CN111074000B - 一种区分asfv野毒株与双基因缺失株的三重荧光定量pcr检测材料及试剂盒 - Google Patents

一种区分asfv野毒株与双基因缺失株的三重荧光定量pcr检测材料及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360‑505R基因缺失株的三重荧光定量PCR检测材料及试剂盒，检测材料包括引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～9所示。本发明利用三组引物探针进行三重荧光定量PCR扩增非洲猪瘟病毒P72、CD2V和360‑505R基因，减少了鉴定不同基因的检测成本和检测时间；可以辨别毒株是否存在基因的缺失，且具有良好的特异性及灵敏度。对于传统qPCR，每次仅扩增一个基因来说，本发明每次PCR反应同时扩增3个基因，成本降低了约2/3。

Description

一种区分ASFV野毒株与双基因缺失株的三重荧光定量PCR检 测材料及试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒株鉴别技术领域，更具体地，涉及一种区分ASFV野毒株与双基因缺失株的三重荧光定量PCR检测材料及试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)，可引起急性出血热，导致猪的大量发病率和死亡率事件(死亡率接近100%)。世界动物卫生组织 (OIE) 将其列为必须报告动物疫病, 我国将其列为一类动物疫病。从2018年第一例非洲猪瘟在我国爆发来，非洲猪瘟对我国养猪业造成重大的损失，严重影响我国的养猪业的健康发展。非洲猪瘟疫情已经扩散到亚洲多个国家。非洲猪瘟对我国乃至亚洲国家的影响将会持续很长时间。
非洲猪瘟病毒属于DNA病毒目，非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属成员，是一种具有20面体结构，直径为175~215nm，基因组全长170~190kb，含有151个开放阅读框，可编码150~200种蛋白，具有囊膜的双股线性DNA病毒。
目前CN110093324A公开了一种可作为疫苗的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒及疫苗以及构建方法，采用非洲猪瘟中国流行株Pig/CN/HLJ/2018，经基因工程技术，将非洲猪瘟病毒的毒力基因缺失，获得MGFMGF360-505R缺失和CD2V与MGFMGF360-505R联合缺失的基因缺失病毒。经实验表明所述两种毒株均能提供对非洲猪瘟中国流行强毒株的100％免疫保护，可作为安全和有效的防控中国非洲猪瘟疫情的疫苗，具有极大的社会价值。但该疫苗的使用会导致常规方法检测非洲猪瘟病毒结果钧为阳性，无法区分野毒感染致阳性，还是疫苗接种导致阳性。
近年来，国内外学者对其建立了普通PCR诊断，SYBRGreen实时荧光定量PCR等核酸技术进行ASF的检测，表现出了很高的灵敏度。但这些方法主要检测P72这个保守性衣壳蛋白基因，无法区分野毒株还是基因缺失株感染。因此本发明通过建立三重荧光定量PCR的方法，同时检测非洲猪瘟病毒CD2V，MGF360-505R和P72基因，可以有效区分野毒株还是基因缺失株感染。
发明内容
本发明第一个方面的目的，在于提供一种用于区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重荧光定量PCR检测材料。
本发明第二个方面的目的，在于，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重荧光定量PCR检测试剂盒。
本发明第三个方面的目的，在于提供一种三重荧光定量PCR鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的快速区分方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的一个方面，提供一种用于区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重荧光定量PCR检测材料，包括以下3组上游引物、下游引物和特异性荧光探针，
A组：
上游引物ASFV-P72-F：
TTTAATGAGAACGTGAACCTTGCT（SEQ ID NO：1）；
下游引物ASFV-P72-R：
ATGGTTTAAAGCGTATATTGCGTCT（SEQ ID NO：2）；
特异性荧光探针ASFV-P72-P：
荧光基团-TCCCTCAGTATCCATTCCCTTCGGCGAG-淬灭基团（SEQ ID NO：3）；
B组：
上游引物ASFV-CD2V-F：
CCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAG（SEQ ID NO：4）；
下游引物ASFV-CD2V-R：
ACATGGTTTAGGTGGAGGACAT（SEQ ID NO：5）；
特异性荧光探针ASFV- CD2V-P：
荧光基团-TGCGTCCCTCAACACAACCACTCAACC-淬灭基团（SEQ ID NO：6）；
C组：
上游引物ASFV-360-505R-F：
GGTTCGGATACAGGCGTTAAG（SEQ ID NO：7）；
下游引物ASFV-360-505R-R：
CTAGTAAAGGCCGTGAAGAGC（SEQ ID NO：8）；
特异性荧光探针ASFV-360-505R-P：
荧光基团-TCCGCACACAGCCGCTTTAGATACACG-淬灭基团（SEQ ID NO：9）。
所述特异性荧光探针的荧光基团选自用FAM、Cy5、HEX，且3组特异性荧光探针的荧光基团各不相同；所述特异性荧光探针的淬灭基团选自BHQ1、BHQ3。
本发明的第二个方面，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一个方面所述的检测材料。
根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述试剂盒中还包括DNA提取试剂、荧光定量PCR扩增试剂、阳性对照和阴性对照。
根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述荧光定量PCR扩增试剂为2×PremixEx Taq（Probe qPCR），其含有2×Premix Ex Taq（Probe qPCR）、
根据本发明第二个方面所述的试剂盒，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品为包含非洲猪瘟病毒P72、CD2V以及360-505R基因扩增序列的质粒DNA；所述阴性对照品为去离子水。
本发明的第三个方面，提供一种三重荧光定量PCR鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的快速区分方法，包括以下步骤：
S1. 从样品中提取病毒核酸；
S2. 以步骤S1中提取的核酸为模板，采用上述的检测材料对样品进行三重荧光定量PCR扩增反应。
S3. 根据PCR扩增曲线及Cp值，确定病毒类型。
根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S2所述三重荧光定量PCR扩增反应的反应体系包括：2×Premix Ex Taq（Probe qPCR）10μL，A、B、C三组引物(10μM)各0.4μL、探针ASFV-P72/CD2V/360-505R-Probe(10μM)各0.8μL，模板DNA2μL，补加去离子水至20μL。
根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S2所述三重荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：
95℃ 30秒，升降温速率4.4℃/s；
95℃ 5 秒，升降温速率4.4℃/s，
60℃ 30秒，升降温速率2.2℃/s，共40个循环；
50℃ 30秒，升降温速率2.2℃/s。
根据本发明第三个方面所述的方法，步骤S3所述确定病毒类型的方法为：
当A、B、C三组引物和探针对应的荧光通道均无扩增曲线或Cp值>38时，样品中没有非洲猪瘟病毒；
当A、B、C三组引物和探针对应的荧光通道均有扩增曲线，且样品Cp值不大于35时，样本中的非洲猪瘟病毒为野毒株；
当A和B组引物和探针对应的荧光通道有扩增曲线且Cp值不大于35，C组引物和探针对应荧光通道无扩增曲线和Cp值或Cp值>38时，样本中的非洲猪瘟病毒缺失360-505R基因；
当A和C组引物和探针对应的荧光通道有扩增曲线且Cp值不大于35，B组引物和探针对应的荧光通道无扩增曲线和Cp值或Cp值>38时，样本中的非洲猪瘟病毒缺失CD2V基因；
当A组引物和探针对应的荧光通道有扩增曲线且Cp值不大于35，B和C组引物和探针对应的荧光通道无扩增曲线和Cp值或Cp值>38时，样本中的非洲猪瘟病毒缺失CD2V和360-505R基因。
本发明的有益效果是：
1. TaqMan探针法，是具有高度特异性的定量 PCR 技术。它的工作原理是在 PCR反应体系中存在一对 PCR 引物和一条探针，探针的5′端标记有报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团，探针只与模板特异结合，其结合位点在两条引物之间。当探针完整的时候，报告基团的荧光能量被淬灭基团吸收，所以仪器搜集不到信号，随着反应的进展，Taq酶遇到探针，利用 3′→5′外切核酸酶的活性把探针切断，导致报告基团的荧光能量不能被淬灭基团吸收，产生了荧光信号，因此信号的强度就代表了模板 DNA 的拷贝数。TaqMan探针法荧光定量PCR特异性强灵敏度高。多重荧光定量PCR(multiplex qPCR)，它是在同一qPCR反应体系里加上多组引物和探针，同时扩增冰检测多个核酸片段的qPCR反应，是一种快速准确的检测方法。本发明综合利用多重qPCR的优势，利用3组引物和探针分别扩增非洲猪瘟病毒P72、CD2V 和 360-505R基因，灵敏度高。
2. 本发明的专用试剂盒经济实惠，仅需一次qPCR扩增即可鉴别出三个基因，节约了检测成本和时间。
3. 本发明为我国非洲猪瘟病毒的临床检测提供了新手段，该试剂盒临床应用操作便捷，实用性强，可用于生产实践中非洲猪瘟病毒的疫情监控、鉴别诊断以及疫病的净化，也可用于专业实验室对非洲猪瘟病毒株的快速鉴定，可为提升我国非洲猪瘟的综合防控水平提供技术支撑。附图说明
图1 P72基因的荧光定量PCR标准曲线。
图2 CD2V基因的荧光定量PCR标准曲线。
图3 360-505R基因的荧光定量PCR标准曲线。
图4 非洲猪瘟病毒野毒株的三重荧光定量PCR扩增曲线。A：P72基因；B：CD2V基因；C：360-505R基因。
图5 非洲猪瘟病毒野毒株的三重荧光定量PCR扩增的灵敏性试验。（曲线上的数字代表模板的浓度，单位：ng/μL）。
图6 360-505R基因缺失株的三重荧光定量PCR扩增曲线。A：P72基因；B：CD2V基因；C：360-505R基因。
图7 CD2V基因缺失株的三重荧光定量PCR扩增曲线。A：P72基因；B：CD2V基因；C：360-505R基因。
图8 360-505R及CD2V双基因缺失株的三重荧光定量PCR扩增曲线。A：P72基因；B：CD2V基因；C：360-505R基因。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例中所用的原料如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。
实施例1 引物及探针设计
发明人大量对比NCBI(美国国立生物信息中心)的GenBanK数据库中已公布的非洲猪瘟病毒（ASFV）的P72、CD2V和360-505R基因高度保守且具有特异性区域，设计ASFV P72、CD2V和360-505R基因的特异性引物和探针，分别对应A、B、C三个组别，具体序列为：
A组：
上游引物ASFV-P72-F：
TTTAATGAGAACGTGAACCTTGCT（SEQ ID NO：1）；
下游引物ASFV-P72-R：
ATGGTTTAAAGCGTATATTGCGTCT（SEQ ID NO：2）；
特异性荧光探针ASFV-P72-P：
荧光基团-TCCCTCAGTATCCATTCCCTTCGGCGAG-淬灭基团（SEQ ID NO：3）；
B组：
上游引物ASFV-CD2V-F：
CCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAG（SEQ ID NO：4）；
下游引物ASFV-CD2V-R：
ACATGGTTTAGGTGGAGGACAT（SEQ ID NO：5）；
特异性荧光探针ASFV- CD2V-P：
荧光基团-TGCGTCCCTCAACACAACCACTCAACC-淬灭基团（SEQ ID NO：6）；
C组：
上游引物ASFV-360-505R-F：
GGTTCGGATACAGGCGTTAAG（SEQ ID NO：7）；
下游引物ASFV-360-505R-R：
CTAGTAAAGGCCGTGAAGAGC（SEQ ID NO：8）；
特异性荧光探针ASFV-360-505R-P：
荧光基团-TCCGCACACAGCCGCTTTAGATACACG-淬灭基团（SEQ ID NO：9）。
其中荧光探针ASFV-P72-P、ASFV- CD2V-P、和ASFV-360-505R-P的5’端分别标记FAM、Cy5和HEX荧光基团，3’端分别标记BHQ1、BHQ1和BHQ3荧光淬灭基团。
实施例2 三重荧光定量PCR检测方法
材料与方法
1.1 实施例1中引物
1.2 样品DNA提取
对DNA提取没有特殊要求，可按常规方法或者DNA提取试剂盒提取。提取的DNA置-20℃保存备用或立即用于PCR扩增。
1.3 阳性质粒
分别以A、B、C三组引物的PCR扩增产物与pJET1.2克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养12-16h，挑菌筛选测序鉴定后，扩大培养阳性菌液后提取质粒，将阳性的质粒分别命名为pJET1.2-P72(qPCR)、pJET1.2-CD2V(qPCR)、pJET1.2-360-505R(qPCR)。
1.4 三重荧光定量PCR反应建立敏感性试验
将1.3中阳性质粒pJET1.2-P72(qPCR)、pJET1.2-CD2V(qPCR)、pJET1.2-360-505R(qPCR)稀释到0.01ng/μL作为检测模板。引物分别稀释为终浓度1μM，0.8μM，0.4μM，0.2μM，探针分别稀释为终浓度2μM，1.6μM，0.8μM，0.4μM。用矩阵法筛选不同引物浓度组合，得到针对三重荧光定量PCR引物及探针的浓度和反应条件。
1.5P72、CD2V及360-505R基因荧光定量PCR标准曲线的建立
分别将pJET1.2-P72(qPCR)、pJET1.2-CD2V(qPCR)、pJET1.2-360-505R(qPCR)质粒按照10倍稀释法依次从1010拷贝数稀释至105拷贝数，以不同稀释度为模板，按以下步骤进行荧光定量PCR反应，每个样品三个重复。
步骤：用上述的引物和探针对样品进行三重荧光定量PCR扩增反应；采用20μL反应体系：2×Premix Ex Taq（Probe qPCR）10μL，A、B、C三组引物(10μM)各0.4μL、A、B、C三组探针(10μM)各0.8μL，模板DNA 2μL，补加去离子水至20μL。其中2×Premix Ex Taq（ProbeqPCR）包含TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH等。
三重荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：
95℃ 30秒，升降温速率4.4℃/s；
95℃ 5 秒，升降温速率4.4℃/s，
60℃ 30秒，升降温速率2.2℃/s，共40个循环；
50℃ 30秒，升降温速率2.2℃/s。
以log10模板拷贝数为横坐标，三个样品的平均Cp值为纵坐标，建立线性荧光定量PCR标准曲线。附图1、2和3分别为P72、CD2V和360-505R基因的荧光定量PCR标准曲线。P72、CD2V、360-505R基因的相关系数分别为0.9994、0.9987、0.9986，斜率分别为-3.25、-3.23、-3.16，接近理论值-3.32，说明本试验成功建立了三重荧光定量PCR反应体系。
1.6 三重荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒野毒株
按照以下步骤进行三重荧光定量PCR：
S1.按照核酸提取试剂盒说明书从样品中提取病毒核酸；
S2.以核酸为模板，用上述的引物和探针对样品进行三重荧光定量PCR扩增反应；采用20μL反应体系：2×Premix Ex Taq（Probe qPCR）10μL，A、B、C三组引物(10μM)各0.4μL、A、B、C三组探针(10μM)各0.8μL，模板DNA2μL，补加去离子水至20μL。其中2×Premix Ex Taq（Probe qPCR）包含TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH 等。三重荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：
95℃ 30秒，升降温速率4.4℃/s；
95℃ 5 秒，升降温速率4.4℃/s，
60℃ 30秒，升降温速率2.2℃/s，共40个循环；
50℃ 30秒，升降温速率2.2℃/s。按照上述方法对确诊感染非洲猪瘟病毒的猪脾脏组织样品进行检测，实验结果见附图4。从结果中可以看出3组引物探针均能够特异性扩增其对应的基因，并出现指数增长型扩增曲线。
1.7重复性试验
每份样品做3个重复，分别提取DNA，在同一次扩增中进行测定。试验重复3次检测结果一致。
实施例3敏感性试验
将阳性样品浓度分别稀释为1×10-3ng/μL、1×10-2ng/μL、1×10-1ng/μL、1×100ng/μL、1×101ng/μL。
按照实施例2中1.4建立的三重荧光定量PCR检测方法对上述不同模板浓度进行检测。结果如附图5所示。从附图5中可以看出，1×10-3ng/μL浓度的样品依然有良好的扩增曲线，说明该方法的敏感性达到1×10-3ng/μL。
实施例4 Cp值区分病毒类型的方法
以实施例1中引物探针，按照实施例2的1.4中建立的三重荧光定量PCR检测方法进行作三重荧光定量PCR检测，并根据Cp值进行区分验证。
检测样品：
1. 非洲猪瘟病毒野毒株（对应附图4中结果）
2. 360-505R基因缺失的非洲猪瘟病毒（对应附图6中结果）
3. CD2V基因缺失的非洲猪瘟病毒（对应附图7中结果）
4. 360-505R和CD2V基因双缺失的非洲猪瘟病毒（对应附图8重结果）
Cp值解释：Cp值指样本在PCR过程中其反应液荧光信号增加到超过其本底荧光时所需要的循环数。
A组：
上游引物ASFV-P72-F：5’TTTAATGAGAACGTGAACCTTGCT 3’；
下游引物ASFV-P72-R：5’ATGGTTTAAAGCGTATATTGCGTCT 3’；
荧光探针ASFV-P72-P：5’FAM-TCCCTCAGTATCCATTCCCTTCGGCGAG-BHQ1 3’；
B组：
上游引物ASFV-CD2V-F：5’CCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAG 3’；
下游引物ASFV-CD2V-R：5’ACATGGTTTAGGTGGAGGACAT 3’；
荧光探针ASFV- CD2V-P：5’Cy5-TGCGTCCCTCAACACAACCACTCAACC-BHQ3 3’；
C组：
上游引物ASFV-360-505R-F：5’GGTTCGGATACAGGCGTTAAG 3’；
下游引物ASFV-360-505R-R：5’CTAGTAAAGGCCGTGAAGAGC 3’；
荧光探针ASFV-360-505R-P：5’HEX-TCCGCACACAGCCGCTTTAGATACACG-BHQ1 3’。
根据对应的荧光通道有无扩增曲线及Cp值的取值范围，来确定病毒类型。
确定病毒类型的方法为：
当A、B、C三组引物和探针对应的荧光通道均无扩增曲线或Cp值>38时，样品中没有非洲猪瘟病毒；
当A、B、C三组引物和探针对应的荧光通道均有扩增曲线，且样品Cp值不大于35时，样本中的非洲猪瘟病毒为野毒株；
当A和B组引物和探针对应的荧光通道有扩增曲线且Cp值不大于35，C组引物和探针对应荧光通道无扩增曲线和Cp值或Cp值>38时，样本中的非洲猪瘟病毒缺失360-505R基因；
当A和C组引物和探针对应的荧光通道有扩增曲线且Cp值不大于35，B组引物和探针对应的荧光通道无扩增曲线和Cp值或Cp值>38时，样本中的非洲猪瘟病毒缺失CD2V基因；
当A组引物和探针对应的荧光通道有扩增曲线且Cp值不大于35，B和C组引物和探针对应的荧光通道无扩增曲线和Cp值或Cp值>38时，样本中的非洲猪瘟病毒缺失CD2V和360-505R基因。
当样品某个基因的Cp值在35~38之间时，则视为可疑，应重复检测，如果重复实验结果仍在35~38范围内，有明显的指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。
实验结果见附图4，及6至8所示。
从附图4中可以看出，A、B和C组引物和探针对应的荧光通道有良好的扩增曲线，表明样品中含有P72基因、CD2V基因，和360-505R基因，说明样品为非洲猪瘟病毒野毒株。
从附图6中可以看出，A和B组引物和探针对应的荧光通道有良好的扩增曲线，而C组引物和探针对应的荧光通道无正确的扩增曲线，表明样品中含有P72基因和CD2V基因，没有360-505R基因，说明样品为缺失360-505R基因的非洲猪瘟病毒。
从附图7中可以看出，A和C组引物和探针对应的荧光通道有良好的扩增曲线，而B组引物和探针对应的荧光通道无正确的扩增曲线，表明样品中含有P72基因和360-505R基因，没有CD2V基因，说明样品为缺失CD2V基因的非洲猪瘟病毒。
从附图8中可以看出，A组引物和探针对应的荧光通道有良好的扩增曲线，而B和C组引物和探针对应的荧光通道无正确的扩增曲线，表明样品中含有P72基因，没有360-505R和CD2V基因，说明样品为缺失360-505R 和CD2V基因的非洲猪瘟病毒。
综上所述，实施例1中引物探针，采用实施例2中反应体系及方法，可以清晰准确地区分出非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
肇庆大华农生物药品有限公司
<120> 一种区分ASFV野毒株与双基因缺失株的三重荧光定量PCR检测材料及试剂盒
<130>
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tttaatgaga acgtgaacct tgct 24
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggtttaaa gcgtatattg cgtct 25
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tccctcagta tccattccct tcggcgag 28
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cctaagcctt acagtcgtta tcag 24
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acatggttta ggtggaggac at 22
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgcgtccctc aacacaacca ctcaacc 27
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggttcggata caggcgttaa g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctagtaaagg ccgtgaagag c 21
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tccgcacaca gccgctttag atacacg 27

Claims (9)

1.一种非疾病诊断治疗目的的用于区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重荧光定量PCR检测材料，包括以下3组上游引物、下游引物和特异性荧光探针，
A组：
上游引物ASFV-P72-F：
TTTAATGAGAACGTGAACCTTGCT（SEQ ID NO：1）；
下游引物ASFV-P72-R：
ATGGTTTAAAGCGTATATTGCGTCT（SEQ ID NO：2）；
特异性荧光探针ASFV-P72-P：
荧光基团-TCCCTCAGTATCCATTCCCTTCGGCGAG-淬灭基团（SEQ ID NO：3）；
B组：
上游引物ASFV-CD2V-F：
CCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAG（SEQ ID NO：4）；
下游引物ASFV-CD2V-R：
ACATGGTTTAGGTGGAGGACAT（SEQ ID NO：5）；
特异性荧光探针ASFV- CD2V-P：
荧光基团-TGCGTCCCTCAACACAACCACTCAACC-淬灭基团（SEQ ID NO：6）；
C组：
上游引物ASFV-360-505R-F：
GGTTCGGATACAGGCGTTAAG（SEQ ID NO：7）；
下游引物ASFV-360-505R-R：
CTAGTAAAGGCCGTGAAGAGC（SEQ ID NO：8）；
特异性荧光探针ASFV-360-505R-P：
荧光基团-TCCGCACACAGCCGCTTTAGATACACG-淬灭基团（SEQ ID NO：9）。
2.根据权利要求1所述的检测材料，其特征在于，特异性荧光探针的荧光基团选自FAM、Cy5、HEX，且3组特异性荧光探针的荧光基团各不相同；特异性荧光探针的淬灭基团选自BHQ1、BHQ3。
3.一种非疾病诊断治疗目的的区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的检测材料。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括DNA提取试剂、荧光定量PCR扩增试剂、阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品为包含非洲猪瘟病毒P72、CD2V以及360-505R基因扩增序列的质粒DNA；所述阴性对照品为去离子水。
6.一种非疾病诊断治疗目的的三重荧光定量PCR鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 从样品中提取病毒核酸；
S2. 以步骤S1中提取的核酸为模板，采用权利要求1中所述的检测材料对样品进行三重荧光定量PCR扩增反应；
S3. 根据PCR扩增曲线及Cp值，确定病毒类型。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2所述三重荧光定量PCR扩增反应的反应体系包括：2×Premix 10μL，10μM的A、B、C三组引物各0.4μL、10μM探针ASFV-P72-P、ASFV- CD2V-P和ASFV-360-505R-P各0.8μL，模板DNA2μL，补加去离子水至20μL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S2所述三重荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：
95℃ 30秒，升降温速率4.4℃/s；
95℃ 5 秒，升降温速率4.4℃/s，
60℃ 30秒，升降温速率2.2℃/s，共40个循环；
50℃ 30秒，升降温速率2.2℃/s。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S3所述确定病毒类型的方法为：
当A、B、C三组引物和探针对应的荧光通道均无扩增曲线或Cp值>38时，样品中没有非洲猪瘟病毒；
当A、B、C三组引物和探针对应的荧光通道均有扩增曲线，且样品Cp值不大于35时，样本中的非洲猪瘟病毒为野毒株；
当A和B组引物和探针对应的荧光通道有扩增曲线且Cp值不大于35，C组引物和探针对应荧光通道无扩增曲线和Cp值或Cp值>38时，样本中的非洲猪瘟病毒缺失360-505R基因；
当A和C组引物和探针对应的荧光通道有扩增曲线且Cp值不大于35，B组引物和探针对应的荧光通道无扩增曲线和Cp值或Cp值>38时，样本中的非洲猪瘟病毒缺失CD2V基因；
当A组引物和探针对应的荧光通道有扩增曲线且Cp值不大于35，B和C组引物和探针对应的荧光通道无扩增曲线和Cp值或Cp值>38时，样本中的非洲猪瘟病毒缺失CD2V和360-505R基因。
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