CN106701942A

CN106701942A - 一种猪肺炎支原体的实时荧光pcr检测试剂盒及其用途

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Publication number: CN106701942A
Application number: CN201611225518.0A
Authority: CN
Inventors: 喻正军; 李增强; 石建; 廖娟红
Original assignee: Hunan Xinnanfang Culture Service Co Ltd
Current assignee: Hunan Xinnanfang Culture Service Co Ltd
Priority date: 2016-12-27
Filing date: 2016-12-27
Publication date: 2017-05-24

Abstract

本发明公开了一种猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒及其用途。该试剂盒是根据猪肺炎支原体p46基因而研制的实时荧光PCR试剂盒，包括针对猪肺炎支原体p46基因序列设计的Taqman荧光探针及引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2所示，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明的试剂盒能够特异性地检测猪肺炎支原体，并具有较高的灵敏度，特异性强和重复性优，可以实现大通量样品的检测。并且本发明的试剂盒检测结果快速高效，不会造成样品交叉污染，同时达到母仔猪同时监测的目的。

Description

一种猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒及其用途

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒及其用途。

背景技术

猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的，以咳嗽和气喘为主要症状的慢性呼吸道传染病，具有慢性、接触性、高传染性、高发病率和低死亡率的特征。该病广泛分布于世界各地，国外常被称为猪地方流行性肺炎，而在我国常被称为猪气喘病。Mhp感染导致猪的生长缓慢、饲料转化率减低、体重下降、出栏延迟等，同时破坏巨噬细胞，导致免疫抑制。因此临床上，Mhp通常与猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、流感病毒、传染性胸膜肺炎放线杆菌、多杀巴氏杆菌等病原混合感染，不仅造成更严重的危害，也增加了诊断与防治的难度。猪支原体肺炎已成为当前严重影响养猪业经济效益的重大疫病，被喻为影响养猪业经济效益的阴性杀手。

Mhp传统的诊断方法主要包括以下方法：(1)临床与病理学诊断：该方法是一种辅助性诊断。通过剖检肺脏组织，观察组织特征性变化及病理观察纤毛脱落与炎性细胞浸润来进行诊断。但是由于Mhp多与其它呼吸道病原发生混合感染，因此只通过临床与病理学方法来准确诊断Mhp十分困难。(2)病原学诊断：主要通过从猪体内分离培养Mhp来进行病原学检测，被认为是检测病原的金标准。但是Mhp对培养条件要求很高，分离培养相当困难，且易受其它支原体污染，因此分离培养Mhp在临床上使用十分受限。

近年来对Mhp快速检测方法的研究有了很大的进展，一些敏感、特异、快速及准确的检测方法已被广泛应用于Mhp的诊断，包括补体结合试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金等免疫学检测方法，以及核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)及其衍生技术的分子生物学检测技术。目前临床上使用较多的是ELISA法与PCR法。

免疫学检测方法是基于抗体与抗原识别反应来检测Mhp，文献报道的主要有补体结合试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金等。其中ELISA是发展较快的一种血清学检验方法。学者针对Mhp的保护性抗原，如P36、P46、P65等建立了相关ELISA方法，检测灵敏度明显高于补体结合试验与间接血凝。猪体内存在着将近20种支原体，通过免疫学方法不能避免支原体间的交叉反应，因此包括ELISA方法都容易在临床检测中受非特异性的影响，导致检测结果的不准确。另外，抗体的产生要晚于病原的感染，检测抗体来间接评估病原存在滞后性，无法及时有效的做到感染早期诊断预防。

近些年，随着PCR技术的不断改进，分子生物学检测方法在对Mhp的检测上有了更广泛的应用，发展了多重PCR检测技术、套式PCR诊断技术、实时荧光定量PCR诊断技术、环介导等温扩增技术等。具体为：①常规PCR技术，是经典的病原检测方法，它具有简洁、方便、快速及节约成本的优点，但敏感性较低，不能定量，限制了该技术的发展，但常规PCR仍然广泛应用在临床检测。Mhp的16SrRNA基因等多被报道用来设计引物建立PCR检测技术。②多重PCR又称复合PCR(multiplex PCR)，是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，使得一次扩增能同时对几种不同类型的支原体进行检测，扩增出多个核酸片段，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同，节约了时间、试剂和成本，避免了多次配置PCR体系所造成的污染。但由于多重PCR扩增时，同时用几对引物，可能引起非特异性扩增，对结果造成影响。③套式PCR又称巢式PCR(Nested PCR，nPCR)，即在第一对引物(外套引物)的扩增区域内另行设计一对引物(内套引物)，用外套的扩增产物做模板进行第二次扩增。套式PCR外套扩增增加了起始模板量，内套引物扩增将目的基因进一步倍增至可观察的量，由于采用两对不同的引物二级放大，故可提高PCR检测的灵敏度，保证产物的特异性，使灵敏度和特异性高于传统的PCR方法。此方法可快速、特异地从感染猪的鼻拭子和气管、支气管灌洗液中检测到Mhp。这种方法敏感性较高，可用于活体猪和死亡猪的检查，极大地方便了Mhp的流行病学研究，有利于了解猪场中病原感染及传播方式，但阴性样品容易受到气溶胶中Mhp的污染，需要谨慎操作。④环介导等温扩增技术(LAMP)是近年来兴起的一种特殊的快速、高效、特异的PCR检测方法，与常规PCR技术相比，不需要复杂的仪器设备，理论上适合用于基层实验室和临床监测方面的应用。目前此项技术在人医领域的应用逐步推广，同荧光定量技术联合，配套实时监控设备，也解决了无法定量的缺点。但此项技术研发比较困难，试剂成本过高，兽用诊断方面多未临床推广使用。

实时荧光PCR(real-time PCR)技术是近年发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸的技术。实时荧光PCR检测技术的建立填补了常规PCR技术不能准确定量的空缺该方法能够实时监测，定量准确，灵敏度高，特异性强，重复性好，自动化程度高。近年来已解决检测仪器国外垄断、价格昂贵等问题，真正成为了一项方便、快捷、性价比高的检测技术，适合在基层推广。

猪肺炎支原体是一种严重危害养猪业种病原。Mhp造成免疫抑制，常同其它呼吸道病原混合感染，增加诊断与防治的难度。传统的临床病理诊断、分离培养方法与免疫学方法无法做到对于Mhp的精确诊断，急需一种用于感染早期精准诊断的技术。

发明内容

本发明旨在建立一种高效、快速、简便的实时荧光PCR检测Mhp的方法，并开发成标准化试剂盒，利用其高灵敏、高特异、低污染和实时检测的特点，为一线猪场临床猪支原体肺炎病的预警、早期诊断和防治监测提供可靠的技术与产品保障。

基于以上目的，本发明提供了一种猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：

上游扩增引物P46-f：5’-TTCGCTTGCATCAATTATTG-3’，其为SEQ ID NO:1序列；

下游扩增引物P46-r：5’-CGGATTGTGGTTTAGAATC-3’，其为SEQ ID NO:2序列；

特异性荧光探针P46-p：FAM-5’-TGATTCTGTCTGTCCACAACCTGCTGC-3’-TAMRA，其为SEQ ID NO:3序列，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

合理的引物和荧光探针设计是成功应用实时荧光PCR技术的关键。引物和探针的特异性对反应有很大影响，如果引物和探针特异性不高，可能在扩增构成中产生非靶标条带，影响检测结果的判定。

PCR及其衍生技术需要针对特定的靶标基因，目前用于猪支原体肺炎PCR检测的靶基因主要包括16SrNA、p36(乳酸脱氢酶)、p46(表面膜蛋白)、p97(纤毛结合素)及p110(糖蛋白)。p46蛋白属于能引起早期免疫应答反应且具有种特异性的表膜脂蛋白，也是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白之一，又因与其他支原体无交叉反应，p46蛋白可以作为建立MPS检测方法的优选抗原。同源性比较表明，p46基因在MPS种内高度保守。目前还未有依据p46基因而成的荧光PCR诊断方法的相关报道。

本发明对GenBank中公布的猪肺炎支原体168株编码膜蛋白的p46基因序列进行对比分析，在Mhp的p46基因上筛选出一段高度保守的基因片段，该基因片段大小为86bp，作为本发明设计引物的靶片段。发明人针对该保守片段设计了多对引物和探针，最终根据扩增效果(扩增效率、灵敏度等)筛选出本发明的引物和探针。该引物为只针对猪肺炎支原体的通用上下游扩增引物，且匹配性和特异性良好。同时在该上下游引物扩增区86bp片段间设计了高度保守的特异性荧光探针，该特异性荧光探针能与Mhp核酸特异性结合，引物进行扩增过程中，探针发生酶解，致荧光积累被仪器检测到。该组引物与探针扩增效率较好，能特异性扩增Mhp基因组核酸，同其它种类的支原体及常见感染猪的病原无交叉。

在本发明中，优选的，所述上游扩增引物P46-f、所述下游扩增引物P46-r和所述特异性荧光探针P46-p的摩尔比为2:2:1。

在本发明中，优选的，所述上游扩增引物P46-f、所述下游扩增引物P46-r和所述特异性荧光探针P46-p在所述试剂盒中的使用终浓度均为0.1～0.4μM。

在本发明中，优选的，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、荧光PCR反应液(含酶)、裂解液及说明书。

在本发明中，优选的，所述阴性对照为无RNA酶与DNA酶的ddH₂O；所述阳性对照为克隆有猪肺炎支原体p46基因序列的克隆质粒pEASY-p46，克隆质粒pEASY-p46的终浓度为1.0×10⁵copies/μL～1.0×10⁷copies/μL；所述裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS 0.1-0.2％；③吐温20 1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40 1-2％。

在PCR反应体系中加入荧光PCR反应液，其包括UNG酶系统，在扩增环节可以有效解决扩增污染现象，抗污染能力强等。本发明的荧光PCR反应液中还含有dNTPs、TaqDNA聚合酶和一些增强成分(MgCl₂、DMSO或甲酰胺)的混合物，具体的增强成分根据实际需要进行添加。

在本发明中，所述猪肺炎支原体p46基因86bp目的片段的核苷酸序列如下所示：

TTCGCTTGCATCAATTATTGCATTTGTTGCAGCAGGTTGTGGACAG-ACAGAATCAGGTTCGACTTCTGATTCTAAACCACAAGCCG，其为SEQ ID NO:4序列。

在本发明中，优选的，所述克隆质粒pEASY-p46采用以下方法制备得到：提取猪肺炎支原体DNA，利用引物p46-f和p46-r扩增得到猪肺炎支原体p46基因片段，通过TA克隆将猪肺炎支原体p46基因片段连接至pEASY-T1载体，转化后筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为pEASY-p46。

进一步的，本发明还提供了一种所述的猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)使用所述的实时荧光PCR试剂盒进行PCR扩增时，实时荧光PCR反应体系以20μL计为：

10μM的SEQ ID NO:1所示的上游扩增引物P46-f：0.4～0.8μL；

10μM的SEQ ID NO:2所示的下游扩增引物P46-r：0.4～0.8μL；

10M的SEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针P46-p：0.2～0.4μL；

荧光PCR反应液(含酶)：16μL；

DNA模板：2～3μL；

ddH₂O：补足至20μL；

(2)实时荧光PCR的反应条件为：50℃UNG酶激活2min；95℃预变性5min；95℃变性15Sec，60℃退火30Sec并收集荧光，共40个循环；结束反应；

(3)结果分析：

质量控制：阴性对照FAM通道检测无Ct值；阳性对照FAM通道检测Ct值≤30；上述条件同时满足，检测结果有效；

结果判定：FAM通道检测Ct值≤40，则判定样品为猪肺炎支原体感染阳性；FAM通道检测无Ct值，则判定样品为猪肺炎支原体感染阴性。

在本发明中，优选的，所述DNA模板采用以下方法制备得到：

(1)全血、病料组织等可使用商品化DNA提纯试剂盒进行提取，方法参照所使用试剂盒说明书；或者

(2)拭子、空气样品、血清或血浆可使用本发明试剂盒中提供的裂解液进行DNA释放，将上述类型样品进行瞬时离心(3000rpm离心10秒)后，微量取样品上清1-2μL置PCR反应管中，加入等体积的裂解液，混匀室温静置5min，加入反应体系进行扩增。

裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS，其在裂解液中的质量分数为0.1-0.2％；③吐温20，其在裂解液中的质量分数为1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的质量分数为1-2％。

本发明在核酸提取环节中，直接使用盐酸胍、SDS、吐温20、NP40对微量样本进行高效裂解，DNA经释放后可稳定存在，直接用于后续PCR反应。为避免溶血对PCR的影响，建议溶血严重样本使用商品化DNA提纯试剂盒进行提取。

在本发明中，为了使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值，对提取的DNA模板浓度、引物浓度和特异性荧光探针的浓度进行了优化，尤其是探针的浓度。引物浓度过低会影响扩增效率，引物浓度过高会引起错配和非特异性扩增，且增加引物之间形成二聚体的机会，同样特异性荧光探针浓度过低会引起特异性的荧光信号变弱，而浓度过高则会引起探针与模板发生非特异性结合，产生非特异性荧光信号从而干扰特异性荧光信号，提取的DNA模板浓度会影响PCR扩增的效率，应根据目的基因的大小选择合适的DNA模板浓度。本发明经过一系列优化试验，最终确定本发明的荧光PCR反应体系和反应条件，采用本发明的实时荧光PCR方法检测猪肺炎支原体的扩增效率接近100％，并可获得最小的Ct值。

更进一步的，本发明还提供了所述的试剂盒在制备检测猪肺炎支原体试剂中的用途。

本发明将猪肺炎支原体的p46基因和TaqMan探针相结合，针对猪肺炎支原体p46基因设计通用引物和特异性探针，通过对提取的DNA模板浓度、引物浓度以及特异性探针浓度等进行优化，建立了检测猪肺炎支原体核酸的实时荧光PCR方法。灵敏度试验结果表明，该方法的检测范围为10⁸-10¹copies/μL，可以检测到最低10copies的猪肺炎支原体核酸，灵敏度是常规PCR方法的300倍。特异性试验结果表明，该方法对猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪附红细胞体、猪鼻支原体等核酸均无非特异性反应，说明该方法特异性和可靠性强。准确性试验结果表明，对于阳性对照与阴性对照的检测，该方法与常规PCR方法检测结果100％符合；对于临床血液样品的检测，该方法检测猪肺炎支原体阳性17/98，常规PCR方法检测猪肺炎支原体阳性4/98，且后者检测的4份样品使用该方法检测均为阳性，说明该方法更敏感，准确性高。重复性试验结果表明，该方法对不同核酸浓度(10⁶、10⁵、10⁴copies/μL)的阳性对照pEASY-p46克隆质粒检测变异系数(CV)均小于1％，具有较好的重复性。

综上所述，本发明试剂盒检测快速、准确、敏感，更适用于拭子、空气样品、血清或血浆中微量的猪肺炎支原体核酸检测。

与现有技术相比，本发明的试剂盒具有以下有益效果：

(1)本发明的检测方法克服了常规检测技术耗时长、敏感度低、安全系数低、抗污染能力差和不能准确定量等问题，检测快速高效，不会造成样品交叉污染。

(2)本发明的检测方法准确度高，灵敏度高，特异性强，重复性优，可以实现较大通量样品的检测。

(3)本发明的检测方法适用于检测多种组织、拭子、血液样品与空气样品，可用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等。

(4)本发明操作简单操作时间短，做一次病原检测仅需要2-3小时，快捷迅速、节约成本；而且需要仪器设备相对简单，不需要电泳仪、凝胶成像系统及其分析软件；结果相对可靠，不需要电泳，空气中气溶胶相对较少，不易污染；技术操作要求低，可以在基层大量推广；基于该检测方法制备的试剂盒易于质量控制，易于标准化。

附图说明

图1为本发明阳性对照10倍稀释的梯度标准曲线；

图2为本发明敏感性检测结果图；

图3为本发明特异性检测结果图；

图4为本发明重复性检测结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。

实施例1猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒的组成

(1)荧光PCR反应液(含酶)：原料购自南京诺唯赞(VAZYME)公司；该反应液中含有UNG酶系统，在扩增环节可以有效解决扩增污染现象，抗污染能力强等；

(2)上下游引物p46-f和p46-r：由上海生工生物工程公司合成，用去离子水配制成浓度为10μM。

(3)特异性荧光探针P46-p：由华大基因公司合成，用去离子水配制成浓度为10μM。

特异性荧光探针P46-p：FAM-5’-TGATTCTGTCTGTCCACAACCTGCTGC-3’-TAMRA，其为SEQ ID NO:3序列其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

本发明对GenBank中公布的猪肺炎支原体168株编码膜蛋白的p46基因序列进行对比分析，在Mhp高度保守的p46基因上设计了上下游扩增引物，且匹配性和特异性良好。同时在该上下游引物扩增区86bp片段间设计了高度保守的特异性荧光探针，该特异性荧光探针能与Mhp核酸特异性结合，引物进行扩增过程中，探针发生酶解，致荧光积累被仪器检测到。该组引物与探针扩增效率较好，能特异性扩增Mhp基因组核酸，同其它种类的支原体及常见感染猪的病原无交叉。

(4)阳性对照为克隆有Mhp编码膜蛋白的p46基因片段的重组质粒pEASY-p46，由本实验室构建，质粒在紫外分光光度计OD260nm测定质量浓度，按公式6.02×10²³×(X ng/μL×10^-9)/DNA length×660换算为拷贝数，配制浓度为1.0×10⁵copies/μL～1.0×10⁷copies/μL；

其中，克隆质粒pEASY-p46的构建方法如下：①按照商业试剂盒操作说明书提取猪肺炎支原体核酸；以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作为特异性引物扩增p46基因中86bp目的片段，反应条件为：95℃预变性1min；95℃变性10Sec，60℃退火30Sec，72℃延伸30s，共30个循环；72℃再延伸10min，4℃保温5min。PCR产物于2％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定；②PCR产物的纯化、克隆及序列分析：PCR产物用AXYGEN公司的AxyPrep DNA Gel Excraction Kit胶回收试剂盒回收，通过TA克隆将Mhp P46基因中86bp目的片段克隆至pEASY-T1载体，然后转化Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培养基平板上，37℃培养12h-18h。经蓝白斑筛选后，用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit 1质粒提取试剂盒提取质粒，然后用引物进行扩增和测序，测序后比对成功的克隆质粒命名pEASY-p46。

猪肺炎支原体p46基因86bp目的片段的核苷酸序列如下所示：

TTCGCTTGCATCAATTATTGCATTTGTTGCAGCAGGTTGTGGACAG-ACAGAATCAGGTTCGACTTCTGATTCTAAACCACAAGCCG(SEQ ID NO:4)。

(5)阴性对照为无RNA酶与DNA酶的ddH₂O；

(6)病毒裂解液

病毒裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS，其在裂解液中的质量分数为0.1-0.2％；③吐温20，其在裂解液中的质量分数为1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的质量分数为1-2％。

本发明DNA模板根据不同的样本情况，采用以下两种不同的方法制备得到：

本发明在核酸提取环节中，直接使用盐酸胍、SDS、吐温20、NP40对微量样本中的病毒进行高效裂解，DNA经释放后可稳定存在，直接用于后续PCR反应。为避免溶血对PCR的影响，建议溶血严重样本使用商品化DNA提纯试剂盒进行提取。

(7)使用说明书。

实施例2猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒的使用方法

本发明试剂盒使用方法具体包括以下步骤：(1)样品采集；(2)样品处理；(3)DNA提取；(4)实时荧光PCR：利用本发明设计的特异性引物和探针进行实时荧光PCR检测；(5)判定结果。

1.样品采集

(1)拭子样品

A、鼻拭子用于鼻咽部标本的采集。首先将待检猪绑定后，棉签轻轻碰到鼻中隔，刺激猪打喷嚏3-5次后，迅速拔出棉签得到鼻拭子样本。

B、咽拭子用于咽部标本的采集，主要用于15kg左右的保育猪样品的采集。首先肌肉注射氯胺酮使待检猪全身麻醉，将嘴轻轻打开，插入喉镜，挑起会厌软骨暴露气管口，将消毒棉签在气管和喉头处擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，要尽量使咽部液体浸湿棉签，迅速取出棉签，及时用高压灭菌的PBS浸泡所取样本。

(2)肺部病料样品

A、剖解取样品：将患病猪剖解，取出完整的肺部样品，放置在同一个干净塑料袋内。

B、记录：将装有样品的塑料袋密封，贴标签并记录发病猪的日龄、体重、品种、临床症状等信息。

C、将采集的病料样品集中送至实验室，并附上所记录的信息。

(3)空气样品

在待检猪场，通过电磁式空气泵(内部保证无菌)抽取猪场内自然空气，注入到无菌PBS的锥形瓶中，边注边轻摇晃动，持续4min，之后高速离心。

(4)血液样品

使用5ml无菌注射器上腔静脉采集仔猪血液，至冰箱冷藏保存，送至实验室检测。

2.DNA提取

(1)全血、病料组织等可使用商品化DNA提纯试剂盒进行提取，方法参照所使用试剂盒说明书。

(2)拭子、空气样品、血清或血浆可使用本发明试剂盒中提供的裂解液进行DNA释放。将上述类型样品进行瞬时离心，微量取样品上清1-2μL置PCR反应管中，加入等体积裂解液，混匀室温静置5min，加入反应体系进行扩增。

所述裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS，其在裂解液中的质量分数为0.1-0.2％；③吐温20，其在裂解液中的质量分数为1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的质量分数为1-2％。

为监测提取过程中的污染，建议在提取样本的同时提取一管水作为阴性对照。

3.荧光PCR反应

对实时荧光PCR反应体系和反应条件进行优化，优化原则为：通过优化使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值。经过优化，实时荧光PCR反应体系和反应条件如下所示：

(1)实时荧光PCR反应体系以20μL计为：10μM SEQ ID NO:1所示的上游扩增引物P46-f：0.4～0.8μL；10μM SEQ ID NO:2所示的下游扩增引物P46-r：0.4～0.8μL；10μM SEQID NO:3所示的特异性荧光探针P46-p：0.2～0.4μL；荧光PCR反应液(含酶)：16μL；DNA模板：2～3μL；ddH₂O：补足至20μL。

同时设有阳性对照和阴性对照，阳性对照克隆质粒pEASY-p46：2～3μL，其余组分相同；阴性对照无RNA酶与DNA酶的ddH₂O：2～3μL，其余组分相同。

(2)荧光PCR反应条件为：50℃UNG酶激活2min；95℃预变性5min；95℃变性15Sec，60℃退火30Sec并收集荧光，共40个循环；结束反应。

(3)结果分析：

实施例3猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒的验证

1.试剂盒扩增效率验证

对阳性对照克隆质粒pEASY-p46进行10倍梯度稀释，使其拷贝数为：1.0×10⁸-1.0×10¹copies/μL，每个梯度重复三次进行猪肺炎支原体核酸实时荧光PCR，根据扩增结果制作标准曲线。

图1为本发明阳性对照10倍稀释的梯度扩增标准曲线(FAM通道)，其中该标准曲线的参数如下：斜率：-3.29，截距：41.50，相关系数：1.000，扩增效率：1.012。

综上，说明该试剂盒检测猪肺炎支原体核酸的扩增效率接近100％。

2.试剂盒灵敏度研究

以10倍梯度稀释的阳性对照克隆质粒pEASY-p46作为模板，进行本发明试剂盒的灵敏度检测，检测范围为10⁸-10¹copies/μL。结果表明，该方法的检测范围为10⁸-10¹copies/μL，在此范围的Mhp核酸含量可以得到可靠的结果，即该方法的灵敏度可以检测到最低10拷贝数的Mhp核酸含量的样品，检测结果见图2。

3.试剂盒特异性研究

为了检测本发明试剂盒的特异性，利用本发明的试剂盒检测猪圆环病毒，猪伪狂犬病毒，猪细小病毒，猪附红细胞体、猪鼻支原体等病原核酸。

检测结果表明：本发明的试剂盒仅对猪肺炎支原体核酸进行扩增，表明本发明试剂盒能特异性检测到Mhp，而不与其它病原核酸发生交叉反应，检测结果见图3。

4.试剂盒重复性研究

选用阳性对照pEASY-p46克隆质粒10⁶、10⁵、10⁴copies/μL，对每个浓度的样本做3个重复，结果不同核酸浓度的检测变异系数(CV)均小于1％，具有较好的重复性。检测结果见表1和图4。

表1实时荧光PCR检测猪肺炎支原体的重复性试验

5.试剂盒准确性临床验证

同时采用本发明的试剂盒以及普通PCR方法对98份血样以及5份健康的血样进行了检测，结果表明，对于临床血液样品的检测，该方法检测Mhp核酸阳性17/98，常规PCR方法检测Mhp核酸阳性4/98，且后者检测的4份样品使用该方法检测均为Mhp核酸阳性，说明该方法更敏感，准确性高；对于阴性临床样品的检测，该方法检测结果同常规PCR一致。

表2采用本发明试剂盒以及普通PCR对临床样品进行猪肺炎支原体核酸检测结果的比较

综上可见，本发明设计的一对特异性引物和一条荧光探针以及构成的试剂盒可以快速检测猪肺炎支原体，而且该检测方法简单、快速、特异性好、灵敏度高、可重复性好，检测结果真实可靠。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>湖南新南方养殖服务有限公司

<120>一种猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒及其用途

<130> FI160721-ND

<160> 4

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

ttcgcttgcatcaattattg 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

cggattgtggtttagaatc 19

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

tgattctgtctgtccacaacctgctgc 27

<210> 4

<211> 86

<212> DNA

<213>Mhp p46基因序列

<400> 4

ttcgcttgcatcaattattgcatttgttgcagcaggttgtggacagacagaatcaggttc 60

gacttctgattctaaaccacaagccg 86

Claims

1.一种猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：

特异性荧光探针P46-p：FAM-5’-TGATTCTGTCTGTCCACAACCTGCTGC-3’-TAMRA，其为SEQID NO:3序列，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述上游扩增引物P46-f、所述下游扩增引物P46-r和所述特异性荧光探针P46-p的摩尔比为2:2:1。

3.根据权利要求2所述的猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述上游扩增引物P46-f、所述下游扩增引物P46-r和所述特异性荧光探针P46-p在所述试剂盒中的使用终浓度均为0.1～0.4μM。

4.根据权利要求1所述的猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、荧光PCR反应液(含酶)、裂解液及说明书。

5.根据权利要求4所述的猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为无RNA酶与DNA酶的ddH₂O；所述阳性对照为克隆有猪肺炎支原体p46基因序列的克隆质粒pEASY-p46，克隆质粒pEASY-p46的终浓度为1.0×10⁵copies/μL～1.0×10⁷copies/μL；所述裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS 0.1-0.2％；③吐温20 1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40 1-2％。

6.根据权利要求5所述的猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述猪肺炎支原体p46基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

7.根据权利要求6所述的猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述克隆质粒pEASY-p46采用以下方法制备得到：提取猪肺炎支原体DNA，利用引物p46-f和p46-r扩增得到猪肺炎支原体p46基因片段，通过TA克隆将猪肺炎支原体p46基因片段连接至pEASY-T1载体，转化后筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为pEASY-p46。

8.一种如权利要求1-7任一项所述的猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)使用权利要求1-7任一项所述的实时荧光PCR试剂盒进行PCR扩增时，实时荧光PCR反应体系以20μL计为：

10μM的SEQ ID NO:1所示的上游扩增引物P46-f：0.4～0.8μL；

10μM的SEQ ID NO:2所示的下游扩增引物P46-r：0.4～0.8μL；

10M的SEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针P46-p：0.2～0.4μL；

荧光PCR反应液(含酶)：16μL；

DNA模板：2～3μL；

ddH₂O：补足至20μL；

(3)结果分析：

9.根据权利要求8所述的猪肺炎支原体的实时荧光PCR检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述DNA模板采用以下方法制备得到：

(2)拭子、空气样品、血清或血浆可使用本发明试剂盒中提供的裂解液进行DNA释放，将上述类型样品进行瞬时离心后，微量取样品上清1-2μL置PCR反应管中，加入等体积的裂解液，混匀室温静置5min，加入反应体系进行扩增。

10.权利要求1-7任一项所述的试剂盒在制备检测猪肺炎支原体试剂中的用途。