CN102140551B - 猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光rt-pcr检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的实时荧光RT-PCR检测的核苷酸引物、探针序列及方法，以及该方法在临床上检测猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。本发明的方法具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的特点，适于猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速检测。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种猪繁殖与呼吸综合征通用型实时荧光RT-PCR检测方法。 

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍、哺乳仔猪呼吸困难为特征的高度接触性传染病。本病在1987年首次暴发于美国，随后在加拿大、欧洲与亚洲相继出现，目前已经在世界范围内流行，造成巨大的经济损失。我国在1995年首次出现PRRS，随后迅速蔓延。2006年在我国全面暴发了体温高、发病率高、死亡率高为主要临床特征的猪“高热病”，而导致该病的病原是较之前在国内流行的经典PRRSV发生变异的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(highly pathogenicPRRS，HP-PRRS)。目前为止，PRRSV有两种型，欧洲型和美洲型，而美洲型又分为两种亚型，经典美洲株和高致病性美洲株，三种亚型毒株在基因序列上存在一定差异。我国国内主要流行的为美洲型毒株，欧洲株也偶有发现，因此在临床上需要一种能够快速诊断PRRSV的检测方法。 

传统的PRRSV检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、间接免疫荧光试验(IFA)、间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)和反转录-聚合酶链反应试验(RT-PCR)等，它们在病毒诊断与进出口检验检疫中发挥了重要作用，但各自在敏感性、特异性或时效性等方面存在不足。而荧光RT-PCR方法较之以往方法具有特异性更强、灵敏度高、重复性好、定量准确，全封闭反应能有效解决PCR污染问题，且自动化程度高等特点。因此，建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的猪繁殖与呼吸综合征通用型荧光RT-PCR的检测方法对快速诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒具有现实意义。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种猪繁殖与呼吸综合征通用型 的实时荧光RT-PCR检测方法。此方法快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好，为评价猪繁殖与呼吸综合征的感染情况提供了技术支持。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室(农业部兽医诊断中心)提供如下病毒：欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒；美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株；高致病性猪繁殖与呼吸综合征2006-2010年不同时期野毒株；其他猪源病毒包括马动脉炎病毒(EAV)、猪瘟病毒(CSFV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)。 

猪繁殖与呼吸综合征特异性引物和探针设计：所述的特异性引物，指的是：长度为18～20个碱基左右的寡核苷酸链，与猪繁殖与呼吸综合征欧洲型和美洲型毒株的Nsp7基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或者反向互补；所述的特异性探针，指的是：长度为15个碱基的寡核苷酸链，其5’端标记FAM荧光激发基团，3’端标记自身不发光的淬灭基团，同时另增加一个小沟结合物(minor groove binder，MGB)分子，与猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或反向互补。 

本文所列出的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向书写。 

用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的寡核苷酸引物对特征如下：由序列为ACTTCCAGATGCAGATTGTG及ACCTCCAGATGCCGTTTGTG的上游引物PRRSV-Eu-F22和PRRSV-Na-F22和序列为TCGTGCTGGGCGGCAAACG及TCGTGTTGGGTGGCAGAAA的下游引物PRRSV-Eu-R22和PRRSV-Na-R22组成； 

用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的探针序列特征如下，该探针为PRRSV-P2，其序列为TACATTYTGGCCCCTGC(Y＝T/C)。 

本发明还涉及一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的寡核苷酸引物对和探针的组合物。 

此外，还可将上述组合物制备成试剂盒。 

进一步，本发明还涉及试剂盒在检测猪繁殖与呼吸综合征中的用途，其中的探针用任意一种荧光素标记，可选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5。 

一种利用上述寡核苷酸引物对和探针的组合物检测猪繁殖与呼吸综合征的实时荧光RT-PCR方法，包括： 

(1)针对PRRSVNsp7基因设计能够检测猪繁殖与呼吸综合征的特异性引物和探针序列； 

(2)采用FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5任意一种荧光素标记猪繁殖与呼吸综合征病毒的探针序列； 

(3)将用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物和探针置于同一个反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光RT-PCR反应。 

本发明的显著特点是：充分运用PCR技术的高效扩增性、核酸杂交技术的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，对样本进行猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测，具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好、提高检测效率等优点。 

附图说明

图1猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR引物与探针优化组合筛选； 

图2猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测特异性试验扩增曲线； 

图3猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测敏感性试验扩增曲线。图中曲线依次代表猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)在浓度为TCID₅₀10^5.5～10^1.5时的扩增结果； 

图4猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)实时荧光RT-PCR检测重复性试验扩增曲线； 

图5不同猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR扩增曲线。 

具体实施方式

下列实施例中的常规实验方法，参见Sambrook等编写的《分子克隆实验指南》第三版(北京：科学出版社，2002)，仪器的使用参照仪器操作说明书。 

实施例1 

标准品RNA的构建 

(1)实验试剂 

限制性酶Pst I及其缓冲液，DL2000Marker购自TaKaRa公司； 

连接试剂盒、Taq DNA聚合酶、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs购自Promega公司； 

DNA胶回收试剂盒，购自OMEGA公司； 

高效大肠杆菌感受态细胞DH5α购自北京全式金生物技术有限公司； 

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成； 

其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。 

(2)实验仪器 

TGRANDIENT PCR仪：购自HYBAID公司；DYFIII2型电泳仪：购自Bio-Rad公司； 

UVP凝胶成像分析系统：购自Gene公司；Steril 生物安全柜：购自BAKER公司；恒温水浴锅：购自pHaramacia公司；恒温培养箱：购自Kendro公司。 

(3)实验步骤 

①在GenBank上查找所有已知PRRSV基因组序列，通过序列比对确定猪繁殖与呼吸综合征病毒的Nsp7基因的特异性高度保守区。设计包含猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光RT-PCR扩增核苷酸片段的引物，引物序列见表1。以猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)的RNA为模板，进行RT-PCR扩增，RT-PCR扩增体系和扩增条件见表2，将通过扩增得到的含猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)的保守序列的核苷酸片段称为基因PRRSV-Nsp7； 

②将扩增得到的基因PRRSV-Nsp7核苷酸片段纯化回收，连接到 Easy载体(10μL连接体系：3μL基因扩增产物，1μLpGEM-T Easy载体，1μLT4DNA连接酶，5μL T4DNA连接缓冲液；4℃过夜)，然后将连接产物转化到DH5α感受态细胞。通过质粒的纯化和鉴定，得到含有基因PRRSV-Nsp7片段的标准品质粒； 

③用Pst I将PRRSV-Nsp7重组质粒酶切线形化，再以线性化片段为模板进行体外转录(用Promega RiboMAX^TM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒)，反应结束后向体外转录产物中加入RQ1DNA酶除去残余的DNA分子。经提取和纯化，得到标准品RNA分子。 

表1猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)标准品的扩增引物序列 

表2-1猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)标准品的RT-PCR扩增体系 

附：*所用引物与表1中的引物相对应。 

表2-2猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)标准品的RT-PCR扩增条件 

实施例2 

样本RNA的提取 

按照常规方法，利用QIAGEN 

Mini Kit试剂盒(购自QIAGEN公司)，提取猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)的RNA。 

实施例3 

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR方法特异性引物和探针组合筛选试验 

(1)实验试剂 

One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa公司； 

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型TaqMan MGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。 

(2)实验仪器 

Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System 

(3)实验过程 

①猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)的引物与探针设计 

猪繁殖与呼吸综合征病毒的特异性引物，指的是：长度为18～20个碱基左右的寡核苷酸链，与猪繁殖与呼吸综合征Nsp7基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或者反向互补； 

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型的特异性探针，指的是：长度为15个碱基左右的寡核苷酸链，其5’端标记FAM或HEX等荧光激发基团，3’端标记自身不发光的淬灭基团同时另增加了小沟结合物(minor groove binder，MGB)分子；与猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp7基因高度保守区的特异性核苷酸片段完全相同或者反向互补。 

根据获得的Nsp7基因特异性高度保守区域，利用Primer Express5.0软件设计针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的TaqMan MGB探针，在探针靶位置两侧设计多对引物以供筛选。引物对与探针的具体序列见表3。 

表3猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR引物筛选与探针 

*：W＝A/T，Y＝T/C，M＝A+C 

②猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR反应体系与扩增条件 猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR反应体系与扩增条件参考TaKaRa One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit试剂盒说明书，具体反应体系见表4-1，扩增条件见表4-2。 

表4-1猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR反应体系 

表4-2猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR扩增条件 

(4)结果判定 

①结果分析条件设定 

读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。 

②结果描述及判定 

对比不同引物对与探针组合的扩增情况，遵循特异性原则、敏感性原则和最高效扩增原则，选定特异性好、敏感性高、可靠性好的猪繁殖与呼吸综合征病毒检测用引物对与探针最佳组合。 

(5)筛选试验方法与结果 

引物与探针的优化筛选方法如下： 

任意选择一套引物与探针进行组合，做平行试验，以能同时获得最小的Ct值和最高的扩增效率为筛选标准，选出最佳引物与探针组合。 

通过多次重复、对比试验，选定猪繁殖与呼吸综合征病毒检测用引物对与探针的最佳组合，组合筛选结果如图1，具体序列见表5。 

表5猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR方法的引物和探针序列 

*：Y＝T/C 

实施例4 

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法的建立 

(1)实验试剂 

One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa公司； 

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型TaqMan MGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。 

(2)实验仪器 

Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System 

(3)实验过程 

①猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR反应体系的优化 

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR反应体系的优化原则是：通过优化以下各个条件使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值。 

a、最佳荧光引物浓度的确定：荧光引物浓度在400nM到720nM之间进行筛选。 

b、最佳探针浓度的确定：探针浓度在100nM到500nM之间进行筛选。 

c、反转录酶的用量确定：反转录酶的用量在1U到5U之间进行筛选。 

d、Taq DNA聚合酶的用量确定：Taq聚合酶的用量在1U到5U之间进行筛选。 

②猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR扩增条件的优化 

以55℃、58℃、60℃、62℃为退火温度进行荧光RT-PCR，选择最佳退火和延伸温度。 

(4)结果判定 

①结果分析条件设定 

读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。 

②结果描述及判定 

对比不同条件下的扩增情况，遵循扩增曲线达到最小Ct值和最大扩增效率的优化原则，选定猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR的最优反应体系与扩增条件。 

(5)反应条件优化试验结果 

通过多次重复、对比试验，选定高猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR的最优反应体系与扩增条件，分别见表6-1与表6-2，从而建立猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法。 

表6-1猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型荧光RT-PCR检测的反应体系 

表6-2猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型荧光RT-PCR检测的扩增条件 

实施例5 

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法特异性试验 

(1)实验毒株 

欧洲性猪繁殖与呼吸综合征病毒LV、DX、NM191株； 

美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株VR-2332、VR2549株、CH-1R； 

高致病性猪繁殖与呼吸综合征野毒株：2006年分离株JXA1，2007年分离株HUB1，2008年分离株SQ、HN，2009年分离株KT2009004、JL，以及2010年分离株KT20100003、KT20100009、KT20100015、KT20100029； 

其他猪源病毒：马动脉炎病毒(Equine arteritis virus，EAV)Aus株，猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)HEBGA08株、日本乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus，JEV)BJCP08株、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)XJ03株、猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)NADL-2株、猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus type 2，PCV2)TJ08-1株。 

以上病毒均由中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室(农业部兽医诊断中心)提供。 

(2)实验试剂 

One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa公司； 

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型TaqMan MGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。 

(3)实验仪器 

Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System 

(4)实验过程 

①实验病毒的核酸提取 

使用实施例2中的RNA提取方法提取以下病毒的RNA： 

欧洲性猪繁殖与呼吸综合征病毒LV、DX、NM191株； 

美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株VR-2332、VR2549株、CH-1R； 

高致病性猪繁殖与呼吸综合征野毒株：2006年分离株JXA1，2007年分离株HUB1，2008年分离株SQ、HN，2009年分离株KT2009004、JL，以及2010年 分离株KT20100003、KT20100009、KT20100015、KT20100029； 

以及其他猪源病毒，包括EAVAus毒株、CSFV HEBGA08毒株、JEV BJCP08毒株； 

另外，使用 

DNA Mini kit按照试剂盒说明书提取PPV NADL-2毒株、PCV2TJ08-1毒株、PRV XJ03毒株的DNA。 

②猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法特异性试验 

使用实施例4中的猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法，对上述病毒的核酸进行检测，以确定该方法的特异性。 

(5)结果判定 

①结果分析条件设定 

读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。 

②质控标准 

阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线； 

阳性对照的Ct值应≤38，且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。 

③结果描述及判定 

阴性样本无Ct值并且无特异性扩增曲线，表示样本中无猪繁殖与呼吸综合征病毒。 

阳性样本Ct值≤38，且出现特异性扩增曲线，表示样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒。 

有效原则：样本Ct值在38-45之间时需要进行重复试验。重复试验结果Ct值≤38时样品为阳性，否则为阴性。 

(6)样本检测结果 

各种亚型的猪繁殖与呼吸综合征病毒均能得到特异性的荧光扩增曲线，而其他病毒没有荧光扩增曲线(图2)。 

实施例6 

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法敏感性试验 

(1)实验试剂 

One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa公司； 

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型TaqMan MGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。 

(2)实验仪器 

Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System 

(3)实验过程 

①猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)RNA样品制备 

使用实施例2中的RNA提取方法提取猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)(10^5.5TCID50/mL)的RNA，并对所得RNA进行10倍连续稀释，得到6个稀释度的待检样品。 

②猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)实时荧光RT-PCR检测方法敏感性试验 

使用实施例4中的猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)实时荧光RT-PCR检测方法，对上述RNA样品进行检测，以判定该方法的敏感性。 

(4)结果判定 

①结果分析条件设定 

读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。 

②质控标准 

空白对照无Ct值并且无特异性扩增曲线； 

阳性对照的Ct值应≤38，且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。 

(5)梯度稀释样本检测结果 

由试验结果可见，猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)实时荧光RT-PCR检测方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)的敏感性达到10^1.5TCID₅₀/mL(图3)。 

实施例7 

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法重复性试验 

(1)实验试剂 

One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa公司； 

猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)TaqMan MGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。 

(2)实验仪器 

Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System 

(3)实验过程 

使用实施例4中的猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法，对5个10倍连续稀释的猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)(10^5.5TCID₅₀/mL～10^1.5TCID₅₀/mL)的RNA在同一反应条件下进行5次独立检测，以确定此方法的批内重复性；连续5天对同样的稀释样品进行检测，以确定此方法的批间重复性。 

(4)实验结果 

分析每个反应的Ct值，可见该方法针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(JXA1株)的批内变异系数及批间变异系数分别为0.12％-2.77％和0.52％-1.88％。批内及批间重复试验结果见表7，批内重复试验如图4。 

表7猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法重复性试验 

实施例8 

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法与病毒分离方法的对比试验 

(1)实验试剂 

One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa公司； 

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型TaqMan MGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。 

(2)实验仪器 

Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System 

(3)实验过程 

收集已采用Marc-145细胞分离出猪繁殖与呼吸综合征病毒的11份临床样品，使用实施例2中的RNA提取方法提取RNA，利用实施例4中的猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法进行检测，比较二者的符合率。 

(4)实验结果 

分析检测结果，在11份猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性临床样品中，实时荧 光RT-PCR方法可检出11份猪繁殖与呼吸综合症病毒阳性，与病毒分离方法符合率为100％。 

实施例9 

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法应用 

(1)实验样品 

临床发病的，并经过其他检测方法确定为阳性的猪血清、猪肺脏、猪淋巴结、猪扁桃体、猪脑组织。 

以上均由中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室(农业部兽医诊断中心)提供。 

(2)实验试剂 

One Step PrimeScript^TM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa公司； 

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型TaqMan MGB探针及引物由上海基康生物技术有限公司合成。 

(3)实验仪器 

Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System 

(4)实验过程 

取临床发病猪的血清、肺脏、淋巴结、扁桃体及脑组织，使用实施例2中的RNA提取方法对血清和组织样品提取RNA，利用实施例4中的猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法进行检测。 

(5)结果判定 

①结果分析条件设定 

读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。 

②质控标准 

阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线； 

阳性对照的Ct值应≤38，且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。 

③结果描述及判定 

阴性样本无Ct值并且无特异性扩增曲线，表示样本中无猪繁殖与呼吸综合征病毒。 

阳性样本Ct值≤38，且出现特异性扩增曲线，表示样本中有猪繁殖与呼吸 综合征病毒。 

有效原则：样本Ct值在38-45之间时需要进行重复试验。重复试验结果Ct值≤38时样品为阳性，否则为阴性。 

(6)样本检测结果 

分析发病猪的血清、肺脏、淋巴结、扁桃体及脑组织实时荧光RT-PCR扩增曲线(见图5)，可见检测结果均为阳性，其中猪血清和猪肺脏中病毒含量较高，而其他组织中病毒含量较低，这符合临床上PRRSV在猪体内的分布情况(表8)。 

表8对临床发病猪的血清和组织样品进行 

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光RT-PCR检测(一) 

Claims (4)

1.一种用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的寡核苷酸引物对和探针的组合物，所述寡核苷酸引物对，由5’端向3’端方向书写，序列为：

上游引物PRRSV-Eu-F22，序列为：ACTTCCAGATGCAGATTGTG；

上游引物PRRSV-Na-F22，序列为：ACCTCCAGATGCCGTTTGTG；

下游引物PRRSV-Eu-R22，序列为：CGTATGCCGCCCAGCACGA；

下游引物PRRSV-Na-R22，序列为：TTTCTGCCACCCAACACGA；

所述探针为：TACATTYTGGCCCCTGC，其中Y=T/C。

2.权利要求1中的组合物，其中所述探针用以下任意一种荧光素标记：FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5。

3.一种包括权利要求1所述组合物的试剂盒。

4.权利要求1所述的寡核苷酸引物对和探针的组合物在制备检测猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型的试剂盒中的用途。

Images