CN110184390A

CN110184390A - 用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重fq-pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN110184390A
Application number: CN201910496893.6A
Authority: CN
Inventors: 闫若潜; 班付国; 王淑娟; 王东方; 刘影; 赵美雪; 杨海波; 刘毅; 宋丹; 赵雪丽; 谢彩华; 马震原; 王翠; 王华俊; 刘梅芬; 柴茂; 王英华
Original assignee: HENAN PROVINCIAL CENTER FOR ANIMAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Current assignee: HENAN PROVINCIAL CENTER FOR ANIMAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority date: 2019-06-10
Filing date: 2019-06-10
Publication date: 2019-08-30

Abstract

本发明提供一种用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ‑PCR检测试剂盒。本发明分别以ASFV的P72基因和CSFV的5’UTR非编码区作为扩增靶区域，各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针(SEQ ID NO:1‑6)，采用实时荧光定量PCR(FQ‑PCR)技术，实现对ASFV和CSFV的鉴别检测。本发明提供的检测试剂盒适用于疑似ASFV或CSFV感染猪的血清、脾脏、淋巴结、扁桃体、肾脏等样品中的病毒核酸检测，灵敏度可达1.0×10¹拷贝/μL，同易与其混合感染或感染症状相似的其他病原体例如PRRSV、PRV、PCV2、PPV、JEV、HPS之间无交叉反应。

Description

用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ-PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ-PCR检测试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种高度接触性传染疾病，可引起猪高热、精神沉郁、皮肤发绀、食欲废绝、出血性病变和共济失调，并伴有严重的血小板和淋巴细胞减少，感染动物通常在感染后10d～14d内死亡，病死率可达100％。ASFV基因组为双链DNA，大小170-190kb。病毒基因可编码200多种蛋白质，其中结构蛋白有54种，P72是一种结构蛋白，是病毒衣壳的主要组成部分，P72基因序列保守，不同毒株之间都有相同的保守序列。

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的猪的接触性传染病，死亡率高。该病临床症状和死后病变与ASF极为相似，实验室检测是区分两种疫病的唯一方法。CSFV基因组结构主要由5’非编码区(5’UTR)、开放阅读框(ORF)和3’非编码区(3’UTR)三部分组成。5’UTR由360-374个碱基组成，具有很高的保守性，能够形成复杂稳定的二级结构。

TaqMan MGB探针具有以下优点：一是MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，其本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度，增加荧光PCR的特异性；同时探针上还连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右，提高了荧光PCR的特异性；二是MGB探针可以区分扩增目的片段DNA中1个碱基的差别，荧光PCR的特异性大大增强。因此TaqManMGB探针荧光定量PCR技术比普通荧光定量PCR技术具有更高的灵敏性、特异性。

目前国内外尚未见可同时检测ASFV和CSFV的二重FQ-PCR方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供分别用于检测非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的FQ-PCR引物和探针。

本发明的另一目的是提供用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ-PCR检测试剂盒。

本发明构思如下：根据ASFV的P72基因和CSFV的5’UTR非编码区序列保守的特点，分别比对GenBank中ASFV的P72基因和CSFV的5’UTR非编码区序列，设计两对特异性引物对和两条TaqMan MGB探针，通过优化反应体系及反应条件，可实现在一个反应中同时对ASFV和CSFV进行快速鉴别检测。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于检测非洲猪瘟病毒的FQ-PCR引物和探针，它们的核苷酸序列如下：

ASFV-P1：5'-ATGGGCAGCTTCAAACGTTT-3'

ASFV-P2：5'-ACGGCGCCCTCTAAAGGT-3'

ASFV-Probe-P5：5'-F1-CTCGCAACGGATATGACTGGGACAACC-Q-3'；

其中，F1为荧光基团VIC或FAM，Q为荧光淬灭基团MGB。

第二方面，本发明提供一种用于检测猪瘟病毒野毒株的FQ-PCR引物和探针，它们的核苷酸序列如下：

CSFV-P3：5'-AGCCATGCCCACAGTAGGAT-3'

CSFV-P4：5'-ACCAGGGAGCTCGCCAC-3'

CSFV-Probe-P6：5'-F2-GCAAACGGAGGGACTTA-Q-3'

其中，F2为荧光基团VIC或FAM，Q为荧光淬灭基团MGB。

第三方面，本发明提供用于检测非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的FQ-PCR引物和探针组合，包括上述用于检测非洲猪瘟病毒的FQ-PCR引物和探针以及用于检测猪瘟病毒野毒株的FQ-PCR引物和探针，且F1、F2为不同的荧光基团。

第四方面，本发明提供含有上述用于检测非洲猪瘟病毒的FQ-PCR引物和探针、用于检测猪瘟病毒野毒株的FQ-PCR引物和探针，或所述引物和探针组合的检测试剂或试剂盒。

第五方面，本发明提供用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ-PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含上述引物和探针组合；

所述试剂盒任选包括PrimeScript RT Master Mix、Taq DNA聚合酶、dNTPs、反应缓冲液、阳性标准品、阴性对照等中的至少一种。

所述阳性标准品通过如下方法制备得到：①从非洲猪瘟阳性样品中提取DNA；②从猪瘟病毒野毒株阳性样品中提取RNA，将RNA反转录成cDNA；③利用权利要求1和2中所述的引物分别对非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的DNA和cDNA进行PCR扩增，得到各自的扩增产物，将得到的扩增产物与载体连接构建得到重组质粒，即为阳性标准品。

所述阴性对照为溶解阳性标准品的灭菌去离子水。分别设置ASFV、CSFV检测体系为VIC和FAM荧光通道。

第六方面，本发明提供上述引物和探针组合，或者上述二重FQ-PCR检测试剂盒在ASFV、CSFV联合检测中的应用。

第七方面，本发明提供用于鉴别ASFV和CSFV的二重TaqMan MGB FQ-PCR反应体系，所述反应体系包括上述引物和探针组合、DNA模板、cDNA模板、DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液。

优选地，所述反应体系为：引物ASFV-P1、ASFV-P2、CSFV-P3、CSFV-P4终浓度各为0.4μmol/L，探针ASFV-Probe-P5终浓度为0.4μmol/L，探针CSFV-Probe-P6终浓度为0.6μmol/L，2.5mmol/L dNTPs 2μL，10×Ex Taq酶缓冲液2.5μL，5U/μL Ex Taq DNA聚合酶0.3μL，ASFV DNA模板2μL，CSFV cDNA模板2μL，去离子水补足至总体积25μL。

第八方面，本发明提供非诊断目的的非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ-PCR检测方法，包括以下步骤：

1)提取待测样本DNA和RNA，将RNA反转录成cDNA；

2)以步骤1)的DNA和cDNA为模板，利用上述引物和探针组合进行二重PCR扩增反应；

3)分析PCR产物，根据扩增反应结果判定待测样本中是否含有非洲猪瘟和/或猪瘟病毒野毒株。

优选地，步骤2)中所用反应体系为：引物ASFV-P1、ASFV-P2、CSFV-P3、CSFV-P4终浓度各为0.4μmol/L，探针ASFV-Probe-P5终浓度为0.4μmol/L，探针CSFV-Probe-P6终浓度为0.6μmol/L，2.5mmol/L dNTPs 2μL，10×Ex Taq酶缓冲液2.5μL，5U/μL Ex Taq DNA聚合酶0.3μL，DNA模板2μL，cDNA模板2μL，去离子水补足至总体积25μL。

步骤2)中扩增反应程序为：94℃5分钟；94℃15秒，60℃30秒，共40个循环。

本发明中，检测结果的判定方式可以为：阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，可根据不同仪器噪音情况进行调整。阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值＞38.0或无Ct；阳性标准品的Ct值应≤25.0，且出现特定的扩增曲线，判定检测结果成立。如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效。

在检测结果成立的情况下，步骤3)结果判定的具体方法为：

①若待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现2条特定的扩增曲线，且Ct值≤35.0，则可判定为样品中同时存在非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株；

②若待测样本的FQ-PCR反应体系通道无特定的扩增曲线，且Ct值＞38.0或无Ct，则判定为非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株阴性；

③若待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现特定的扩增曲线，且38.0＜Ct值≤35.0，则需重复检验，重复结果为阳性则判定为阳性，否则判定为阴性；

④若在“VIC/NONE”标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值≤35.0，表明待测样本中存在非洲猪瘟病毒；若在“FAM/NONE”标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值≤35.0，表明待测样本中存在猪瘟病毒野毒株。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明提供的鉴别ASFV和CSFV的二重TaqMan MGB FQ-PCR检测引物和探针，以及基于所述引物和探针建立的二重TaqMan MGB FQ-PCR检测方法可实现在一个反应中同时对ASFV和CSFV进行快速鉴别检测，1-1.5h内即可完成检测，具有快速、特异、灵敏、高通量等优点，能满足大批量、快速鉴别检测ASFV、CSFV的要求，为ASFV和CSFV检测和防控提供有效手段。

(二)本发明分别以ASFV的P72基因和CSFV的5’UTR非编码区作为扩增靶区域，分别设计2对特异性引物和2条TaqMan MGB探针，采用FQ-PCR技术，实现对ASFV和CSFV的鉴别检测。本发明提供的检测试剂盒适用于疑似ASFV或CSFV感染猪的血清、脾脏、淋巴结、扁桃体、肾脏等样品中的病毒核酸检测，灵敏度可达1.0×10¹拷贝/μL，同易与其混合感染或感染症状相似的其他病原体，如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、副猪嗜血杆菌(HPS)之间无交叉反应。

附图说明

图1为本发明实施例1中鉴别ASFV和CSFV的二重TaqMan MGB FQ-PCR方法建立扩增曲线；其中，1为ASFV阳性标准品扩增曲线；2为CSFV阳性标准品扩增曲线扩增曲线；3为阴性对照扩增曲线；4～9为PRRSV、PRV、PCV2、PPV、JEV、HPS扩增曲线。

图2为本发明实施例1中鉴别ASFV和CSFV的二重TaqMan MGB FQ-PCR方法检测ASFV敏感性扩增曲线；1～6分别对应的质粒浓度为1.0×10⁶,1.0×10⁵,1.0×10⁴,1.0×10³,1.0×10²,1.0×10¹拷贝/μL；7对应的质粒浓度为1.0×100拷贝/μL,8为阴性对照。

图3为本发明实施例1中鉴别ASFV和CSFV的二重TaqMan MGB FQ-PCR方法检测ASFV标准曲线。

图4为本发明实施例1中鉴别ASFV和CSFV的二重TaqMan MGB FQ-PCR方法检测CSFV敏感性扩增曲线；1～6分别对应的质粒浓度为1.0×10⁶,1.0×10⁵,1.0×10⁴,1.0×10³,1.0×10²,1.0×10¹拷贝/μL；7对应的质粒浓度为1.0×100拷贝/μL,8、9为阴性对照。

图5为本发明实施例1中鉴别ASFV和CSFV的二重TaqMan MGB FQ-PCR方法检测CSFV标准曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1用于鉴别ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR检测的引物和探针的设计以及检测方法的建立

1.1材料

1.1.1阳性标准品和毒株

ASFV和CSFV阳性标准品由河南省动物疫病预防控制中心采用PCR和RT-PCR分别扩增ASFV和CSFV目的基因，将目的基因克隆入pGEM-T Easy载体中获得ASFV和CSFV阳性标准品；其他对照病毒、细菌或阳性重组质粒由河南省动物疫病预防控制中心提供。

1.1.2仪器和试剂

全自动核酸提取仪，美国Thermo公司产品；荧光PCR仪，美国ABI公司产品；PCR扩增仪，德国Biometra公司产品；凝胶成像分析系统，美国Alpha Innotech公司产品；恒温水浴震荡器(HZQ-Q)，哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品；台式高速冷冻离心机，美国Heraeus公司产品；核酸提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司；PrimeScript RT MasterMix、Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、酶抑制剂等均购自宝生物工程(大连)有限公司；M-MLV反转录酶、pGEM-T Easy载体等购自Promega公司。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成

根据ASFV的P72基因和CSFV的5’UTR非编码区序列保守的特点，分别比对GenBank中ASFV的P72基因和CSFV的5’UTR非编码区序列，设计两对特异性引物对和两条TaqMan MGB探针，分别命名为ASFV-P1、ASFV-P2、CSFV-P3、CSFV-P4、ASFV-Probe-P5、CSFV-Probe-P6。

所设计的引物和探针序列如下：

ASFV检测引物和探针(SEQ ID NO:1-3)：

ASFV-P1：5'-ATGGGCAGCTTCAAACGTTT-3'

ASFV-P2：5'-ACGGCGCCCTCTAAAGGT-3'

ASFV-Probe-P5：5'-VIC-CTCGCAACGGATATGACTGGGACAACC-MGB-3'

CSFV检测引物和探针(SEQ ID NO:4-6)：

CSFV-P3：5'-AGCCATGCCCACAGTAGGAT-3'

CSFV-P4：5'-ACCAGGGAGCTCGCCAC-3'

CSFV-Probe-P6：5'-FAM-GCAAACGGAGGGACTTA-MGB-3'

1.2.2模板的制备

(1)DNA的制备：利用全自动核酸提取仪从ASFV阳性样品中提取核酸，即为ASFVDNA，-20℃冻存备用。

(2)cDNA的制备：利用全自动核酸提取仪从CSFV阳性样品中提取核酸，利用PrimeScript RT Master Mix对CSFV核酸进行反转录成为cDNA，反应体系为：PrimeScriptRT Master Mix 2μL，CSFV RNA 8μL；反应程序为：37℃15min，85℃5s。-20℃冻存备用。

1.2.3pGEM-ASFV/pGEM-CSFV标准品的制备

将含有ASFV的P72基因和CSFV的5’UTR非编码区基因的阳性扩增产物分别克隆入pGEM-T Easy载体中，筛选阳性重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司，采用T7和SP6引物进行测序。测序正确的ASFV的P72基因和CSFV的5’UTR非编码区基因的阳性重组质粒(分别命名为pGEM-ASFV，pGEM-CSFV)应用分光光度计测定其OD₂₆₀和OD₂₈₀值及OD₂₆₀/OD₂₈₀值，共重复5次，参考质粒DNA拷贝数计算方法，计算pGEM-ASFV，pGEM-CSFV质粒DNA溶液的浓度分别为8.75×10¹⁰拷贝/μL、7.96×10¹⁰拷贝/μL，并分别定量稀释至1.0×10⁰～1.0×10¹⁰拷贝/μL，-20℃保存备用。

1.2.4ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR反应条件的优化

(1)将步骤1.2.3中获得的pGEM-ASFV、pGEM-CSFV重组质粒分别稀释至终浓度1.0×10⁵拷贝/μL作为检测模板，P1/P2、P3/P4、引物对分别稀释至终浓度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0μmol/L，Probe-P5、Probe-P6探针分别稀释到终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0μmol/L，应用荧光PCR仪(美国ABI公司，型号：ABI7500)采用矩阵法筛选不同浓度的针对pGEM-ASFV和pGEM-CSFV扩增的引物/探针组合，筛选针对ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR最佳引物浓度、探针浓度和最佳反应条件。二重FQ-PCR反应体系中其余成分的用量为：2.5mmol/L dNTPs 2μL，10×Ex Taq酶缓冲液2.5μL，5U/μLEx Taq DNA聚合酶0.3μL，DNA模板2μL，cDNA模板2μL，去离子水补足至总体积25μL。

(2)优化的25μL PCR反应体系中，ASFV-P1、ASFV-P2、CSFV-P3、CSFV-P4终浓度各为0.4μmol/L，探针ASFV-Probe-P5终浓度为0.4μmol/L，探针CSFV-Probe-P6终浓度为0.6μmol/L，2.5mmol/L dNTPs 2μL，10×Ex Taq酶缓冲液2.5μL，5U/μL Ex Taq DNA聚合酶0.3μL，1.0×10⁵拷贝/μL的质粒模板各2μL，去离子水补足至总体积25μL。优化的PCR反应程序为：94℃，5min；94℃15s，60℃30s，40个循环(图1)。

(3)反应参数设置

1)探针检测模式设置为：荧光模式ASFV设为VIC/NONE双标记模式，CSFV设为FAM/NONE双标记模式。

2)反应条件设置为：第一阶段，预变性94℃5min，1个循环；第二阶段，94℃15s，60℃30s，40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

3)质量控制：

阴性对照：在“FAM/NONE”和“VIC/NONE”标记模式下的检测结果应为扩增曲线无对数增长期，且Ct值＞38.0或无Ct。

阳性对照：在“FAM/NONE”和“VIC/NONE”标记模式下出现2条有明显对数增长期的扩增曲线，且Ct值应≤25.0。

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

4)结果判定：

①如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现2条特定的扩增曲线，且Ct值≤35.0，则可判定为样品中同时存在ASFV和CSFV。

②如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道无特定的扩增曲线，且Ct值＞38.0或无Ct，则判定为ASFV和CSFV阴性。

③如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现特定的扩增曲线，且35.0＜Ct值≤38.0，则需重复检验，重复结果为阳性则判定为阳性，否则判定为阴性。

④若在“VIC/NONE”标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值≤35.0，表明样品中存在ASFV；若在“FAM/NONE”标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值≤35.0，表明样品中存在CSFV。

1.2.5敏感性试验和标准曲线的建立

将步骤1.2.3中获得的pGEM-ASFV和pGEM-CSFV阳性重组质粒分别进行10倍系列稀释，2种质粒按1:1比例混合，每种质粒终浓度调整为1.0×10⁶～1.0×100拷贝/μL，共7个稀释度，以纯水为阴性对照，按步骤1.2.4优化的FQ-PCR反应条件进行ASFV、CSFV二重TaqManMGB FQ-PCR敏感性试验。分别以pGEM-ASFV和pGEM-CSFV阳性重组质粒起始模板浓度为X轴，以FQ-PCR循环次数C_t值为Y轴作回归曲线，建立ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法的标准曲线。该方法对pGEM-ASFV和pGEM-CSFV阳性重组质粒的最低检出限均为1.0×10¹拷贝/μL(图2、图4)。

由敏感性检测结果建立ASFV标准曲线，相关系数R²为0.996，斜率为-4.161，截距为39.17，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：y＝-4.161logX+39.17(图3)

由敏感性检测结果建立CSFV型标准曲线，相关系数R²为0.997，斜率为-3.582，截距为35.87，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.582logX+35.87(图5)

根据仪器读取的Ct值代入表达式即可计算出ASFV、CSFV的初始拷贝数。

1.2.6特异性试验

按步骤1.2.2所述方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、副猪嗜血杆菌(HPS)、阴性对照等提取核酸并反转录，同时以ASFV和CSFV阳性标准品为阳性对照，按步骤1.2.4优化的FQ-PCR反应条件进行二重FQ-PCR扩增以验证该方法的特异性。结果表明ASFV、CSFV阳性标准品FQ-PCR扩增Ct值分别为17.02和19.87且出现特定的扩增曲线；PRRSV、PRV、PCV2、PPV、JEV、HPS和阴性对照等均未出现特定的扩增曲线。实验结果见图1。

1.2.7稳定性和重复性试验

分别将4个浓度的10倍系列稀释的pGEM-ASFV和pGEM-CSFV阳性重组质粒等量混合物(每种质粒终浓度1.0×10⁵～1.0×10²)按照步骤1.2.4优化的FQ-PCR反应条件进行扩增，每个系列设定3个重复，分成3个批次进行验证该方法的稳定性和重复性。结果表明，ASFV和CSFV批内重复和批间重复试验变异系数(CV值)均在3％以下，表明建立的鉴别ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法具有很好的稳定性和重复性。试验结果见表1和表2。

表1 ASFV稳定性和重复性试验结果

表2 CSFV稳定性和重复性试验结果

实施例2鉴别ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR检测试剂盒

本发明的二重TaqMan MGB FQ-PCR检测试剂盒中包括ASFV检测引物对和探针(SEQID NO:1-3)、CSFV检测引物对和探针(SEQ ID NO:4-6)。

所述检测试剂盒还包括PrimeScript RT Master Mix、dNTPs、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、阳性标准品、阴性对照等中的一种或多种。

所述检测试剂盒的具体应用如下：

(一)样本要求

1、应用正确技术收集样本。

2、样本中的沉淀物和悬浮物可能会影响试验结果，应离心除去。

3、样本处理、收集后在室温放置不可超过6h；如果不在6h内检测需将样本放置在2～8℃的冰箱中；若需24h以上保存或运输，则应冻存于-20℃以下，避免反复冻融。使用前恢复到室温，轻轻摇动混匀。

(二)检验方法

1、样本处理

血清样品离心后直接取100μL上清液为待测样本使用；脾脏、淋巴结、扁桃体、肾脏等组织样品取约0.5g进行充分研磨，加入0.3mL PBS(pH7.4)充分混匀后10000r/min离心8-10min，取上清液为待测样本。

2、核酸提取

可采用商业化的RNA和DNA快速提取试剂盒(离心柱式)产品，按照试剂盒说明书进行操作；或者，可采用商业化的全自动核酸提取仪，按照各厂家仪器及配套试剂盒说明书进行操作。

3、RNA的反转录

取CSFV RNA 8μL加入2μL PrimeScript RT Master Mix中，37℃15min，85℃5s后，获得的cDNA可直接用于荧光PCR反应或-20℃冻存备用。

4、PCR扩增

4.1将预混好的FQ-PCR反应体系分装至荧光PCR反应管中，每管分装21μL。

4.2于上述PCR反应管中分别加入阳性对照、阴性对照、待测样本DNA和cDNA各2μL，8000r/min离心数秒，放入FQ-PCR扩增仪。

荧光PCR反应体系制备：根据检测样本量按照单个反应21μl用量，计算各组分所需总量，混匀后分装21μl于单个PCR反应管中。考虑到分装过程中造成的损失，可配制多于实际检测样本量所需体系的用量。

5、反应参数设置

5.1探针检测模式设置为：荧光模式ASFV设为VIC/NONE双标记模式，CSFV设为FAM/NONE双标记模式。

5.2反应条件设置为：第一阶段，预变性94℃5min，1个循环；第二阶段，94℃15s，60℃30s，40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

(三)质量控制

1、阴性对照：在“FAM/NONE”和“VIC/NONE”标记模式下的检测结果应为扩增曲线无对数增长期，且Ct值＞35.0或无Ct。

2、阳性对照：在“FAM/NONE”和“VIC/NONE”标记模式下出现2条有明显对数增长期的扩增曲线，且Ct值应≤25.0。

(四)结果判定

1、如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现2条特定的扩增曲线，且Ct值≤35.0，则可判定为样品中同时存在ASFV和CSFV。

2、如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道无特定的扩增曲线，且Ct值＞38.0或无Ct，则判定为ASFV和CSFV阴性。

3、如果待测样本的FQ-PCR反应体系通道出现特定的扩增曲线，且35.0＜Ct值≤38.0，则需重复检验，重复结果为阳性则判定为阳性，否则判定为阴性。

4、若在“VIC/NONE”标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值≤35.0，表明样品中存在ASFV；若在“FAM/NONE”标记模式下出现1条特定的扩增曲线且Ct值≤35.0，表明样品中存在CSFV。

实施例3鉴别ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR检测技术的应用

依据本发明建立的鉴别ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR检测方法和之前建立的ASFV及CSFV普通PCR检测方法进行比较，以ASFV和CSFV阳性标准品为阳性对照；以灭菌PBS液为阴性对照，对10份临床疑似ASFV或CSFV感染样品(样品编号为：1～10)分别采用本发明提供的方法和普通PCR/RT-PCR(反转录PCR)检测进行实验室检测，并对这两种方法的检测结果进行比较分析，且与测序结果比较，结果见表3。结果表明，采用本发明提供的鉴别ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法检测，3份为ASFV阳性，5份为CSFV阳性；采用普通PCR检测2份为ASFV阳性，普通RT-PCR检测3份为CSFV阳性。该FQ-PCR方法检测结果与ASFV、CSFV基因测序结果符合率为100％，表明本发明建立的鉴别ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR方法比普通PCR/RT-PCR方法的灵敏性高。

表3本发明方法与普通PCR/RT-PCR及测序结果比较

实施例4 ASFV、CSFV二重TaqMan MGB FQ-PCR检测引物和探针的优化

以ASFV的P72基因作为扩增靶区域设计3对特异性引物和3条TaqMan MGB探针，以CSFV的5’UTR非编码区作为扩增靶区域设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针，从ASFV的3对特异性引物和3条TaqMan MGB探针中筛选出1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针(SEQ ID NO:1-3)与CSFV的引物和探针(SEQ ID NO:4-6)组合，所建立的二重FQ-PCR检测方法的敏感性、特异性、重复性最好。所设计的ASFV引物和探针序列分别如下：

方案I(SEQ ID NO:1-3)：

ASFV-P1：5'-ATGGGCAGCTTCAAACGTTT-3'

ASFV-P2：5'-ACGGCGCCCTCTAAAGGT-3'

ASFV-Probe-P5：5'-VIC-CTCGCAACGGATATGACTGGGACAACC-MGB-3'

方案II：

ASFV-P3：5'-AACGCGTTCGATTTTCTCTGA-3'

ASFV-P4：5'-CATCGTGGTGGTTATTGTTGGT-3'

ASFV-Probe-P7：5'-VIC-ACGTGTCCATAAAACGCAGGTGACCC-MGB-3'

方案III：

ASFV-P5：5'-TGGGACAACCAAACACCTTTAGA-3'

ASFV-P6：5'-GCCGGGTACAATGGGTCTT-3'

ASFV-Probe-P8：5'-VIC-CGCCGTTTACACGCTTGTAGATCCTTTTG-MGB-3'

上述3套ASFV的引物和探针与CSFV的引物和探针组合，特异性均良好，但方案I的敏感性和重复性均优于方案II和方案III。结果见表4、表5。

表4 3套方法组合敏感性结果比较

方案	ASFV最低检出限	CSFV最低检出限
			方案I	1.0×10<sup>1</sup>拷贝/μL	1.0×10<sup>1</sup>拷贝/μL
方案II	1.0×10<sup>2</sup>拷贝/μL	1.0×10<sup>1</sup>拷贝/μL
			方案III	1.0×10<sup>2</sup>拷贝/μL	1.0×10<sup>2</sup>拷贝/μL

表5 3套方法组合ASFV重复性结果比较

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 河南省动物疫病预防控制中心

<120> 用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ-PCR检测试剂盒

<130> KHP191112305.3

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggcagct tcaaacgttt 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acggcgccct ctaaaggt 18

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcgcaacgg atatgactgg gacaacc 27

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agccatgccc acagtaggat 20

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accagggagc tcgccac 17

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcaaacggag ggactta 17

Claims

1.用于检测非洲猪瘟病毒的FQ-PCR引物和探针，其特征在于，它们的核苷酸序列如下：

ASFV-P1：5'-ATGGGCAGCTTCAAACGTTT-3'

ASFV-P2：5'-ACGGCGCCCTCTAAAGGT-3'

ASFV-Probe-P5：5'-F1-CTCGCAACGGATATGACTGGGACAACC-Q-3'；

其中，F1为荧光基团VIC或FAM，Q为荧光淬灭基团MGB。

2.用于检测猪瘟病毒野毒株的FQ-PCR引物和探针，其特征在于，它们的核苷酸序列如下：

CSFV-P3：5'-AGCCATGCCCACAGTAGGAT-3'

CSFV-P4：5'-ACCAGGGAGCTCGCCAC-3'

CSFV-Probe-P6：5'-F2-GCAAACGGAGGGACTTA-Q-3'

其中，F2为荧光基团VIC或FAM，Q为荧光淬灭基团MGB。

3.用于检测非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的FQ-PCR引物和探针组合，其特征在于，包括权利要求1和2所述的引物和探针，且F1、F2为不同的荧光基团。

4.含有权利要求1或2所述引物和探针，或权利要求3所述引物和探针组合的检测试剂或试剂盒。

5.用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求3所述的引物和探针组合；

所述试剂盒任选包括PrimeScript RT Master Mix、Taq DNA聚合酶、dNTPs、反应缓冲液、阳性标准品、阴性对照中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品通过如下方法制备得到：①从非洲猪瘟阳性样品中提取DNA；②从猪瘟病毒野毒株阳性样品中提取RNA，将RNA反转录成cDNA；③利用权利要求1和2中所述的引物分别对非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的DNA和cDNA进行PCR扩增，得到各自的扩增产物，将得到的扩增产物与载体连接构建得到重组质粒，即为阳性标准品。

7.非诊断目的的非洲猪瘟和猪瘟病毒野毒株的二重FQ-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测样本DNA和RNA，将RNA反转录成cDNA；

2)以步骤1)的DNA和cDNA为模板，利用权利要求3所述引物和探针组合进行二重PCR扩增反应；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)中所用反应体系为：引物ASFV-P1、ASFV-P2、CSFV-P3、CSFV-P4终浓度各为0.4μmol/L，探针ASFV-Probe-P5终浓度为0.4μmol/L，探针CSFV-Probe-P6终浓度为0.6μmol/L，2.5mmol/L dNTPs 2μL，10×Ex Taq酶缓冲液2.5μL，5U/μL Ex Taq DNA聚合酶0.3μL，DNA模板2μL，cDNA模板2μL，去离子水补足至总体积25μL。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)中扩增反应程序为：94℃5分钟；94℃15秒，60℃30秒，共40个循环。

10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)结果判定的方法包括：分别设置非洲猪瘟、猪瘟病毒野毒株检测体系为VIC、FAM荧光通道，具体地，