CN102140549A - 腺病毒实时荧光定量pcr试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种腺病毒实时荧光定量PCR试剂盒，涉及生物技术领域中的PCR试剂盒。本试剂盒包括腺病毒的一对特异性引物、一条特异性荧光探针、阳性对照、阴性对照、5xPCRBuffer和EnzymeMix；设计特异性引物F和R：5'-AGCCACGGTGGGGTTTCTAAACTTT-3'，5'-GGCCCCAGTGGTCTTACATGCACATCC-3'；设计探针FP：Cy5-ATGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA-BHQ-2。本发明检测时间周期短、检测效率高；检测病毒特异性高，准确率高；在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析；检测灵敏度比普通PCR和免疫学检测方法灵敏度高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。

Description

腺病毒实时荧光定量PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)试剂盒，尤其涉及一种腺病毒实时荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

腺病毒(Adenovirus，ADV)是导致免疫抑制个体发病率和死亡率的主要诱因。腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染，人腺病毒约1/3的已知血清型通常与人类疾病相关，但一种血清型可引起不同的临床疾患；相反，不同血清型也可引起同一种疾患。此前病毒分离与鉴定的方法主要为：病毒的分离培养，标本应尽早从感染部位采集。采集患者咽喉、眼分泌物，粪便和尿液等，加抗生素处理过夜，离心取上清接种敏感细胞(293、Hep-2或HeLa细胞等)，37℃孵育后可观察到典型CPE，即细胞变圆、团聚、有拉丝现象，最突出的表现是许多病变细胞聚在一起呈葡萄串状。病毒抗原抗体鉴定，用荧光标记的抗六邻体抗体与分离培养细胞作用来鉴定腺病毒，也可用血凝抑制(hemoagglutination inhibition，HI)试验或中和试验(neutralization test，NT)检测属和组特异性抗原并鉴定病毒的血清型。

上述所述检测病毒的方法在一定程度上是有效的，但是它们也有不足的地方，如病毒的分离培养，是需要耗费大量人力、物力和时间的，抗体检测对一些临床样本缺乏足够的灵敏度，有时不能判定出一些正常个体中的潜伏感染。一种更有效快速准确的检测技术，实时荧光定量PCR技术对ADV进行检测，取病变组织或细胞，提取病毒DNA，与标记的病毒DNA探针和引物进行杂交来判断是否被感染。这种方法的优点体现在高灵敏度、高准确性和高速率，在应对病毒大爆发流行时能为医院等单位在面临大堆的临床样本时提供更加快速精确的检测，及时对疫情的加以控制和对流行病学调查作出巨大的贡献。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种腺病毒实时荧光定量PCR试剂盒。

本发明的目的是这样实现的：

1、腺病毒实时荧光定量PCR试剂盒(简称试剂盒)

本试剂盒是在对腺病毒核酸序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，利用实时荧光定量PCR技术对腺病毒进行检测。此技术不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。

在按下述方法设计的引物和探针存在下，在荧光定量PCR仪中，对病毒核酸进行PCR扩增，来实现对腺病毒的检测。

具体地说，本试剂盒包括腺病毒的一对特异性引物(F和R)、一条特异性荧光探针(FP)、阳性对照、阴性对照、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；

①特异性引物

F：5’-AGCCACGGTGGGGTTTCTAAACTTT-3’    25bp，

R：5’-GGCCCCAGTGGTCTTACATGCACATCC-3’  27bp；

②荧光探针

FP：Cy5-ATGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA-BHQ-2    30bp，

荧光探针5’端标记荧光报告基团Cy5，3’端标记荧光淬灭基团BHQ-2；

③阳性对照

腺病毒标准品；

④阴性对照

RNase Free H₂O；

⑤5×PCR Buffer配制

配置混合后于冰箱-20℃保存；

⑥Enzyme Mix配制

配置混合后于冰箱-20℃保存。

2、试剂盒的使用方法

①病毒核酸的提取：

A、首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA；

B、取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中；

C、将标本(如咽拭子等)取200μl加入此管中，充分混匀；

D、再在每管分别加入200μl漂洗液(含30μg/ml carrier RNA)，混匀振荡30s，70℃温育10min；

E、加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min；

F、将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；

G、滤柱中加入500μl缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；

H、另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl缓冲液2，12000rpm，离心1min，重复步骤⑧一次；

I、将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃15min以干燥滤膜；

J、将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ulRNase-free H₂O，室温静置2min。12000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。

②实时荧光定量PCR扩增(每份25ul体系)

取5ul病毒核酸作为模板，同时加入20ul实时荧光定量PCR反应液至八联管中进行荧光定量PCR扩增。

A、实时荧光定量PCR反应液(mix)的配制：

B、一步实时荧光定量PCR反应程序：

①95℃                2min

②95℃                15s

③64℃                30s

④60℃                1min

⑤Go to②，45cycles

步骤③从64℃开始开始荧光检测。

C、检测仪器：

本发明使用LightCycle 480II荧光定量PCR仪，在FAM通道进行检测。

D、结果判断：

在荧光定量PCR仪运转正常，阴性对照和阳性对照均正常的情况下，

(1)当Ct≤35时，判断样品为腺病毒阳性；

(2)当35＜Ct≤40时，重复一次实验，如果Ct还是在此范围之内或小于35就判断样品为腺病毒阳性，否则判断样品为腺病毒阴性。

(3)当Ct＞40时，判断样品为腺病毒阴性。

本发明具有下列优点和积极效果：

①检测时间周期短、检测效率高；

②检测病毒特异性高，准确率高；

③在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析；

④检测灵敏度比普通PCR和免疫学检测方法灵敏度高；

⑤操作简单、易于推广；

⑥实验结果重复性好。

附图说明

图1是30份ADV阳性标本荧光定量PCR扩增曲线；

图2是18份ADV阳性标本荧光定量PCR扩增曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明：

一、实施例1——腺病毒实时荧光定量PCR试剂盒

1、试剂盒的组成

腺病毒一对特异性引物F和R、一条特异性荧光探针FP、腺病毒阳性对照、RNase Free H₂O阴性对照、5xPCR Buffer、Enzyme Mix。

2、腺病毒一对特异性引物

F：5’-AGCCACGGTGGGGTTTCTAAACTTT-3’    25bp，

R：5’-GGCCCCAGTGGTCTTACATGCACATCC-3’  27bp；

一对特异性探针

FP：Cy5-ATGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA-BHQ-2  30bp。

3、5xPCR Buffer配制

配置混合后于冰箱-20℃保存。

4、Enzyme Mix配制

配置混合后于冰箱-20℃保存。

5、病毒核酸的提取

①首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA；

②取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中；

③将标本(如鼻/咽拭子、液化的痰液、胸水、灌洗液等)取200μl加入此管中，充分混匀；

④再在每管分别加入200μl漂洗液(含30μg/ml carrier RNA)，混匀振荡30s，70℃温育10min；

⑤加入250μl无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min；

⑥将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；

⑦滤柱中加入500μl缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；

⑧另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μl缓冲液2，12000rpm，离心1min；重复步骤⑧一次；

⑨将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃15min以干燥滤膜；

⑩将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ul RNase-free H₂O，室温静置2min。12000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。

6、实时荧光定量PCR扩增(每份25ul体系)

取5ul DNA作为模板，同时加入20ul PCR反应液至八联管中进行荧光定量PCR扩增；

a)荧光定量PCR反应液的配制：

b)实时荧光定量PCR反应程序：

①95℃                2min

②95℃                15s

③64℃                30s

④60℃                1min

⑤Go to②，45cycles；

步骤③从64℃开始开始荧光检测。

c)检测：

本发明使用LightCycle 480II荧光定量PCR仪进行检测。

d)结果判断：

如图1，用上述方法对30份已确认ADV阳性标本进行检测，其中检出29份标本被检出，未检出的一个标本重复实验后被检出，正确率达到100％。

二、实施例2——临床检测

如图2，用上述方法对另外20份已确认ADV阳性的标本进行检测，20份阳性标本均被检出，正确率100％。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 腺病毒实时荧光定量PCR试剂盒

<140>

<141>

<160> 3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213>腺病毒上游引物

<400>

5'-AGCCACGGTGGGGTTTCTAAACTTT-3'。      

                          

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213>腺病毒下游引物

<400>

5'-GGCCCCAGTGGTCTTACATGCACATCC-3'。

                             

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 荧光探针序列

<400>

Cy5-ATGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA-BHQ-2。

Claims (1)

1.一种腺病毒实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：

本试剂盒包括腺病毒的一对特异性引物、一条特异性荧光探针、阳性对照、阴性对照、5×PCR Buffer和Enzyme Mix；

①特异性引物

F：5’-AGCCACGGTGGGGTTTCTAAACTTT-3’，

R：5’-GGCCCCAGTGGTCTTACATGCACATCC-3’；

②荧光探针

FP：Cy5-ATGCACCAGACCCGGGCTCAGGTACTCCGA-BHQ-2，

荧光探针5’端标记荧光报告基团Cy5，3’端标记荧光淬灭基团BHQ-2；

③阳性对照

腺病毒标准品；

④阴性对照

RNase Free H₂O；

⑤5×PCR Buffer配制

配置混合后于冰箱-20℃保存；

⑥Enzyme Mix配制

配置混合后于冰箱-20℃保存。

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