CN105506186A - 一种猪流行性腹泻病毒的检测引物和荧光定量rt-pcr检测方法 - Google Patents

一种猪流行性腹泻病毒的检测引物和荧光定量rt-pcr检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105506186A
CN105506186A CN201610088587.5A CN201610088587A CN105506186A CN 105506186 A CN105506186 A CN 105506186A CN 201610088587 A CN201610088587 A CN 201610088587A CN 105506186 A CN105506186 A CN 105506186A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcr
epidemic diarrhea
porcine epidemic
qpedv
primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610088587.5A
Other languages
English (en)
Inventor
冷超粮
翟洪月
阚云超
姚伦广
王丛丛
王娇玲
冷玉敏
史鸿飞
冀君
唐青海
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanyang Normal University
Original Assignee
Nanyang Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanyang Normal University filed Critical Nanyang Normal University
Priority to CN201610088587.5A priority Critical patent/CN105506186A/zh
Publication of CN105506186A publication Critical patent/CN105506186A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒的检测引物和荧光定量RT-PCR检测方法。本发明检测上游引物QPEDV-F，序列为：CTTCCCAGCGTAGTTGAG；下游引物QPEDV-R，序列为：TTGCCTCTGTTGTTACTTG。本发明荧光定量RT-PCR检测方法包括引物的设计与合成、总DNA提取、反转录和荧光定量PCR检测步骤。本发明定量检测方法具有较好的特异性、敏感性和重复性，可用于所有亚型PEDV速检测。

Description

一种猪流行性腹泻病毒的检测引物和荧光定量RT-PCR检测 方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒的检测引物和荧光定量RT-PCR检测方法。
背景技术
猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的猪的一种急性、高度传染性的肠道疾病。PEDV主要破坏猪的消化道器官，其主要临床症状为急性肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水。各年龄段以及不同品系的猪均对PEDV敏感，但对哺育仔猪危害性更大，发病率为100%，死亡率为80-100%。
从2013年夏季开始，PEDV在美国开始流行，迄今已经蔓延至所有州。近年来，PED在我国及其周边国家发生大规模流行，给养殖户造成重大的经济损失，严重影响了养猪业的发展。因此，建立快速、灵敏、成本低又操作方便的检测方法十分必要。
PEDV为有囊膜的RNA病毒，其基因组为不分节段的、单股线状正链RNA，大小约为28kb。PEDV基因组从5′-3′依次为5′非编区（5′UTR），6个开放阅读框（ORF）和3′UTR，其中在5′端含有帽子结构，在3′端含有Poly(A)尾巴。PEDV编码4种结构蛋白，分别是核衣壳蛋白N、膜蛋白M、小膜蛋白E和纤突蛋白S。
N蛋白全长为441个氨基酸，是一个高度保守的多功能蛋白。它的主要功能是参与病毒基因组的转录、病毒核心的形成以及病毒RNA的组装。在病毒感染的过程中，N蛋白转录出的mRNA含量最高，所以在病毒的复制过程中也是含量最高的成分，并且N蛋白也是PEDV的主要结构蛋白。N蛋白的所有这些特征使得病毒得到准确和尽早诊断提供了可能，可以利用N蛋白来建立针对PEDV的分子生物学诊断技术。目前，国内外已经建立了很多PEDV荧光定量RT-PCR检测方法，但与本方法均有所不同。
中国专利文献号CN103667531A公开了一种PEDV以ORF3基因为参考，设计合成特异性引物，建立了一种快速定量检测PEDV的SYBR® Green I实时荧光PCR方法。该方法检测灵敏度比普通的RT-PCR高100倍，并且避免了常规PCR检测所带来的高污染率。但是，该专利方法假阳性率较高，敏感性较低，准确性较差。
中国专利文献号CN103866050A公开了一种PEDV以N基因为参考，设计合成特异性引物，建立了一种快速定量检测PEDV的基于探针的荧光定量RT-PCR方法，虽然特异性和敏感性均较前者有所提高，但是，该专利方法过于昂贵，且需要特殊的配套仪器。
发明内容
为克服上述缺陷，本发明的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒的检测引物，特异性高。
本发明的另一目的还在于提供一种猪流行性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，特异性、敏感性和重复性好。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种猪流行性腹泻病毒的检测引物，包括上游引物和下游引物，
上游引物QPEDV-F，序列为：CTTCCCAGCGTAGTTGAG；
下游引物QPEDV-R，序列为：TTGCCTCTGTTGTTACTTG。
一种含有上述的检测引物的猪流行性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，所述的PCR扩增反应体系为25μL：SYBR® Premix Ex Taq（2×）：12.5μL；QPEDV-F：1μL，浓度为0.1μM；QPEDV-R：1μL，浓度为0.1μM；DNA模板：2μL；ddH2O: 8.5μL。
一种利用上述的试剂盒进行的猪流行性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，包括以下步骤：
（1）引物的设计与合成：
上游引物QPEDV-F，序列为：CTTCCCAGCGTAGTTGAG；
下游引物QPEDV-R，序列为：TTGCCTCTGTTGTTACTTG；
（2）将待测样本匀浆，离心，取上清进行总RNA提取；
（3）将步骤（2）以总RNA为模板，反转录合成总cDNA，总cDNA样品保存至-80 ℃，备用；
（4）将步骤（3）总cDNA、阳性对照品和阴性对照品分别为模板，在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增；
（5）PCR反应结束后，记录样品的Ct值和起始DNA拷贝数。
根据上述的猪流行性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，步骤（4）所述的PCR扩增程序为：95℃预变性10分钟，再以39个循环进行PCR扩增，扩增条件为95℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后再先降到65℃持续5秒钟，再升到95℃，最后再增加0.5℃结束。
根据上述的猪流行性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，步骤（4）所述的阳性对照品为已知猪流行性腹泻病毒感染的临床组织样品中获得的总cDNA，阴性对照品为ddH2O。
根据上述的猪流行性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，步骤（2）所述的待测样本为淋巴结、肠及其内容物或者粪便。
本发明的积极有益效果：
1. 本发明参考国内外流行的多种PEDV亚型毒株，基于高度保守的N基因，设计合成特异性引物，特异性强。
2. 本发明成功建立了PEDV SYBR® Green I荧光定量RT-PCR检测方法，采用SYBR® Premix Ex Taq为荧光试剂，成本低，定量RT-PCR反应液配制简单，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、定性检测，重复性好，可信度高，可适用于各荧光定量PCR扩增仪。
3. 本发明定量检测方法具有较好的特异性、敏感性和重复性，可用于所有亚型PEDV毒株的的快速检测。
附图说明
图1为普通PCR扩增电泳图；
图2为本发明猪流行性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测方法检测PEDV的扩增曲线；
图3为本发明猪流行性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测方法检测PEDV的标准曲线；
图4为普通RT-PCR方法检测PEDV敏感性试验电泳图；
图5为本发明猪流行性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测方法检测PEDV的敏感性试验曲线；
图6为本发明猪流行性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测方法检测PEDV的特异性试验曲线。
具体实施方式
下面结合一些具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1 引物的设计与合成
根据PEDV毒株HND1 N的基因序列，比对GenBank中PEDV代表株，CV777（AF353511）、Brl/87（Z25483）、Attenuated DR13（JQ023162）、CH/S（JN547228）、LZC（EF185992）、USA/Colorado/2013（KF272920）、USA/Iowa/18984/2013（KF804028）、VN/VAP1113_1/2013/VungTua/Vietnam（KJ960179）和VN/JFP1013_1/2013/Vinh An/Vietnam（KJ960178）的N基因序列，设计特异性引物，扩增目的片段大小为122 bp，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成；
上游引物QPEDV-F，序列为：CTTCCCAGCGTAGTTGAG；
下游引物QPEDV-R，序列为：TTGCCTCTGTTGTTACTTG；
实施例2 猪流行性腹泻病毒目的基因的扩增与鉴定：
a. 提取PEDV HND1病毒液：将Vero细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为37°、5%CO2的细胞培养箱，待Vero细胞长到单层约90%密度时，将培养基弃去并用PBS溶液洗涤2次，按照MOI: 0.5的量将PEDV HND1病毒液加入T25培养瓶中，并补充无血清的DMEM培养基至5 mL，将培养瓶放入37℃ 5% CO2培养箱中继续培养4-5天，待80%的Vero细胞出现CPE后，将培养瓶放入-80℃冰箱，反复冻融三次后将病毒液取出，离心转速9000g，离心5min，取上清-80℃保存备用；
b．按照北京全式金生物技术有限公司EasyPure® Viral DNA/RNA Kit试剂盒说明书，取200μL已离心的PEDV HND1病毒液上清进行总RNA提取；
c．按照北京全式金生物技术有限公司TransScript®-Uni One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书进行反转录，总cDNA样品保存至-80 ℃备用。
d. 以实施例1上游引物QPEDV-F和下游引物QPEDV-R为引物，以步骤c的总cDNA作为PCR模板，进行PCR扩增；
PCR扩增反应体系为20μL：10×HiFi Buffer I：2μL；2.5 mM dNTPs：2μL；QPEDV-F：1μL，浓度为0.1μM；QPEDV-R：1μL，浓度为0.1μM；HiFi DNA polymerase：0.5μL；cDNA：1μL；ddH2O:12.5μL；
PCR扩增反应条件为：95℃预变性5分钟，再以35个循环进行PCR扩增，扩增条件为95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后再72℃延伸10分钟；
e. 采用琼脂糖凝胶电泳检测步骤d扩增产物：取10μL步骤d扩增产物用质量浓度1.0%琼脂糖电泳分离PCR扩增产物，根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出122 bp的产物（参见图1），那么将扩增产物用OMEGA Gel Extraction Kit试剂盒纯化回收，然后克隆到pMD18-T载体，并转化到DH5α平板，挑取生长良好的菌落，并进行测序鉴定，测序结果与PEDV HND1序列一致，说明本发明目的基因片段扩增完全正确。
实施例3 标准溶解曲线的建立
用OMEGA Plasmid Mini Kit I试剂盒收集阳性重组质粒，用紫外分光光度计定量，将计算好拷贝数的标准DNA作为模板，以10倍系列稀释，稀释为浓度在5.30×101-107copies/μL，绘制标准溶解曲线，仪器使用BIO-RAD CFX96TM Real Time System，在稀释的线性浓度范围内，扩增曲线良好，呈光滑“S”型（参加图2），模板量与对应的Ct值之间线性相关，相关系数为0.999，说明本发明建立的检测方法可以准确检测PEDV，Ct值分别为35.09、31.28、27.50、23.72、20.41、17.06和14.03，标准曲线的斜率为-3.567，截距为41.061，直线方程为y=-3.567x+41.061（参见图3）；
所述的PCR扩增反应体系为25μL：SYBR® Premix Ex Taq（2×）：12.5μL；QPEDV-F：1μL，浓度为0.1μM；QPEDV-R：1μL，浓度为0.1μM；DNA模板：2μL；ddH2O: 8.5μL；
所述的PCR扩增反应条件为：95℃预变性10分钟，再以39个循环进行PCR扩增，扩增条件为95℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后再先降到65℃持续5秒钟，再升到95℃，最后再增加0.5℃结束。
实施例4 敏感性试验
普通PCR最低能检测到104TCID50病毒液（图4），而本发明方法能检测的最低模板量为101TCID50病毒液（图5），比普通PCR检测方法敏感1000倍，本发明检测方法灵敏度高。
实施例5 特异性试验
利用本发明建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法，分别检测了PEDV HND1、PRRSV、PRV、CSFV、PCV2、TGEV和PoRV病毒，只有PEDV HND1检测结果为阳性（荧光信号超过阈值），其他对照样品检测结果均为阴性（荧光信号均未超过阈值）（图6），本发明定量检测方法特异性强。
实施例6 重复性试验
取拷贝数为105 copies/μL、106 copies/μL、107 copies/μL的模板分别进行5次批内和批间重复试验，结果显示批内变异系数在1%左右，批间变异系数均在2%，说明该方法具有较好的重复性（见下表1）；
表1 本发明重复性试验结果
实施例7 临床样品的检测
1．样本来源
对临床上送检的来自全国不同地区的疑似PEDV感染的猪血清或病料样品（淋巴结、肠及其内容物、粪便）26份，27号为阳性对照品（从已知猪流行性腹泻病毒感染的肠及其内容物样品中获得的总cDNA代替待测样品），28号为阴性对照品（以ddH2O代替待测样品）。
2. 样本处理
（1）引物的设计与合成：
上游引物QPEDV-F，序列为：CTTCCCAGCGTAGTTGAG；
下游引物QPEDV-R，序列为：TTGCCTCTGTTGTTACTTG；
（2）将待测样本匀浆，离心转速9000g，离心5 min，取上清进行总RNA提取；
（3）将步骤（2）以总RNA为模板，反转录合成总cDNA，总cDNA样品保存至-80 ℃，备用；
（4）将步骤（3）总cDNA、阳性对照品和阴性对照品分别为模板，在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增；
所述的PCR扩增反应体系为25μL：SYBR® Premix Ex Taq（2×）：12.5μL；QPEDV-F：1μL，浓度为0.1μM；QPEDV-R：1μL，浓度为0.1μM；DNA模板：2μL；ddH2O: 8.5μL；
所述的PCR扩增反应条件为：95℃预变性10分钟，再以39个循环进行PCR扩增，扩增条件为95℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后再先降到65℃持续5秒钟，再升到95℃，最后再增加0.5℃结束；
（5）检测PCR反应体系的荧光信号值，PCR反应结束后，记录样品的Ct值和起始DNA拷贝数，结果见表2。
表2 本发明临床样本检测结果
3. 结果分析
由表2可知，结果表明21份样品阳性，阳性样品Ct值介于17-31之间，5份样品阴性，阳性率为80.8%。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 南阳师范学院
<120> 一种猪流行性腹泻病毒的检测引物和荧光定量RT-PCR检测方法
<130> /
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<400> 1
cttcccagcg tagttgag 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<400> 2
ttgcctctgt tgttacttg 19

Claims (6)

1.一种猪流行性腹泻病毒的检测引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，
上游引物QPEDV-F，序列为：CTTCCCAGCGTAGTTGAG；
下游引物QPEDV-R，序列为：TTGCCTCTGTTGTTACTTG。
2.一种含有权利要求1所述的检测引物的猪流行性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增反应体系为25μL：SYBR® Premix Ex Taq（2×）：12.5μL；QPEDV-F：1μL，浓度为0.1μM；QPEDV-R：1μL，浓度为0.1μM；DNA模板：2μL；ddH2O: 8.5μL。
3.一种利用权利要求2所述的试剂盒进行的猪流行性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）引物的设计与合成：
上游引物QPEDV-F，序列为：CTTCCCAGCGTAGTTGAG；
下游引物QPEDV-R，序列为：TTGCCTCTGTTGTTACTTG；
（2）将待测样本匀浆，离心，取上清进行总RNA提取；
（3）将步骤（2）以总RNA为模板，反转录合成总cDNA，总cDNA样品保存至-80 ℃，备用；
（4）将步骤（3）总cDNA、阳性对照品和阴性对照品分别为模板，在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增；
（5）PCR反应结束后，记录样品的Ct值和起始DNA拷贝数。
4.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，步骤（4）所述的PCR扩增程序为：95℃预变性10分钟，再以39个循环进行PCR扩增，扩增条件为95℃变性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，最后再先降到65℃持续5秒钟，再升到95℃，最后再增加0.5℃结束。
5.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，步骤（4）所述的阳性对照品为已知猪流行性腹泻病毒感染的临床组织样品中获得的总cDNA，阴性对照品为ddH2O。
6.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒的荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，步骤（2）所述的待测样本为淋巴结、肠及其内容物或者粪便。
CN201610088587.5A 2016-02-17 2016-02-17 一种猪流行性腹泻病毒的检测引物和荧光定量rt-pcr检测方法 Pending CN105506186A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610088587.5A CN105506186A (zh) 2016-02-17 2016-02-17 一种猪流行性腹泻病毒的检测引物和荧光定量rt-pcr检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610088587.5A CN105506186A (zh) 2016-02-17 2016-02-17 一种猪流行性腹泻病毒的检测引物和荧光定量rt-pcr检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105506186A true CN105506186A (zh) 2016-04-20

Family

ID=55714475

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610088587.5A Pending CN105506186A (zh) 2016-02-17 2016-02-17 一种猪流行性腹泻病毒的检测引物和荧光定量rt-pcr检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105506186A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106222299A (zh) * 2016-08-02 2016-12-14 四川农业大学 一种检测猪流行性腹泻病毒的荧光定量pcr试剂盒及其用途
CN106244728A (zh) * 2016-08-23 2016-12-21 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 一种pedv和tgev双重rt‑pcr检测方法及其探针引物组合与试剂盒
CN109735661A (zh) * 2019-03-07 2019-05-10 长江大学 一种通用型猪流行性腹泻病毒巢式pcr检测方法
CN116287443A (zh) * 2022-12-26 2023-06-23 内蒙古正大食品有限公司 一种具有质控体系的检测pedv的荧光pcr方法及其特异性引物探针组合

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277454A (zh) * 2011-08-22 2011-12-14 浙江省农业科学院 猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒
CN103509882A (zh) * 2013-06-28 2014-01-15 广东温氏食品集团股份有限公司 猪流行性腹泻病毒的荧光定量pcr引物和探针
CN103866050A (zh) * 2014-04-14 2014-06-18 上海交通大学 猪流行性腹泻病毒荧光定量pcr检测方法及其引物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102277454A (zh) * 2011-08-22 2011-12-14 浙江省农业科学院 猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒
CN103509882A (zh) * 2013-06-28 2014-01-15 广东温氏食品集团股份有限公司 猪流行性腹泻病毒的荧光定量pcr引物和探针
CN103866050A (zh) * 2014-04-14 2014-06-18 上海交通大学 猪流行性腹泻病毒荧光定量pcr检测方法及其引物

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
修金生等: "猪流行性腹泻病毒ＳＹＢＲⅠ实时荧光定量", 《中国兽医科学》 *
刘邓等: "TaqMan荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立与初步应用", 《中国动物传染病学报》 *
唐金明等: "猪流行性腹泻病毒分离鉴定与实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立", 《动物医学进展》 *
曹贝贝等: "猪流行性腹泻病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法的建立", 《中国预防兽医学报》 *
李伟等: "《分子诊断学 第3版》", 30 September 2015 *
王金良等: "SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒党法的建立及应用", 《中国兽医学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106222299A (zh) * 2016-08-02 2016-12-14 四川农业大学 一种检测猪流行性腹泻病毒的荧光定量pcr试剂盒及其用途
CN106244728A (zh) * 2016-08-23 2016-12-21 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 一种pedv和tgev双重rt‑pcr检测方法及其探针引物组合与试剂盒
CN109735661A (zh) * 2019-03-07 2019-05-10 长江大学 一种通用型猪流行性腹泻病毒巢式pcr检测方法
CN116287443A (zh) * 2022-12-26 2023-06-23 内蒙古正大食品有限公司 一种具有质控体系的检测pedv的荧光pcr方法及其特异性引物探针组合

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016082691A1 (zh) 反转录pcr检测基孔肯雅病毒的试剂盒及其检测方法
CN108060269A (zh) 用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的dpo引物组及其应用
CN103866050B (zh) 猪流行性腹泻病毒荧光定量pcr检测方法及其引物
CN105506186A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒的检测引物和荧光定量rt-pcr检测方法
CN108977582B (zh) 一种禽传染性支气管炎病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法
CN106676197A (zh) 猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT‑PCR检测方法及其应用
CN103725796A (zh) 一种牛病毒性腹泻病毒内标分型荧光pcr检测试剂盒及其制备
CN109913591A (zh) 基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法和试剂盒
CN103993101A (zh) 一种同时检测人的冠状病毒229e、oc43、nl63的方法及试剂盒
CN106435039A (zh) 一种检测猪繁殖与呼吸综合征类nadc‑30毒株的引物、探针、试剂盒及方法
CN114015815B (zh) 猪非典型瘟病毒的微滴数字pcr试剂盒及其检测方法
CN105112558B (zh) 口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒
CN103725793A (zh) 检测prrsv的多重荧光定量rt-pcr方法及其应用
CN106520763A (zh) 一种组合物、其应用以及含有该组合物的试剂盒
CN102206709B (zh) 一种实时荧光定量rt-pcr检测csfv的方法
CN104561371A (zh) 用于检测猪流行性腹泻病毒的pcr引物、试剂盒及其制备方法和应用
CN109468411A (zh) 一种h5亚型禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法
CN102329889B (zh) 用于检测小鼠脱脚病病毒的引物、探针及其方法
CN102816865B (zh) H1n1、prrsv、csfv四重检测试剂盒
CN107937606A (zh) 一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂以及方法
CN106701942A (zh) 一种猪肺炎支原体的实时荧光pcr检测试剂盒及其用途
CN102337357B (zh) 用于检测小鼠呼肠孤病毒ⅲ型的引物、探针及其方法
WO2016078215A1 (zh) 一步法反转录pcr检测和分型埃博拉病毒5种亚型的引物、探针及试剂盒
CN102337358B (zh) 用于检测小鼠仙台病毒的引物、探针及其方法
CN105506185A (zh) 一种猪瘟病毒的检测引物和荧光定量rt-pcr检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160420

RJ01 Rejection of invention patent application after publication