CN101550453B - 检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测血清或肺脏、肝脏、肾脏、淋巴结等组织样品中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株存在的试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期、快速诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株感染的试剂盒。

Description

检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的试剂盒

技术领域

本发明涉及检测血清或肺脏、肝脏、肾脏、淋巴结等组织样品中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株存在的试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期、快速诊断猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株感染的试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸系统综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，以引起母猪繁殖障碍、仔猪和肥育猪呼吸道症状为主要特征。该病在全世界范围内大规模的流行，给养猪业造成了极大的经济损失。2006年夏季，我国中南部爆发了高致病性猪蓝耳病，之后蔓延到全国各个省市。其病原已确定是Nsp2基因发生连续缺失的高致病性猪蓝耳病病毒变异株。高致病性猪蓝耳病能使各种年龄、各种品种的猪都感染发病，且发病率高、病死率高、治愈率较低。2007年，全国共有26个省份发生了高致病性猪蓝耳病，发病猪数量达30多万头。直至今日，疫病形势依然严峻，严重地影响了我国畜牧业生产。因此，为了监测和控制高致病性猪蓝耳病的感染，研究高致病性猪蓝耳病毒变异株的快速检测方法具有重要意义。

PRRSV传统的检测方法主要是病毒的分离培养鉴定，虽然该方法具有一定的特异性和敏感性，但是PRRSV培养的条件苛刻，一般实验室难以实现，同时操作繁琐且耗时长，不利于对大规模样品进行检测。免疫学检测PRRSV的方法主要有酶联免疫吸附试验、间接荧光抗体试验等，但都有敏感性低或特异性较差的问题。此外，上述的这些检测方法还存在着无法区分普通PRRSV和现时国内流行的高致病性PRRSV变异株的局限性。由于高致病性猪蓝耳病发病率高、病程进展快、病死率高，传统的检测方法有可能延误诊断和治疗，因此，开发早期、快速、特异、敏感的检测技术非常必要。

近年来，随着分子诊断技术的飞速发展，聚合酶链反应(PCR)技术已经广泛应用于细菌、病毒基因水平的研究，也给微生物的快速鉴定提供了可能。针对国内流行的高致病性PRRSV变异株基因组的特点，国内学者建立了高致病性PRRSV RT-PCR检测技术(童光志，周艳君，郝晓芳.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析.中国预防兽医学报，2007，29(5)：321-326)，该方法可以扩增PRRSV Nsp2基因，测序后通过软件进行比较，看是否在NSP2处发生缺失或缺失的区域是否与报道的缺失区域相同。这种方法虽然能够区分普通猪蓝耳病和高致病性猪蓝耳病，但显然比较费时费力，不适用与临床检测。还有学者通过参考普通PRRSV及高致病性PRRSV变异株的Nsp2基因序列，设计一对位于紧靠缺失区两端的保守区的引物，其扩增范围覆盖整个缺失区域，缺失毒株(高致病性PRRSV变异株)和非缺失毒株(普通PRRSV株)，预期扩增产物长度分别约230bp和320bp，通过凝胶电泳分析可分别检测出普通猪蓝耳病和高致病性猪蓝耳病(郝晓芳，周艳君，田志军.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立.中国预防兽医学报，2007，29(9)：705-709)。但该方法由于需要对PCR产物进行电泳或杂交分析等后处理，极易造成PCR产物污染，导致假阳性，不宜用于临床诊断。

实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种(Mackay IM et al.Real-time PCR in virology.Nucleic Acids Res.2002 5；30(6)：1292-1305；Lie，Y.S.，Petropoulos，C.J.，Advances in quantitative PCR technology：5’nuclease assays.Current Opinion inBiotechnology 1998.9，43-48.)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。

与普通PCR相比，TaqMan PCR技术具有如下优点：通过对扩增曲线以及对数增长期的循环阈值(Ct)的分析，摒弃普通PCR方法受多种因素干扰的终点分析方法，能够对检测样品进行准确定量分析，从而有效监测药物治疗的效果；将DNA扩增与检测过程融合为一体，可以实时、动态监测DNA扩增的全过程，省掉了PCR后处理过程大大缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便；由于采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性；由于在普通PCR基础上增加了一条可与模板互补配对的荧光探针，进一步提高了检测靶多核苷酸的特异性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。

美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒，如用于HIV、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等的实时荧光PCR检测的试剂盒。同样，中国目前也已批准了乙型肝炎、丙型肝炎、HIV和SARS等的实时荧光PCR检测试剂盒的生产和临床应用。因此，现在需要开发一种能够检测高致病性猪蓝耳病的实时荧光PCR试剂盒，满足高致病性猪蓝耳病的检测与监测工作的需要。

众所周知，在使用已知的实时荧光定量PCR技术检测和定量分析临床样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，一个关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的引物和寡核苷酸探针。本发明人将实时荧光定量PCR技术应用于高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的检测和定量分析，成功地完成了本发明。

发明内容

本发明涉及检测血清及肺脏、肝脏、淋巴结等组织样品中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株存在的试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术早期、快速诊断高致病性猪蓝耳病感染的试剂盒。

因此，本发明的目的是提供一种使用实时荧光PCR技术来定性及定量检测样品中高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的试剂盒，特别是涉及高致病性猪蓝耳病感染的早期和反复感染期在实验室诊断中的应用。基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物和一条靶多聚核苷酸的特异性探针，在耐热DNA聚合酶(Taq酶)、逆转录酶(RT酶)、RNA酶抑制剂(RNasin)、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg²⁺等PCR反应缓冲液中，通过DA7600、ABI7500等荧光PCR扩增仪实现靶多核苷酸的循环扩增，从而达到快速、实时、定量检测靶多核苷酸的目的。

本发明所提供的检测临床样品中高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的试剂盒包括：(1)分别装有RNA提取液(TRIzol试剂)、PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其特征在于PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的正向引物NspF和反向引物NspR的序列分别是：5′-CAA CAA CGC TGA CGC ACC AG-3′(SEQ ID NO：1)和5′-ATG CCC ATG TTCTGC GAT G-3′(SEQ ID NO：2)，其中正向引物NspF可向5’和3’端方向各延伸8个碱基，反向引物NspR可向5’和3’端方向各延伸8个碱基。

根据本发明的一个优选实施方案，PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针NspP的序列是：5′-CGT CTG TGA GGA CGC AGA CAA ATC C-3′(SEQ IDNO：3)，其中该寡核苷酸探针序列可向5’和3’端方向各延伸8个碱基。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液由(a)耐热DNA聚合酶(Taq酶)、(b)逆转录酶(RT酶)、(c)RNA酶抑制剂(RNasin)、(d)脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、(e)能够与双链靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物，(f)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物，(g)和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针组成。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增反应液中的最佳引物浓度为0.4μmol/L、探针浓度为0.2μmol/L；

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增反应液中的最佳镁离子浓度为2.1mmol/L、Taq酶最佳用量为5U/反应、RT酶最佳用量为100U/反应、RNasin最佳用量为20U/反应、脱氧核糖核苷三磷酸最佳浓度为0.20mmol/L。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增的最佳反应温度和时间为：40℃逆转录25min；然后94℃预变性3min；最后93℃15s，55℃45s，40个循环。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中阴性质控品为生理盐水。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中阳性质控品为含有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株Nsp2片段的质粒，包括1×10⁶copies/ml的强阳性质控品和1×10³copies/ml的临界阳性质控品。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中定量参考品为含有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株Nsp2基因片段的质粒，包括4个浓度梯度：1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml。

本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒可以检测出高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的最低浓度为1.0×10²copies/ml，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。

本发明针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的Nsp2基因片段设计特异引物和探针，可检测出高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株，但不能检测出非高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株病原体，说明本试剂盒具有很好的特异性。

本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒可以检测血清及肺脏、肝脏、淋巴结等组织样品中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株；可为灵敏、快速早期诊断高致病性猪蓝耳病感染以及诊断高致病性猪蓝耳病反复感染提供可靠的实验证据；同时由于能准确定量，所以可对临床用药进行有效监测。

附图说明

图1显示3个阳性参考品的检测结果图，3个阳性参考品的Ct值为20～31(20.07、26.28、30.17)，扩增曲线有明显指数增长期，成S型，可明确判定为阳性

图2显示阴性参考品的检测结果图，6个阴性参考品的扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。6个阴性参考品包括和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株感染有相似症状的猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒和PRRSV CH-1a株(非高致病性变异株)等感染猪的病毒。

图3显示线性与灵敏度标准品扩增结果的标准曲线。针对模板数为1.0×10¹～1.0×10⁷copies/ml的反应体系进行TaqMan PCR分析。当病毒量为1.0×10²copies/ml时，检测样品的Ct值在33左右，即检测下限灵敏度可到达1.0×10²copies/ml。绘制得到的标准曲线斜率为-2.864722，在Y轴截距为38.40，相关系数(R²)＝0.996781。

图4显示同一份阳性标本6次重复性实验的检测曲线，可看出不同的扩增曲线均在同一Ct值范围，变异系数CV＜6％，说明试剂盒的重复性好。

图5显示6个临床阳性标本的扩增曲线。6个标本的Ct值分别是13.95，14.45，14.74，19.07，26.39，30.00；结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株检测试剂的研制

1、引物和探针的设计：通过对Genbank数据库已有的全部高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株核酸序列以及国内外已发表文献中报导的核酸序列进行序列比对分析，以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株发生连续缺失的Nsp2基因片段为扩增靶位点，选择无二级结构且高度保守的区段，根据引物探针设计的基本原则，利用软件和人工设计多对引物和探针。

2、临床样本的选择：根据国内外相关文献报道表明，可以选择猪的血清及肺脏、肝脏、淋巴结等组织样品。

3、反应体系的建立与优化

样品的准备：以病毒培养和测序鉴定为阳性的高致病性猪蓝耳病病毒变异株作为高致病性猪蓝耳病病毒变异株检测的阳性标准品；以猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒和PRRSV CH-1a株作为阴性参考品。分别用TRIzol试剂提取上述阳性标准品与阴性参考品的RNA待用。

引物探针的筛选：以上述1中设计的多组引物探针分别检测上述的阳性标准品与阴性参考品的RNA，经反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物探针组合(如序列表中SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3)。

引物探针浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.15μmol/L至0.5μmol/L浓度梯度的引物和从0.075μmol/L至0.5μmol/L浓度梯度的探针进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的引物浓度为0.4μmol/L、探针浓度为0.2μmol/L。

镁离子浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1mmol/L至2.5mmol/L浓度梯度的镁离子进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的镁离子浓度为2.1mmol/L。

Taq酶用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1U(酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的Taq酶用量为5U/反应。

RT酶用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从50U(酶单位)至400U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RT酶用量为100U/反应。

RNasin用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从5U(酶单位)至40U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RNasin用量为20U/反应。

dNTPs浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1mmol/L至0.25mmol/L浓度梯度的dNTPs进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs浓度为0.20mmol/L。

反应温度的优化：根据酶的活性和靶多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：40℃逆转录25min；然后94℃预变性3min；最后93℃15s，55℃45s，40个循环。

4、灵敏度实验：测定浓度为1.0×10⁹copies/mL的含有高致病性猪蓝耳病病毒变异株Nsp2片段的质粒，10倍梯度稀释成1.0×10⁶copies/mL、1.0×10⁵copies/mL、10×10⁴copies/mL、1.0×10³copies/mL、1.0×10²copies/mL、1.0×10¹copies/mL作为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株线性灵敏度参考品，检测结果表明，本试剂盒的灵敏度为1.0×10²copies/mL。

5、临床标本检测；以猪的血清及肺脏、肝脏和淋巴结等内脏标本作为待检标本，分别用TRIzol试剂提取标本的RNA后，经上述优化建立的核酸扩增体系检测，结果表明本试剂盒可以很灵敏的检测出临床标本中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株。

实施例2：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株检测试剂盒及其使用

1、制备包括下列组成成分的试剂盒：RNA提取液(50ml/管)1管、PCR扩增反应液(20μl/管)24管、阴性质控品(100μl/管)1管、阳性质控品(100μl/管)1管、定量标准品(50μl/管)4管。

2、标本采集、运送和保存

(1)标本采集：血清和肺脏等组织标本-取疑似病例或病死猪的血清及肺脏、肝脏和淋巴结等组织标本(详细操作请参照兽医临床诊断有关规范)，并尽快送检或冻存。

(2)标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可保存于-20℃或-20℃以下低温、液氮等条件下，以保持标本的感染性；并将标本放在密封的袋或盒内并注明其危险性以防病毒的扩散，长期保存需在-70℃冰箱或液氮中进行；标本的运送应在冰皇、干冰或液氮条件下进行，并尽快运送至实验室。

3、检测步骤

(1)RNA提取

肺脏、肝脏和淋巴结等组织标本以灭菌剪刀剪取组织标本约200mg，剪碎后置于盛有1ml预冷TRIzol试剂的研钵中，研磨匀浆后再加入1ml预冷TRIzol试剂，继续研磨均匀后转移1.2ml匀浆液至1.5ml离心管中，室温孵育5min；血清标本则取100μl于1.5ml离心管中，加入lml预冷TRIzol试剂，振荡混匀，室温孵育5min；

2～8℃下12,000rpm离心10min，吸取上清至另一干净的1.5ml离心管；

加入0.2ml氯仿，盖紧盖子，手动用力颠倒摇动15s(不可用振荡器)，室温孵育2～3min；

2～8℃下12000rpm离心15min后，取最上层的上清液至另一干净的1.5ml离心管；

加入0.5ml预冷的异丙醇，缓慢颠倒充分混匀后，-20℃静置15min，2～8℃，12000rpm离心10min，小心弃尽上清液；

加入1ml预冷的70％的冰冷乙醇，手动颠倒数次洗涤沉淀，2～8℃，8000rpm离心5min，小心弃尽上清液；

空气或真空干燥5～10min，加入50μl DEPC H₂O，55～60℃下孵育10min，手指轻轻弹打管底，使其充分溶解，直接用于实验或-70℃保存备用。

(2)PCR反应与结果分析

分别取阴性质控品、标本、阳性质控品、定量参考品品各5μl，加入PCR反应管中进行PCR扩增。PCR循环条件是：40℃逆转录25min；然后94℃预变性3min；最后93℃15s，55℃45s，40个循环。。

反应结束后保存检测数据文件。根据PCR扩增结果所得到的曲线图调节分析参数，使标准曲线(Std curve)窗口下的标准曲线达到最佳(即相关性数值绝对值＞0.97)(参见附图3所示)。由附图1可以看出，阳性样品的荧光曲线与设定的阈值线有一交点，由交点所在位置得出Ct值分别为16.77，20.34，23.04；在附图2中，由于阴性标本的荧光曲线低于阈值，故没有Ct值。最后由仪器自动分析装置计算出未知标本的测定数值(Qty)，即标本中高致病性猪蓝耳病病毒变异株的浓度分别为2.51×10⁶copies/ml、1.71×10⁴copies/ml、7.46×10²copies/ml。

实施例3：应用高致病性猪蓝耳病病毒变异株检测试剂盒定量检测临床样品

临床样品来自华南农业大学兽医学院，包括血清标本3份，组织标本3；标本RNA提取、PCR反应与结果分析参照实施例2进行。

PCR反应结束后，根据扩增曲线先调节分析参数，使标准曲线(Std curve)窗口下的标准曲线达到最佳(即相关性数值绝对值＞0.97)，然后分析临床样品。临床样品的检测结果如附图5所示：六个临床阳性标本扩增曲线的Ct值分别是13.95，14.45，14.74，19.07，26.39，30.00，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性；参照同一次试验中线性定量参考品的标准曲线图(如附图3所示)可以判定6个临床阳性标本的高致病性猪蓝耳病病毒变异株浓度分别为：3.43×10⁸copies/ml、2.29×10⁸copies/ml、1.83×10⁸copies/ml、5.58×10⁶copies/ml、1.55×10⁴copies/ml、8.57×10²copies/ml。

序列表

<110>中山大学达安基因股份有限公司

<120>检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的试剂盒

<140>

<141>

<160>3

<210>1 

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>1

caacaacgctgacgcaccag

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>2

atgcccatgttctgcgatg

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。

<400>3

cgtctgtgaggacgcagacaaatcc

Claims (7)

1.一种定量及定性检测样品中高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，该试剂盒包括：(1)分别装有RNA提取液、PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR扩增反应液由耐热DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、脱氧核糖核苷三磷酸、正向引物、反向引物，两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向引物和反向引物的序列分别为5′-CAACAACGCTGACGCACCAG-3′和5′-ATGCCCATGTTCTGCGATG-3′，PCR扩增反应液中所使用的寡核苷酸探针的序列为：5′-CGTCTGTGAGGACGCAGACAAATCC-3′。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中正向引物浓度为0.4μmol/L、反向引物浓度为0.4μmol/L、寡核苷酸探针浓度为0.2μmol/L。

3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中耐热DNA聚合酶的浓度为5U/反应。

4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中逆转录酶的浓度为100U/反应。

5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中RNA酶抑制剂的浓度为20U/反应。

6.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为0.20mmol/L。

7.根据权利要求1中试剂盒，其特征还在于所检测的样品可选自猪的血清及肺脏、肝脏、肾脏、淋巴结等组织样品。

Images