的五种巴贝斯虫，即，牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫和牛巴贝斯虫未定种血液的获得：

用液氮中保存的含虫血液分别接种五只实验动物，当染虫率达到5％以上时，以20％枸橼酸钠为抗凝剂，静脉采血，将所采血液4℃条件下2500rpm离心10分钟，弃去上清，尽量将白细胞吸弃。用2％枸橼酸钠洗涤三次(同上2500rpm离心10分钟)，最后将上清去掉，红细胞分装入1.5ml离心管中，-20℃保存。

(二)巴贝斯虫阴性牛血的获得

采集经血涂片检查和PCR检测阴性的牛的静脉血，同上处理。

(三)从血液中提取基因组的方法：

a)加900μl BRC Cell Lysis Solution于盛300μl血液的1.5ml离心管中，颠倒10次，在室温下放置到液体澄清透明。

b)3000g离心3分钟，弃上清，保留下面的可见的白色沉淀和大约10～20μl液体，涡旋20秒。

c)每管中加入300μl Cell Lysis Solution，吹打混匀。

d)加入100μl Protein Preciptation Solution。

e)蜗旋20秒，至出现棕褐色沉淀颗粒。13000g离心3分钟。将上清液移至新标记的离心管中，加入300μl异丙醇，颠倒50次.

f)13000g离心5分钟。弃上清，在干净的纸巾上放置，将剩余的液体吸干。

g)加入300μl 70％乙醇。13000g离心3分钟，小心除去乙醇，在吸水纸上吸干剩余液体。

h)在Speedcac真空干燥。

i)加入100μl DNA Hydration Solution。

j)4℃过夜或60℃温育1小时。

k)-20℃保存备用。

(四)2×LAMP反应缓冲液的准备：

首先应用灭菌的超纯水按照如下表比例配制无dNTP的2×反应缓冲液储存液。所配制的储存液可在4℃保存3个月，-20℃长期保存。

使用前每900μL的2×反应缓冲液储存液中加入100μL 25mM dNTP，混匀，制备成2×反应缓冲液工作液，-20℃保存备用。

(五)检测过程

在50μL的离心管中按如下述比例加入待检样品，同时设立标准阳性、阴性基因组DNA和超纯水的空白对照：

轻轻混匀，瞬间离心。在PCR仪中特定温度下(实验性筛选获得，本发明牛巴贝斯虫为60℃、双芽巴贝斯虫为65℃、卵形巴贝斯虫为63℃、大巴贝斯虫为60℃和牛巴贝斯虫未定种为63℃)扩增适当时间(实验性筛选获得，本发明中牛巴贝斯虫为40分钟、双芽巴贝斯虫为55分钟、卵形巴贝斯虫为50分钟、大巴贝斯虫为50分钟和牛巴贝斯虫未定种为45分钟)，立刻在80℃水浴锅中灭活2分钟。取扩增产物5μL，以TAE为缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)中，在75伏电压下电泳检测。

(六)检测实例

1.牛巴贝斯虫的检测：

在11个50μL的离心管中按如前述比例加入样品。引物反应混合物用牛巴贝斯虫特异的引物反应混合物；DNA样品分别应用牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、牛卵形巴贝斯虫、牛大巴贝斯虫、牛巴贝斯虫未定种、牛环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫、牛边虫阳性基因组DNA、巴贝斯虫阴性牛基因组DNA与灭菌超纯水。轻轻混匀，瞬间离心。在PCR仪中60℃扩增40分钟，然后80℃灭活2分钟。取扩增产物5μL，以TAE为缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶(含0.5ug/mL溴化乙锭)中，在75电泳中进行检测。检测结果见图1，结果表明只有牛巴贝斯虫基因组DNA能被特异性的扩增，牛双芽巴贝斯虫、牛卵形巴贝斯虫、牛大巴贝斯虫、牛巴贝斯虫未定种、牛环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫、牛边虫阳性基因组DNA、巴贝斯虫阴性牛基因组DNA与灭菌超纯水反应管中没有扩增。

2.牛双芽巴贝斯虫的检测：

在11个50μL的离心管中按如前述比例加入样品。引物反应混合物用牛双芽巴贝斯虫特异的引物反应混合物；DNA样品分别应用牛双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、牛卵形巴贝斯虫、牛大巴贝斯虫、牛巴贝斯虫未定种、牛环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫、牛边虫阳性基因组DNA、巴贝斯虫阴性牛基因组DNA与灭菌超纯水。轻轻混匀，瞬间离心。在PCR仪中65℃扩增55分钟，然后80℃灭活2分钟。取扩增产物5μL，以TAE为缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶(含0.5ug/mL溴化乙锭)中，在75电泳中进行检测。检测结果见图2，结果表明只有牛双芽巴贝斯虫基因组DNA能被特异性的扩增，牛巴贝斯虫、牛卵形巴贝斯虫、牛大巴贝斯虫、牛巴贝斯虫未定种、牛环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫、牛边虫阳性基因组DNA、巴贝斯虫阴性牛基因组DNA与灭菌超纯水反应管中没有扩增。

3.牛卵形巴贝斯虫的检测：

在11个50μL的离心管中按如前述比例加入样品。引物反应混合物用牛卵形巴贝斯虫特异的引物反应混合物；DNA样品分别应用牛卵形巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、牛大巴贝斯虫、牛巴贝斯虫未定种、牛环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫、牛边虫阳性基因组DNA、巴贝斯虫阴性牛基因组DNA与灭菌超纯水。轻轻混匀，瞬间离心。在PCR仪中60℃扩增40分钟，然后80℃灭活2分钟。取扩增产物5μL，以TAE为缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶(含0.5ug/mL溴化乙锭)中，在75电泳中进行检测。检测结果见图3，结果表明只有牛卵形巴贝斯虫基因组DNA能被特异性的扩增，牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、牛大巴贝斯虫、牛巴贝斯虫未定种、牛环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫、牛边虫阳性基因组DNA、巴贝斯虫阴性牛基因组DNA与灭菌超纯水反应管中没有扩增。

4.牛大巴贝斯虫的检测：

在11个50μL的离心管中按如前述比例加入样品。引物反应混合物用牛大巴贝斯虫特异的引物反应混合物；DNA样品分别应用牛大巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、牛卵形巴贝斯虫、牛巴贝斯虫未定种、牛环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫、牛边虫阳性基因组DNA、巴贝斯虫阴性牛基因组DNA与灭菌超纯水。轻轻混匀，瞬间离心。在PCR仪中60℃扩增50分钟，然后80℃灭活2分钟。取扩增产物5μL，以TAE为缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶(含0.5ug/mL溴化乙锭)中，在75电泳中进行检测。检测结果见图4，结果表明只有牛大巴贝斯虫基因组DNA能被特异性的扩增，牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、牛卵形巴贝斯虫、牛巴贝斯虫未定种、牛环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫、牛边虫阳性基因组DNA、巴贝斯虫阴性牛基因组DNA与灭菌超纯水反应管中没有扩增。

5.牛巴贝斯虫未定种的检测：

在11个50μL的离心管中按如前述比例加入样品。引物反应混合物用牛巴贝斯虫未定种特异的引物反应混合物；DNA样品分别应用牛巴贝斯虫未定种、牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、牛卵形巴贝斯虫、牛大巴贝斯虫、牛环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫、牛边虫阳性基因组DNA、巴贝斯虫阴性牛基因组DNA与灭菌超纯水。轻轻混匀，瞬间离心。在PCR仪中63℃扩增45分钟，然后80℃灭活2分钟。取扩增产物5μL，以TAE为缓冲液，在2％的琼脂糖凝胶(含0.5ug/mL溴化乙锭)中，在75电泳中进行检测。检测结果见图5，结果表明只有牛巴贝斯虫未定种基因组DNA能被特异性的扩增，牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、牛卵形巴贝斯虫、牛大巴贝斯虫、牛环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫、牛边虫阳性基因组DNA、巴贝斯虫阴性牛基因组DNA与灭菌超纯水反应管中没有扩增。

由以上的实例可见，本发明的检测试剂盒具有特异性好，且检测过程简单，可以在2个小时内完成所有的检测操作，无需特殊仪器设备的优点。同时还可看出，采用本发明的试剂盒进行检测时，可清楚区分被检牛具体所患为何种牛的巴贝斯虫，这在临床与研究中有着特殊意义，特别是发生混合感染时，采用本发明的试剂盒可以对疫源的确定，病牛的诊治与预防有积极的意义。