CN105506185A - 一种猪瘟病毒的检测引物和荧光定量rt-pcr检测方法 - Google Patents

一种猪瘟病毒的检测引物和荧光定量rt-pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种猪瘟病毒的检测引物和荧光定量RT-PCR检测方法。本发明引物上游引物QCSFV-F，序列为：CCCTCCAGCGACGGCCG；下游引物QCSFV-R，序列为：ACTTAGACCACCCAGGGAG。本发明荧光定量RT-PCR检测方法包括引物的设计与合成、总RNA提取、反转录和荧光定量PCR检测步骤。本发明检测方法具有较好的特异性、敏感性和重复性，可用于所有亚型CSFV毒株的快速检测。

Description

一种猪瘟病毒的检测引物和荧光定量 RT-PCR 检测方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种猪瘟病毒的检测引物和荧光定量RT-PCR检测方法。
背景技术
猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）是猪的一种急性、高度接触性的传染性病毒。它引起的猪瘟（Classical swine fever, CSF），临床上主要表现为稽留高热、皮肤和粘膜有大量出血点以及白细胞减少症等。CSF被世界动物卫生组织（OIE）和我国农业部列为一类动物传染病。各年龄段、各类型猪均易感。因其流行广，发病率及死亡率高，给养猪业造成了巨大的经济损失。近年来，多种CSFV新亚型变异毒株不断出现，给该病的防控带来了更为严峻的挑战。因此，建立快速、灵敏、成本低又操作方便的检测方法十分必要。
CSFV 基因组是单股正链有囊膜的RNA病毒，长约12.3 kb，由5‘端非编码区、一个大的开放阅读框（ORF）和3’端非编码区构成。ORF 编码一个大的多聚蛋白，并最终裂解形成病毒的4种结构蛋白（C、Erns、E1和E2）和8种非结构蛋白（Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）。
目前CSFV的病原检测方法有间接免疫荧光（IFA）、抗原捕获ELISA、普通的RT-PCR和荧光定量RT-PCR等。IFA需要较昂贵的显微镜和有经验的实验人员，且该法经验性较强，耗时长，难度大。基于抗原捕获ELISA法的试剂盒主要依赖进口，价格昂贵，而且敏感度较低，不利于普及。普通的RT-PCR方法具有操作简便、快速和特异性强等特点，但在病毒含量较低时，会出现假阴性的结果。荧光定量RT-PCR方法具有更高的敏感性、特异性和准确性等优点，受到多数学者的青睐。之前有学者成功建立了基于探针的荧光定量RT-PCR方法，但该法过于昂贵，且需要特殊的配套仪器。其他学者有建立的基于荧光染料的荧光定量RT-PCR方法，但使用的引物是基于病毒的变异较大E2蛋白设计，特异性差，不利于对多种不同亚型CSFV毒株的扩增。
中国专利CN102676690B公开了一种猪瘟病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针，该专利试剂盒包括PCR反应液，其中包括DEPC处理水、Taq酶、M-MLV反转录酶、RNase抑制剂、dNTPMix，10 X一步法RT-PCR Buffer, MgCl2溶液、猪瘟病毒正向引物：5'-AACGGYAGTGCTTTCTAYC-3'、猪瘟病毒反向引物：5'-GTGGRAAAGGCTTCTCTC-3'、猪瘟病毒LNA探针5'-accActTctGtyCtca-3'；试剂盒中还包括RNA提取液、阴性质控品、工作标准品、阳性质控品和临界阳性质控品。本发明采用实时荧光定量PCR技术定量检测猪瘟病毒核酸，具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。中国专利CN104034890A公开了一种猪瘟病毒检测方法，属于分子生物学领域。该专利该方法通过设计的可检测猪瘟病毒的通用引物，并将RT-PCR技术与核酸胶体金免疫层析技术相结合，建立的适用于猪瘟病毒的快速检测方法。该专利设计和优化了一种检测猪瘟病毒的通用引物，并与核酸胶体金层析试纸条技术联用在短时问内即可完成不同种锦紫苏类病毒的PCR产物的检测，不需要电泳和溴化乙锭的染色，更为快速实用，简单，灵敏，且安全无污染。但是，这些专利成本高，检测结果准确性低。
发明内容
为克服上述缺陷，本发明的目的在于提供一种猪瘟病毒的检测引物，检测引物特异性强。
本发明的另一目的还在于提供一种猪瘟病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，采用SYBR® Green I嵌合荧光法进行检测，特异性、敏感性和重复性好。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种猪瘟病毒的检测引物，包括上游引物和下游引物，
上游引物QCSFV-F，序列为：CCCTCCAGCGACGGCCG；
下游引物QCSFV-R，序列为：ACTTAGACCACCCAGGGAG。
一种含有上述的检测引物的猪瘟病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，所述的PCR扩增反应体系为25μL：SYBR® Premix Ex Taq（2×）：12.5μL；QCSFV-F：1μL，浓度为0.1μM；QCSFV-R：1μL，浓度为0.1μM；DNA模板：2μL；ddH2O: 8.5μL。
一种利用上述的试剂盒对猪瘟病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，包括以下步骤：
（1）引物的设计与合成：
上游引物QCSFV-F，序列为：CCCTCCAGCGACGGCCG；
下游引物QCSFV-R，序列为：ACTTAGACCACCCAGGGAG；
（2）将待测样本匀浆，离心，取上清进行总RNA提取；
（3）将步骤（2）以总RNA为模板，反转录合成总cDNA，总cDNA样品保存至-80 ℃，备用；
（4）将步骤（3）总cDNA、阳性对照品和阴性对照品分别为模板，在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增；
（5）PCR反应结束后，记录样品的Ct值和起始DNA拷贝数。
根据上述的猪瘟病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，步骤（4）所述的PCR扩增程序为：95℃预变性10分钟，再以39个循环进行PCR扩增，扩增条件为95℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后再先降到65℃持续5秒钟，再升到95℃，再增加0.5℃结束。
根据上述的猪瘟病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，步骤（4）所述的阳性对照品为已知猪瘟病毒感染的临床组织样品中获得的总cDNA，阴性对照品为ddH2O。
根据上述的猪瘟病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，步骤（2）所述的待测样本为肺、脾、肾、淋巴结或者血清。
本发明的积极有益效果：
1. 本发明参考国内外流行的多种CSFV亚型毒株，基于高度保守的5‘NTR区，设计合成特异性引物，引物特异性强。
2. 本发明成功建立了猪瘟病毒SYBR® Green I荧光定量RT-PCR检测方法，采用SYBR® Premix Ex Taq为荧光染料，成本低，定量RT-PCR反应液配制简单，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因可以准确定量、定性检测，重复性好，可信度高，可适用于各种荧光定量PCR扩增仪。
3. 本发明检测方法具有较好的特异性、敏感性和重复性，可用于所有亚型CSFV毒株的快速检测。
附图说明
图1为普通PCR扩增电泳图；
图2为本发明猪瘟病毒的荧光定量RT-PCR检测方法检测CSFV的扩增曲线；
图3为本发明猪瘟病毒的荧光定量RT-PCR检测方法检测CSFV的标准曲线；
图4为普通RT-PCR方法检测CSFV敏感性试验电泳图；
图5为本发明猪瘟病毒的荧光定量检测方法RT-PCR检测CSFV的敏感性试验曲线；
图6为本发明猪瘟病毒的荧光定量RT-PCR检测方法检测CSFV的特异性试验曲线。
具体实施方式
下面结合一些具体实施方式，对本发明进一步说明。
实施例1 引物的设计与合成：
根据CSFV毒株JSZL 5‘NTR的基因序列（GenBank登录号为KT119352），比对GenBank中CSFV各亚型代表株，Shimen（AF092448）、HCLV（AF091507）、Brescia（AF091661）、Paderborn（GQ902941）、Alfort（J04358）和Zj0801（FJ529205）的5‘NTR序列，设计特异性引物，扩增目的片段大小为98 bp，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，引物序列为：
上游引物QCSFV-F，序列为：CCCTCCAGCGACGGCCG；
下游引物QCSFV-R，序列为：ACTTAGACCACCCAGGGAG；
实施例2 猪瘟病毒目的基因的扩增与鉴定：
a. 提取CSFV JSZL病毒液，提取方法为：将PK-15细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为37°、5%CO2的细胞培养箱，待细胞长到单层90%密度时，将培养基弃去，并用PBS溶液洗涤2次，按照MOI: 0.5的量将CSFV JSZL病毒液加入T25培养瓶中，并补充无血清的DMEM培养基至5 mL，将培养瓶放入37℃、5% CO2培养箱中继续培养4-5天，然后将培养瓶放入-80 ℃冰箱，反复冻融三次后将病毒液取出，离心转速9000g，离心5 min，取上清-80 ℃保存备用；
b. 按照北京全式金生物技术有限公司EasyPure® Viral DNA/RNA Kit试剂盒说明书，取200μL已离心的CSFV JSZL病毒液上清进行总RNA提取；
c. 按照北京全式金生物技术有限公司TransScript®-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书，将步骤b总RNA为模板，反转录合成总cDNA，总cDNA样品保存至-80 ℃备用；
d. 以实施例1的QCSFV-F和QCSFV-R为引物，以步骤c的总cDNA作为PCR模板，进行PCR扩增：
PCR扩增反应体系为20μL：10×HiFi Buffer I：2μL；2.5 mM dNTPs：2μL；QCSFV-F：1μL，浓度为0.1μM；QCSFV-R：1μL，浓度为0.1μM；HiFi DNA polymerase：0.5μL；cDNA：1μL；ddH2O: 12.5μL；
PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟，再以35个循环进行PCR扩增，扩增条件为95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后再72℃延伸10分钟；
e. 采用琼脂糖凝胶电泳检测步骤d扩增产物：取10μL步骤d扩增产物用质量浓度1.0%琼脂糖电泳分离PCR扩增产物，根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出98 bp产物（参见图1），那么将扩增产物用OMEGA Gel Extraction Kit试剂盒纯化回收，然后克隆到pMD18-T载体，并转化到DH5α平板，挑取生长良好的菌落，进行测序鉴定，测序结果与CSFV JSZL序列一致，说明本发明目的基因片段扩增完全正确；
实施例3 标准溶解曲线的建立
用OMEGA Plasmid Mini Kit I试剂盒提取阳性重组质粒，用紫外分光光度计定量，将计算好拷贝数的标准DNA作为模板，以10倍系列稀释，稀释浓度在4.49×（102-108）copies/μL，采用本发明荧光定量PCR反应体系和反应程序，在定量荧光PCR仪上进行PCR扩增，绘制标准溶解曲线，仪器使用BIO-RAD CFX96TM Real Time System，在稀释的线性浓度范围内，扩增曲线良好，呈光滑“S”型（参加图2），模板量与对应的Ct值之间线性相关，相关系数为0.998，说明本发明建立的检测方法可以准确检测CSFV，Ct值分别为32.78、28.84、24.83、21.05、17.28、14.03和9.49，标准曲线的斜率为-3.780，截距为42.686，直线方程为y=-3.780x+42.686（参见图3）；
PCR扩增反应体系为25μL：SYBR® Premix Ex Taq（2×）：12.5μL；QCSFV-F：1μL，浓度为0.1μM；QCSFV-R：1μL，浓度为0.1μM；DNA模板：2μL；ddH2O: 8.5μL；
PCR扩增反应程序为：95℃预变性10分钟，再以39个循环进行PCR扩增，扩增条件为95℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后再先降到65℃持续5秒钟，再升到95℃，最后再增加0.5℃结束。
实施例4 敏感性试验
普通PCR最低能检测到105TCID50病毒液（参见图4），而本发明检测方法能检测的最低模板量为101TCID50病毒液（参见图5），比普通PCR检测方法敏感10000倍，本发明检测方法灵敏度高。
实施例5 特异性试验
利用本发明建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法，分别检测了CSFV JSZL、PRRSV、PRV、PEDV 和PCV2病毒，只有CSFV JSZL检测结果为阳性（荧光信号超过阈值），其他对照样品检测结果均为阴性（荧光信号均未超过阈值）（参见图6），本发明定量检测方法特异性强。
实施例6 重复性试验
取拷贝数为105 copies/μL、106 copies/μL、107 copies/μL的模板分别进行5次批内和批间重复试验，结果显示批内变异系数均小于1%，批间变异系数均小于2%（见表1），由表1可知，本发明定量检测方法重复性好。
表1 本发明重复性试验结果
实施例7 临床样本的检测
1．样本来源
对临床上送检的来自全国不同地区的疑似CSFV感染的猪血清或病料样本（肺、脾、肾、淋巴结或者血清）25份，26号为阳性对照品（从已知猪瘟病毒感染的血清样品中获得的总cDNA代替待测样品），27号为阴性对照品（以ddH2O代替待测样品）。
2. 样本处理
（1）引物的设计与合成：
上游引物QCSFV-F，序列为：CCCTCCAGCGACGGCCG；
下游引物QCSFV-R，序列为：ACTTAGACCACCCAGGGAG；
（2）将待测样本匀浆，离心转速9000g，离心5 min，取上清进行总RNA提取；
（3）将步骤（2）以总RNA为模板，反转录合成总cDNA，总cDNA样品保存至-80 ℃，备用；
（4）将步骤（3）总cDNA、阳性对照品和阴性对照品分别加入装有检测液的PCR管中，获得样品反应管、阳性反应管和阴性对照反应管，将各反应管置于荧光定量PCR仪上，仪器使用BIO-RAD CFX96TM Real Time System，设置循环参数，进行PCR扩增；
所述的PCR扩增反应体系为25μL：SYBR® Premix Ex Taq（2×）：12.5μL；QCSFV-F：1μL，浓度为0.1μM；QCSFV-R：1μL，浓度为0.1μM；DNA模板：2μL；ddH2O: 8.5μL；
所述的PCR扩增程序为：95℃预变性10分钟，再以39个循环进行PCR扩增，扩增条件为95℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后再先降到65℃持续5秒钟，再升到95℃，最后再增加0.5℃结束；
（5）检测PCR反应体系的荧光信号值，PCR反应结束后，每个样品重复3次，记录样品的Ct值和起始DNA拷贝数，结果见表2。
表2 本发明临床样本检测结果
3. 结果分析
由表2可知，结果表明19份样品阳性，阳性样品Ct值介于17-29之间，6份样品阴性，阳性率为76.0%，与《猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法》（GB/T27540-2011）检测结果相符，准确率为100%，由此可见，本发明检测方法可用于猪瘟病毒的鉴定和定量检测。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 南阳师范学院
<120> 一种猪瘟病毒的检测引物和荧光定量RT-PCR检测方法
<130> /
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<400> 1
ccctccagcg acggccg 17
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<400> 2
acttagacca cccagggag 19

Claims (6)

1.一种猪瘟病毒的检测引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，
上游引物QCSFV-F，序列为：CCCTCCAGCGACGGCCG；
下游引物QCSFV-R，序列为：ACTTAGACCACCCAGGGAG。
2.一种含有权利要求1所述的检测引物的猪瘟病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增反应体系为25μL：SYBR® Premix Ex Taq（2×）：12.5μL；QCSFV-F：1μL，浓度为0.1μM；QCSFV-R：1μL，浓度为0.1μM；DNA模板：2μL；ddH2O: 8.5μL。
3.一种利用权利要求2所述的试剂盒对猪瘟病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）引物的设计与合成：
上游引物QCSFV-F，序列为：CCCTCCAGCGACGGCCG；
下游引物QCSFV-R，序列为：ACTTAGACCACCCAGGGAG；
（2）将待测样本匀浆，离心，取上清进行总RNA提取；
（3）将步骤（2）以总RNA为模板，反转录合成总cDNA，总cDNA样品保存至-80 ℃，备用；
（4）将步骤（3）总cDNA、阳性对照品和阴性对照品分别为模板，在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增；
（5）PCR反应结束后，记录样品的Ct值和起始DNA拷贝数。
4.根据权利要求3所述的猪瘟病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，步骤（4）所述的PCR扩增程序为：95℃预变性10分钟，再以39个循环进行PCR扩增，扩增条件为95℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后再先降到65℃持续5秒钟，再升到95℃，最后再增加0.5℃结束。
5.根据权利要求3所述的猪瘟病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，步骤（4）所述的阳性对照品为已知猪瘟病毒感染的临床组织样品中获得的总cDNA，阴性对照品为ddH2O。
6.根据权利要求3所述的猪瘟病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，步骤（2）所述的待测样本为肺、脾、肾、淋巴结或者血清。
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