CN104073570A - 用于鉴定人类腺病毒55型的引物对、引物探针组合物以及它们的应用 - Google Patents

用于鉴定人类腺病毒55型的引物对、引物探针组合物以及它们的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定人类腺病毒55型的引物对、引物探针组合物以及它们的应用。本发明提供的辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒，包括序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成的特异引物对。所述试剂盒还包括特异探针；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示，或所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3的反向互补序列所示。本发明解决了传统检测技术样本消耗量大、实验操作繁琐、检测灵敏度低、特异性不强等缺点，应用特异性高，检测敏感性可达0.008PFU/反应体系，且适用于高通量筛选。本发明尤其适用于科研、临床和病毒流行病学监测等工作。

Description

用于鉴定人类腺病毒55型的引物对、引物探针组合物以及它们的应用
技术领域
本发明涉及一种用于鉴定人类腺病毒55型的引物对、引物探针组合物以及它们的应用。
背景技术
人腺病毒（Human Adenovirus，HAdV）是一群无包膜的双链DNA病毒，分为1～55个血清型，分别划入A～F共6个血清学分组。人腺病毒经呼吸道和消化道传播，引起多种感染，对小儿和免疫缺陷者危害严重。腺病毒感染人体可能引发的疾病包括：急性腺病毒肺炎、急性胃肠炎、眼角膜炎、乳糜泻和急性间质性肾炎等。在儿童急性下呼吸道感染患者中腺病毒感染阳性率可高达4.1%。在最近几十年的北美、欧洲及亚洲均认为人类腺病毒B组感染是导致急性呼吸系统感染（ARD）的重要因素。
HAdV11、HAdV14型属于腺病毒B组，传统的HAdV11型主要导致肾及泌尿系统的感染，HAdV14则引起人呼吸系统感染。新发现的人类腺病毒55型（HAdV55），在其现之初命名为HAdV11a，对人有较强的致病性，易在军队、学校等密集人群发生呼吸道传染病流行，在免疫低下的人群中甚至出现了死亡病例。基因分析表明HAdV55是HAdV14与HAdV11的Hexon区域重组并发生若干核苷酸突变得到的毒株。
实时定量PCR技术是近年来发展起来的一种PCR技术，它是在传统PCR反应体系的基础上添加了荧光染料或具有荧光标记的探针，将荧光信号强弱与PCR扩增情况结合在一起，通过监测PCR反应管内荧光信号的变化来实时监测PCR反应进行的情况。实时PCR技术，解决了传统PCR难以对扩增起始模板进行定量的难题，避免了传统检测技术样本消耗量大、实验操作繁琐、检测灵敏度低等缺点，并具有快速、避免交叉污染等特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴定人类腺病毒55型的引物对、引物探针组合物以及它们的应用。
本发明提供的第一种辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒，包括序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成的特异引物对。
本发明提供的第二种辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒，包括与序列表的序列1所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子和与序列表的序列2所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子组成的特异引物对。
以上任一所述试剂盒还包括特异探针；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示，或所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3的反向互补序列所示。
所述特异探针可为TaqMan探针。所述特异探针具体可为在序列表的序列3所示单链DNA的5’末端连接荧光基团，3’末端连接淬灭基团得到的探针。所述特异探针具体可为在与序列表的序列3所示单链DNA反向互补的单链DNA的5’末端连接荧光基团，3’末端连接淬灭基团得到的探针。所述荧光基团具体可为FAM荧光基团，所述猝灭基团具体可为TAMRA荧光猝灭剂。其它荧光基团及猝灭基团也可采用。在探针完整时，荧光基团和淬灭基团在空间结构上相互靠近，探针5’末端的荧光报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移（FRET）而被3’端的淬灭基团淬灭，因此检测不到荧光信号的变化。在PCR退火和延伸过程中，引物和探针与模板特异性结合；TaqDNA聚合酶基于模板在引物3’末端合成互补DNA序列；随着引物的延伸，TaqDNA聚合酶利用其5’->3’外切酶活性对互补结合在模板上的探针进行切割，从而释放出荧光报告基团，其与探针3’末端淬灭基团的FRET被破坏，报告基团所释放荧光无法被淬灭基团屏蔽，从而可被检测到。由于每一条新合成DNA链对应一条探针及其荧光报告基团的释放，因此应光亮的增加与PCR产物的积累是呈比例关系的。利用阳性梯度模板如梯度稀释的病毒DNA或含有病毒特异核酸的质粒等循环阈值（Ct，ThresholdCycler，超过阈值的PCR循环数）对应模板拷贝数或病毒滴定度制成标准曲线，根据待测HAdV55型病毒样品的Ct值即可通过与标准品的Ct值测出样品的起始拷贝数或病毒滴度。
本发明还保护序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成的特异引物对。
本发明还保护与序列表的序列1所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子和与序列表的序列2所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子组成的特异引物对。
本发明还保护序列表的序列3所示的单链DNA分子或与序列表的序列3所示的单链DNA分子反向互补的单链DNA分子。
本发明还保护以上任一所述所述特异引物对和/或以上任一所述单链DNA分子在制备辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒中的应用。
本发明还保护以上任一所述所述特异引物对和/或以上任一所述单链DNA分子在辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型中的应用。
用本发明提供的试剂盒检测待测样本中是否含有人类腺病毒55型的方法如下：提取待测样本的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，采用所述特异引物对和所述特异探针进行实时PCR扩增，如果在40个循环内可检测到荧光信号并得到特异的S型扩增曲线，结果为阳性（即待测样品中存在人类腺病毒55型），如果未检测到特异荧光信号，结果为阴性（即待测样本中不含人类腺病毒55型）。
应用本发明的试剂具有如下优点：反应过程无须开盖，反应结束无须电泳，检测快速，并极大减少了PCR产物污染所产生的假阳性结果。本发明解决了传统检测技术样本消耗量大、实验操作繁琐、检测灵敏度低、特异性不强等缺点，本发明的应用特异性高，检测敏感性可达0.008PFU/反应体系，且适用于高通量筛选。本发明尤其适用于科研、临床和病毒流行病学监测等工作。
附图说明
图1为本发明探针和引物对对于人类腺病毒55型DNA的灵敏度检测。
图2为本发明探针和引物对对于人类腺病毒55型的定量标准曲线。
图3为本发明探针和引物对于检测不同型别腺病毒DNA的特异性。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
引物和探针由上海英潍捷基贸易有限公司合成。实时PCR试剂盒（Premix Ex TaqTM）：大连宝生物（TAKARA）公司，CodeNo:DRR039A。核酸定量仪：美国NanoDrop公司。荧光定量PCR仪（System2.0）：德国罗氏（Roche）公司。DNA提取试剂盒(Blood＆Tissue Kit)：QIAgen公司产品，CodeNo:69504。
人类腺病毒3型（Human adenovirus3）：ATCC，ATCC编号为VR-3。
人类腺病毒5型（Human adenovirus5）：ATCC，ATCC编号为VR-5。
人类腺病毒7型（Human adenovirus7）：ATCC，ATCC编号为VR-7。
人类腺病毒11型（Human adenovirus11）：ATCC，ATCC编号为VR-12。
人类腺病毒14（Human adenovirus14）：ATCC，ATCC编号为VR-15。
人类腺病毒55型（HAdV55病毒液）：参考文献：利用计算机分析鉴定人类腺病毒55型：一种再次出现的呼吸道传染病病原体（Cmputational Analysis IdentifiesHuman Adenovirus Type55as a Re-Emergent Acute Respiratory Disease Pathogen）J Clin Microbiol.2010，48(3)：991-993.。
实施例1、引物对和探针的制备
根据GeneBank公布的人类腺病毒55型基因组序列(GenBank序列号：FJ643676)设计引物和探针如下：
HAdV55Hx-F（上游引物，序列1）：5’-GTACGGCTTACAACTCTC-3’；
HAdV55Hx-R（下游引物，序列2）：5’-TTGGGAGTCCTTCTTTTG-3’；
HAdV55Hx-Probe（探针，序列3）：5’-FAM-AAATGGTGAGGAGCGCGTAACA-TAMRA-3’。
实施例2、引物对和探针的组合物的灵敏度
一、病毒样本的制备
使用1640培养基将人类腺病毒55型的病毒液进行梯度稀释，得到10种不同浓度的HAdV55病毒液（HAdV55病毒浓度分别为400000PFU/ml、40000PFU/ml、4000PFU/ml、400PFU/ml、40PFU/ml、4PFU/ml、0.4PFU/ml、0.04PFU/ml、0.004PFU/ml和0.0004PFU/ml）。
样本1：浓度为400000PFU/ml的HAdV55病毒液。
样本2：浓度为40000PFU/ml的HAdV55病毒液。
样本3：浓度为4000PFU/ml的HAdV55病毒液。
样本4：浓度为400PFU/ml的HAdV55病毒液。
样本5：浓度为40PFU/ml的HAdV55病毒液。
样本6：浓度为4PFU/ml的HAdV55病毒液。
样本7：浓度为0.4PFU/ml的HAdV55病毒液。
样本8：浓度为0.04PFU/ml的HAdV55病毒液。
样本9：浓度为0.004PFU/ml的HAdV55病毒液。
样本10：浓度为0.0004PFU/ml的HAdV55病毒液。
样本11：1640培养基。
二、提取基因组DNA
采用DNA提取试剂盒并按试剂盒说明书提取100微升待测样本液（分别将步骤一制备的样本1至样本11作为待测样本液）的基因组DNA，具体方法如下：
在1.5ml的EP管中加入20μl的QIAGEN protease（试剂盒组分），然后加入100μl待测样本液，然后加入200μl的Buffer AL（试剂盒组分），振荡器混匀15秒，56℃放置10分钟；加入200μl无水乙醇，振荡器混匀15秒后将液体转至滤柱中，8000rpm离心1分钟；将滤柱转至新的收集管中，加入500μl的AW1Buffer（试剂盒组分），8000rpm离心1分钟；将滤柱转至新的收集管中，加入500μl的AW2Buffer（试剂盒组分），14000rpm离心3分钟后弃滤出液，再次离心2分钟；将滤柱转至新的EP管中，加入100μl的无菌水，室温放置3分钟，8000rpm离心2分钟，收集的洗脱液（约100μl）即为含有病毒基因组DNA的溶液，-20℃保存。
三、实时PCR
取步骤1得到的基因组DNA，采用实时PCR试剂盒进行实时PCR。
反应体系（20μl）见表1。
表1反应体系
体积(μl) 终浓度
2×Premix Ex TaqTM 10 /
上游引物（HAdV55Hx-F）（10μM） 0.4 200nM
下游引物（HAdV55Hx-R）（10μM） 0.4 200nM
探针（HAdV55Hx-Probe）（10μM） 0.8 400nM
无核酸酶水 6.4 /
步骤1得到的基因组DNA 2 /
在荧光定量PCR仪上，按下列条件进行实时PCR反应：预变性：95°C、30秒；PCR扩增：95°C、5秒，60°C、20秒，共40个循环。
扩增曲线见图1。含有最低浓度为4PFU/ml的HAdV55病毒液的实时PCR扩增可观察到特异的扩增荧光曲线。对于浓度为4PFU/ml的HAdV55病毒液来说，步骤1得到的基因组DNA中的病毒DNA浓度为4PFU/ml×100×10-3ml÷100μl=0.004PFU/μl。每个实时反应体系中病毒DNA的含量＝0.004PFU/μl×2μl＝0.008PFU。即灵敏度为0.008PFU/反应体系，该滴度以上的样本量均可以采用本发明的探针和引物对检测出来。不含有人类腺病毒55型病毒株的样本11进行实时PCR扩增无法获得扩增曲线。
制作定量标准曲线，横坐标为待测样本液中的病毒浓度（PFU/ml）以10为底的对数，纵坐标为Ct值，标准曲线见图2，标准曲线方程为y=-4.9904x+45.407,R2=0.9948。
实施例3、引物对和探针的组合物的特异性
一、病毒样本的制备
样本1：使用1640培养基将人类腺病毒55型配制为浓度为102PFU/ml的病毒液。
样本2：使用1640培养基将人类腺病毒3型配制为浓度为102PFU/ml的病毒液。
样本3：使用1640培养基将人类腺病毒5型配制为浓度为102PFU/ml的病毒液。
样本4：使用1640培养基将人类腺病毒7型配制为浓度为102PFU/ml的病毒液。
样本5：使用1640培养基将人类腺病毒11型配制为浓度为102PFU/ml的病毒液。
样本6：使用1640培养基将人类腺病毒14型配制为浓度为102PFU/ml的病毒液。
二、提取基因组DNA
采用DNA提取试剂盒并按试剂盒说明书提取100微升待测样本液（分别将步骤一制备的样本1至样本6作为待测样本液）的基因组DNA，具体方法同实施例2的步骤二。
三、实时PCR
反应体系和反应程序同实施例2的步骤三。
扩增曲线见图3。
人类腺病毒3型、人类腺病毒5型、人类腺病毒7型、人类腺病毒11型、人类腺病毒14均未检测到特异荧光信号和扩增曲线，为阴性结果。人类腺病毒55型为阳性结果。结果表明本发明方法具有良好特异性。

Claims (10)

1.一种辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒，包括序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成的特异引物对。
2.一种辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒，包括与序列表的序列1所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子和与序列表的序列2所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子组成的特异引物对。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括特异探针；所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3所示，或所述特异探针的核苷酸序列如序列表的序列3的反向互补序列所示。
4.序列表的序列1所示单链DNA分子和序列表的序列2所示单链DNA分子组成的特异引物对。
5.与序列表的序列1所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子和与序列表的序列2所示单链DNA分子反向互补的单链DNA分子组成的特异引物对。
6.序列表的序列3所示的单链DNA分子或与序列表的序列3所示的单链DNA分子反向互补的单链DNA分子。
7.权利要求4所述特异引物对和/或权利要求6所述单链DNA分子在制备辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒中的应用。
8.权利要求5所述特异引物对和/或权利要求6所述单链DNA分子在制备辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型的试剂盒中的应用。
9.权利要求4所述特异引物对和/或权利要求6所述单链DNA分子在辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型中的应用。
10.权利要求5所述特异引物对和/或权利要求6所述单链DNA分子在辅助鉴定和/或定量检测人类腺病毒55型中的应用。
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