CN102212617A - 用于检测猪瘟病毒野毒株的引物对、探针、以及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于病毒检测领域，涉及一种用于检测猪瘟病毒野毒株的引物对、探针、以及试剂盒。具体地，所述引物对其中一条引物包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。本发明还涉及一种检测猪瘟病毒野毒株的方法以及所述的引物对、探针、或试剂盒在检测猪瘟病毒野毒株中的用途。本发明的优点是快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好、检测成本低、时间短(加上核酸提取，仅需1.5小时)、检测效率高、准确性高、假阳性低等。本发明试剂盒能检测猪瘟病毒野毒株，不能检测到疫苗株和其它非猪瘟病毒野毒株，为猪瘟疫情的监测、防控提供强有力的技术支持，有很好的应用前景。

Description

用于检测猪瘟病毒野毒株的引物对、探针、以及试剂盒

技术领域

本发明属于病毒检测领域，涉及一种用于检测猪瘟病毒野毒株的引物对、探针、以及试剂盒。本发明还涉及一种检测猪瘟病毒野毒株的方法以及所述的引物对、探针、或试剂盒在检测猪瘟病毒野毒株中的用途。

背景技术

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的猪的高度致死性、接触性传染病，在世界上许多国家和地区均有发生，国际兽疫局将其定为A类传染病，我国《动物防疫法》将其列为一类传染病，给各国养猪业造成巨大的经济损失。我国政府一直都很重视猪瘟的防制工作，并对猪进行猪瘟兔化弱毒疫苗免疫，但随着猪瘟HCLV疫苗的广泛使用，又由于近年来我国猪瘟的流行特点以散发、慢性猪瘟、持续感染和亚临床症状为主，同时存在着与其它病混合感染的状况，因此对其诊断非常困难。目前尚没有简单快速试剂盒能够检测猪瘟病毒野毒株(除猪瘟疫苗株之外的猪瘟病毒株)感染。

实时荧光定量PCR(FQ-PCR，又称为实时荧光RT-PCR)技术包括探针法、染料法和引物法。探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，以Taqman探针为代表，常用的荧光报告基团是FAM、VIC、JOE、HEX等；染料法是采用一种能够与双链DNA小沟结合的荧光染料，荧光信号强弱与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号换算出PCR反应中的双链DNA数量，常用的染料是SYBR green；引物法是利用荧光标记的引物实现定量，目标特异的引物对中的一个引 物3’端用荧光报告基团标记，在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭，在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。

在荧光定量检测中较常用的是Taqman探针法，根据其3’端标记的荧光淬灭基团的不同又可分为常规Taqman探针和Taqman-MGB探针两种。常规的Taqman探针5’端标以荧光发射基团，3’端标以荧光淬灭基团，该探针在PCR过程中不能被延伸。当探针保持完整时，3’端淬灭基团抑制5’发射基团的荧光发射。在PCR的退火期，探针与引物所含序列内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引物在Taq酶作用下延伸，当到探针处，Taq酶发挥5’-3’外切核酸酶活性，继而发生置换。切断探针后，发光基团远离淬灭基团，荧光信号得到释放。这时荧光探测系统便会检测到光密度有所增加。模板每复制一次，就有一个探针被切断，并伴有一个荧光信号的释放。由于理论上被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团的数目也成正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量。由于扩增产物较短时效率较高，故扩增长度一般为50-150bp。

Taqman-MGB探针与普通Taqman水解探针不同之处在于Taqman-MGB探针的3’端连接一个不发光的淬灭基团，同时另增加一个小沟结合物(minor groove binder，MGB)分子，比Taqman探针有三大优势：一是显著提高Tm值，可以减少探针设计长度，对AT富含区的探针设计更为有利；二是可以降低背景荧光信号，提高信噪比，使实验结果更精确，分辨率更高；三是提高探针和互补模板的结合特异性，即使一个碱基的不匹配都能精确分辨。

目前检测猪瘟病毒的病原学诊断技术有病毒分离法、免疫荧光技术、兔体交互免疫试验、ELISA抗原捕获、RT-PCR技术和实验动物法等。以上几种方法及其不太成熟的试剂盒通常存在灵敏度低、特异性差、耗时、无法区分免疫群与感染群等诸多问题，不能为我国快速、有效地监控猪瘟疫情提供强有力的技术支持。

公开号为CN101328506A和CN101812539A的专利申请公开了检测猪瘟病毒的试剂盒。但是检测的敏感性有待于进一步提高。此外，CN101328506A中公开的试剂盒生产成本高并且操作繁琐。

因此，亟需一种敏感性高、特异性强、并且快速简便的检测“猪瘟病毒野毒株”的产品和方法。

发明内容

本发明人经过创造性的劳动和大量的试验，得到了能够用于检测猪瘟病毒野毒株的引物对和探针，并且惊奇地发现，所述引物对和探针检测猪瘟病毒野毒株的特异性强、灵敏度高。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种引物对(包含两条引物)，其中一条引物包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，所述的引物对，其中，一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，另一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。在本发明的一个实施方案中，所述引物对由两条引物组成，其中，一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，另一条引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。

5’-AACTGGGCTAGCCATGCCCACAGT-3’(CSF-WF4，SEQ ID NO：5)；

5’-TGTACTCAGGACTTAGACCACCCA-3’(CSF-WR2，SEQ ID NO：10)。

上述引物对能够用于检测猪瘟病毒野毒株。

本发明的另一方面涉及一种探针，其包含SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。

5’-CGCCACTACGGCTAGT-3’(CSF-WP3，SEQ ID NO：16)。

本发明的探针能够用于检测猪瘟病毒野毒株。

具体地，所述探针带有可检测的标记。

根据本发明任一项所述的探针，其为自身淬灭探针。

根据本发明任一项所述的探针，其5’端标记有荧光发射基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

根据本发明任一项所述的探针，其中，所述荧光发射基团选自FAM、VIC、JOE、和HEX；所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ、和MGB。

根据本发明任一项所述的探针，其3’端结合有小沟结合物(MGB)。

所述引物和探针可以根据本领域的现有技术合成，也可以委托专业的公司制备。

本发明的还一方面涉及一种组合物，其含有本发明的引物对和/或者本发明任一项所述的探针。

所述组合物能够用于检测猪瘟病毒野毒株。

本发明的还一方面涉及一种试剂盒，其包含本发明的引物对和本发明任一项所述的探针。

根据本发明任一项所述的试剂盒，其还包含RT-PCR反应缓冲液、反转录酶和Taq酶；具体地，所述反转录酶为高效反转录酶(仅在5分钟内就可从高拷贝基因中生产大量的cDNA，普通反转录酶需半小时)，所述Taq酶为热启动Taq酶。

根据本发明任一项所述的试剂盒，其中，所述引物对溶于RT-PCR反应缓冲液，其浓度为10pmoL/μL。

根据本发明任一项所述的试剂盒，其还包含RNA提取试剂。

根据本发明任一项所述的试剂盒，其还包含阳性对照和阴性对照，其中，所述阳性对照为猪瘟石门标准毒株，经灭活后得到；所述阴性对照为猪瘟疫苗株，经灭活后得到。

在本发明一个具体的实施方案中，所述的试剂盒，包含a)裂解液、b)洗液、c)洗脱液、d)吸附柱和收集管、e)阴性对照、f)阳性对照、g)RT-PCR反应液、h)酶混合液、j)荧光探针、k)无菌无核酸酶水；RT-PCR反应液含有上游引物CSF-WF和下游引物CSF-WR，上游引物CSF-WF序列为：5’-AACTGGGCTAGCCATGCCCACAGT-3’；下游引 物CSF-WR序列为：5’-TGTACTCAGGACTTAGACCACCCA-3’；荧光探针含有探针CSF-WP，序列为：5’-FAM-CGCCACTACGGCTAGT-MGB-3’，其5’端标记FAM荧光激发基团，3’端标记自身不发光的淬灭基团，同时另增加一个小沟结合物(minor groove binder，MGB)分子，与CSFV 5’非编码区基因高度保守区的特异性核苷酸片段反向互补。在该具体的实施方案中，对于每个反应，

所述的RT-PCR反应液包括反应缓冲液(含MgCl2和dNTP)12.5μL和10pmoL/μL(单个引物的浓度)引物(CSF-WF和CSF-WR)1.8μL；

所述的荧光探针包括10pmoL/μL探针CSF-WP 0.6μL和ROX染料0.5μL；

所述的酶混合液包括高效反转录酶0.5μL和热启动Taq酶0.5μL。

本发明的试剂盒能够用于检测猪瘟病毒野毒株。

本发明的还一方面涉及一种检测猪瘟病毒野毒株的方法，包括使用本发明的引物对、本发明任一项所述的探针、本发明的组合物、或者本发明任一项所述的试剂盒的步骤。

在本发明一个具体的实施方案中，所述的检测猪瘟病毒野毒株的方法，包括下述步骤：

1)病毒RNA的提取；

2)进行FQ-PCR反应：设被检样品RNA、阴性对照和阳性对照总体积为N，则反应体系配制如下：

在荧光PCR仪上进行以下反应：42℃5min，95℃10s；95℃5s，60℃35s，在每个循环第二步即60℃35s收集荧光信号，共 40个循环；

3)判断待检样品：

阳性对照Ct值≤30并出现特定的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线，实验结果成立；

无特异性扩增曲线为阴性结果；

有特异性扩增曲线的情况下，样本Ct值≤30判断为阳性，样本Ct值满足30＜Ct＜37时需要进行重复试验，重复试验结果若Ct＜37判定样品为阳性，否则为阴性。

本领域技术人员能够判断是否是特异性扩增曲线。通常荧光定量PCR扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段(基线期)，荧光信号指数扩增阶段(对数期)和平台期。

具体地，所述步骤1)病毒RNA的提取包括下述步骤：

取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600μL，充分颠倒混匀，室温静置3-5min；将液体吸入吸附柱中(吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量避免吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱)，13000rpm离心30s，弃去收集管中液体，套上收集管；向吸附柱中加入600μL洗液，13000rpm离心30s，弃去收集管中液体，套上收集管；重新洗涤一遍，再空柱13000rpm离心2min；将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，在膜中央加入洗脱液25μL，室温静置1min，13000rpm离心30s，获得总RNA。其中，所述已处理的样品是指经过将待检样品的组织研磨、匀浆后离心，取上清液；如果待检样品是全血则待血凝后取血清。

本发明的还一方面涉及本发明的引物对、本发明任一项所述的探针、本发明的组合物、或者本发明任一项所述的试剂盒在制备检测猪瘟病毒野毒株的试剂中的用途。

在本发明中，具体地，所述猪瘟病毒野毒株为猪瘟病毒标准强毒石门株。

在本发明中，术语Ct(Cycle threshold)值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

发明的有益效果

本发明的优点是快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好、检测成本低、时间短(加上核酸提取，仅需1.5小时)、检测效率高、准确性高、假阳性低等。本发明试剂盒能检测猪瘟病毒野毒株，不能检测到疫苗株和其它非猪瘟病毒野毒株，为猪瘟疫情的监测、防控提供强有力的技术支持，有很好的应用前景。

附图说明

图1：为猪瘟野毒株FQ-PCR检测特异性扩增曲线图。图中曲线1为猪瘟野毒株特异性扩增曲线，曲线2(包含6条曲线)代表其他病毒(猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒(PCV1、PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV))扩增情况。

图2：阳性对照进行FQ-PCR检测特异性扩增曲线图。图中曲线1为猪瘟野毒株阳性对照特异性扩增曲线，曲线2(包含30条曲线)代表25种猪瘟活疫苗、PK-15细胞及猪瘟阴性猪扁桃体、淋巴结、肾脏、脾脏扩增情况。

图3：实施例3的试剂盒检测7份样品的FQ-PCR特异性扩增曲线图。

图4：根据CN101328506A制备的试剂盒检测7份样品的FQ-PCR特异性扩增曲线图。

图5：根据CN101812539A制备的试剂盒检测7份样品的FQ-PCR特异性扩增曲线图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技 术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：特异性引物和探针的筛选试验

1.猪瘟病毒野毒株的引物与探针设计

本发明人设计了针对猪瘟野毒株的多个实时荧光RT-PCR(FQ-PCR)扩增引物和TaqMan MGB探针，由上海基康生物技术有限公司合成。具体序列例如表1所示。

表1：用于猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR筛选的引物和探针

2.猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR方法的反应体系及条件

猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR方法的反应体系见表2，反应条件见表3。

表2：猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR方法反应体系

表3：猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR方法的反应条件

3.结果判定

(1)结果分析条件设定

读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩 增曲线的最高点，以显示结果为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。

(2)结果描述及鉴定

对比不同引物对与探针组合的扩增情况，遵循特异性原则，敏感性原则和最高扩增原则，选定特异性好，敏感性高，可靠性好的猪瘟野毒株检测用引物对与探针最佳组合。

(3)筛选试验方法与结果

引物与探针的优化筛选方法如下：

任意选择一对引物与一条探针进行组合(如引物对CSFV-WF0/CSFV-WR0，加上探针CSFV-WP；引物对CSFV-WF1/CSFV-WR1，加上探针CSFV-WP1；引物对CSFV-WF1/CSFV-WR1，加上探针CSFV-WP2；等等)，以能同时获得最小的Ct值和最高的扩增效率(根据荧光PCR仪提供的“PCR Efficiency”数据报告，数值越高扩增效率越高)为筛选标准，选出最佳引物与探针组合。

通过多次重复、对比试验，选定猪瘟病毒野毒株检测用引物对与探针的最佳组合，组合筛选结果图略，具体序列见表4。

表4：引物对与探针的优选组合

实施例2：猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR检测方法的优化

1.猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR方法的引物与探针设计

猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR方法的引物与探针设计参见实施例1，具体序列见表4。

2.猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR方法的反应体系及条件

猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR方法的优化原则是：通过优化以下各个条件使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值。

(1)最佳荧光引物浓度的确定：荧光引物浓度在300nM到800nM之间进行筛选。

(2)最佳探针浓度的确定：探针浓度在100nM到500nM之间进行筛选。

(3)反转录酶的用量确定：反转录酶的用量在1U到5U之间进行筛选。

(4)Taq DNA聚合酶的用量确定：Taq DNA聚合酶的用量在1U到5U之间进行筛选。

经过优化，猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR方法的反应体系见表5，反应条件见表6。

表5：猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR检测体系

表6：猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR检测扩增条件

3.结果判定

(1)结果分析条件设定

读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。

(2)质控标准

阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线；

阳性对照的Ct值应≤30，且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。

(3)结果描述及判定

阴性样本无Ct值并且无特异性扩增曲线，表示样本中无猪瘟病毒野毒株。

阳性样本Ct值≤30，且出现特异性扩增曲线，表示样本中有猪瘟病毒野毒株。

待测样品检测结果的判定标准：

无特异性扩增曲线为阴性结果；

有特异性扩增曲线的情况下，样本Ct值≤30判断为阳性，样本Ct值满足30＜Ct＜37时需要进行重复试验，重复试验结果若Ct＜37判定样品为阳性，否则为阴性。

(4)样本检测试验及结果

试验对猪瘟病毒野毒株(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒(PCV1、PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)进行扩增，结果只有猪瘟病毒野毒株(CSFV)得到特异性的荧光扩增曲线(图1)。结果显示，本发明的引物对和探针的特异性非常好。

实施例3：猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR检测试剂盒组成

1.RT-PCR反应液：每个反应包括反应缓冲液(含MgCl₂和dNTP)12.5μL和10pmoL/μL引物(CSF-WF和CSF-WR)1.8μL组成，-20℃ 保存；

2.荧光探针：每个反应包括10pmoL/μL探针CSF-WP 0.6μL和ROX染料0.5μL，-20℃保存；

3.酶混合液：每个反应包括高效反转录酶0.5μL和热启动Taq酶0.5μL，-20℃保存；

4.无菌无核酸酶水：-20℃保存；

5.阳性对照：猪瘟石门标准毒株，经灭活后得到，Ct值＜30，-20℃保存。

6.阴性对照：猪瘟疫苗株，经灭活后得到，-20℃保存。

7.裂解液：室温保存。

8.洗液：室温保存。

9.洗脱液：室温保存。

10.吸附柱和收集管：室温保存。

实施例4：实施例3制备的试剂盒的使用方法

1样品制备

1.1样品采集：病死或扑杀的猪，取扁桃体、淋巴结等病变部与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5mL。2-8℃保存，送实验室检测。(要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。)

1.2样品处理：每份样品分别处理。

1.2.1组织样品处理：取组织病变部与健康部交界处组织称取猪组织0.05g于研磨器中研磨，加入生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中。

1.2.2全血样品处理：待血凝后取血清100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

1.2.3阳性对照处理：取阳性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

1.2.4阴性对照处理：取阴性对照100μL，置1.5mL灭菌离心 管中。

2操作步骤

2.1病毒RNA的提取

2.1.1取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600μL，充分颠倒混匀，室温静置3-5min。

2.1.2将液体吸入吸附柱中(吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量避免吸到悬浮杂质，以免离心时堵塞吸附柱)，13000rpm离心30s，弃去收集管中液体，套上收集管。

2.1.3向吸附柱中加入600μL洗液，13000rpm离心30s，弃去收集管中液体，套上收集管。

2.1.4重复步骤1.3，重新洗涤一遍。

2.1.5再空柱13000rpm离心2min。

2.1.6将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，在膜中央加入洗脱液25μL，室温静置1min，13000rpm离心30s，获得总RNA。

3实时荧光RT-PCR操作

3.2.1反应体系配制

设被检样品、阴性对照和阳性对照总和为N，则反应体系配制如下：

将以上配制的反应体系充分混匀后，分装每个反应管中各23μL。

3.2.2扩增

分别取2.1.6中已溶解的病毒RNA 2μL，加入相应反应管中，混匀并作好标记，在荧光PCR仪上进行以下反应：42℃5min，95℃10s；95℃5s，60℃35s，在每个循环第二步(60℃35s)收集FAM荧光信号，共40个循环。(报告基团“FAM”，淬灭基团“NONE”)。

4结果判定

4.1结果分析条件设定

阈值设定原则：阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。

4.2结果描述及判定

阳性对照Ct值≤30并出现特定的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线，实验结果成立；被检样品Ct值≤30并出现特定的扩增曲线为CSFV野毒株阳性；被检样品30＜Ct＜37并出现特定的扩增曲线，需重新再做一次后进行结果判定，如两次结果相同，可判定为阳性；被检样品Ct值≥37时，超过本方法检测灵敏度范围，判定为阴性。

实施例5：实施例3制备的试剂盒的应用

1.特异性试验

按照实施例3制备20100809、20100811、20100816三个批号的猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR检测试剂盒，分别对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪圆环病毒(PCV1、PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)进行特异性试验，对上述6种病毒的检测结果均为阴性(图1)。另外，对市场购买25种猪瘟活疫苗、PK-15细胞及猪瘟阴性猪扁桃体、淋巴结、肾脏、脾脏等组织检测结果均为阴性(图2)。以上结果充分证明该试剂盒具有很好的特异性。

对猪瘟病毒标准强毒石门株及其他2株地方分离野毒株进行检测，检测结果均为阳性。初步证明该方法对猪瘟病毒野毒株检测适应性良好。

2.灵敏度试验

石门(Shimen)血毒(毒力10^4.53TCID₅₀100μl^-1)，根据实施例4RNA提取方法进行提取，对得到的RNA进行10^-1到10^-10梯度稀释，检测其灵敏度，结果见表7。

表7：猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR检测试剂盒灵敏度结果

由Ct值可知10^-1-10^-6间的Ct值与模板拷贝数的对数呈线性关系，相邻两个模板浓度间的Ct值相差约3.3，与理论上计算的模板浓度相差10倍，Ct值相差3.3相符。

3.重复性试验

使用20100809、20100811、20100816三个批次的猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR检测试剂盒，按照实施例4的使用方法对猪瘟病毒标准强毒石门株及2个10倍连续稀释的RNA分别进行3次重复检测，以确定此方法的批内重复性；3批试剂盒对同样的稀释样品进行检测，以确定此方法的批间重复性。结果见表8。

检测结果显示：批内变异系数及批间变异系数分别为0.39％-2.50％和0.65％-2.00％，均小于5％，说明20100809、20100811、20100816这3批试剂具有很好的批间可重复性。

4.稳定性试验

使用20100809、20100811、20100816三个批次的猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR检测试剂盒，按照实施例4的使用方法对3个样本，每月进行一次检测，每批做3个重复，持续6个月，检测试剂盒的稳定性。结果显示：20100809、20100811、20100816三个批号的猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR检测试剂盒，6个月内的Ct值变化不大，说明猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR检测试剂盒在6个月内具有很好的稳定性。

实施例6：猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR检测试剂盒与专利申请CN101328506A和CN101812539A的对比试验

1.病毒样本制备

使用实施例4中的RNA提取方法提取石门野毒株细胞培养物的RNA及RNA进行10^-1到10^-6梯度稀释。

2.猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR检测试剂盒与专利CN101328506A和CN101812539A进行对比试验

按照CN101328506A和CN101812539A公开的反应体系与扩增条件建立试验方法。同时使用本发明实施例3的猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR试剂盒，对石门野毒株细胞培养物的RNA及RNA进行10^-1到10^-6梯度稀释的RNA(7份样本)进行检测。检测方法参见实施例4和上述两篇专利申请。

3.实验结果

利用这三种方法对7份样本的检测结果见表9，图3、图4和图5。

表9：三种方法对7份样本检测结果

结果：

可见专利申请CN101328506A和CN101812539A的试剂盒检测的敏感性低于本发明研发的试剂盒。此外，CN101328506A研发的试剂盒成本高，操作繁琐。本试剂盒简便快速，结合快速核酸抽提技术，运用高效反转录酶和热启动Taq酶，减少循环时间并且无需扩增后处理步骤等优点，使得本方法能在得到样品后1.5h(包含RNA提取的时间)得出检测结果，大大缩短了检测所需时间，真正实现了快速高灵敏度诊断。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (13)

1.一种引物对，其中一条引物包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

2.一种探针，其包含SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的探针，其为自身淬灭探针，例如其5’端标记有荧光发射基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

4.根据权利要求3所述的探针，其中，所述荧光发射基团选自FAM、VIC、JOE、和HEX；所述荧光淬灭具体选自TAMRA、BHQ、和MGB。

5.一种组合物，其含有权利要求1所述的引物对和/或者权利要求2-4中任一项所述的探针。

6.一种试剂盒，其包含权利要求1所述的引物对和权利要求2-4中任一项所述的探针。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其还包含RT-PCR反应缓冲液、反转录酶和Taq酶；具体地，所述反转录酶为高效反转录酶，所述Taq酶为热启动Taq酶。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述引物对溶于RT-PCR反应缓冲液，其浓度为10pmoL/μL。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其还包含RNA提取试剂。

10.根据权利要求6所述的试剂盒，其还包含阳性对照和阴性对照，其中，所述阳性对照为猪瘟石门标准毒株，经过灭活后得到；所述阴性对照为猪瘟疫苗株，经灭活后得到。

11.一种检测猪瘟病毒野毒株的方法，包括使用权利要求1所述的引物对、权利要求2-4中任一项所述的探针、权利要求5所述的组合物、或者权利要求6-10中任一项所述的试剂盒的步骤。

12.根据权利要求11所述的方法，包括下述步骤：

1)病毒RNA的提取；

2)进行FQ-PCR反应：设被检样品RNA、阴性对照和阳性对照总体积为N，则反应体系配制如下：

在荧光PCR仪上进行以下反应：42℃5min，95℃10s；95℃5s，60℃35s，在每个循环第二步即60℃35s收集荧光信号，共40个循环；

3)判断待检样品：

阳性对照Ct值≤30并出现特定的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线，实验结果成立；

无特异性扩增曲线为阴性结果；

有特异性扩增曲线的情况下，样本Ct值≤30判断为阳性，样本Ct值满足30＜Ct＜37时需要进行重复试验，重复试验结果若Ct＜37判定样品为阳性，否则为阴性。

13.权利要求1所述的引物对、权利要求2-4中任一项所述的探针、权利要求5所述的组合物、或者权利要求6-10中任一项所述的试剂盒在制备检测测猪瘟病毒野毒株的试剂中的用途。

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