CN112646934B

CN112646934B - 一种鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重荧光定量pcr检测引物及试剂盒

Info

Publication number: CN112646934B
Application number: CN202110084102.6A
Authority: CN
Inventors: 张桂红; 黄钊; 王衡; 龚浪; 许志颖
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-01-21
Filing date: 2021-01-21
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2041-01-21
Also published as: CN112646934A

Abstract

本发明公开了一种鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的三重荧光定量PCR检测引物及试剂盒。本发明提供了一组检测非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的特异性引物和探针，通过RT‑qPCR方法同时检测非洲猪瘟病毒野毒株B646L基因和缺失株的EGFP、mCherry基因，能够鉴别样本是非洲猪瘟病毒野毒株还是基因缺失株。该检测方法灵敏度高，特异性强，B646L、EGFP和mCherry基因阳性标准质粒最低检测浓度分别为5.94×10^‑9ng/μL、9.67×10^‑9ng/μL、5.85×10^‑9ng/μL。该方法检测范围广泛，能检测出多种非洲猪瘟病毒基因缺失株，且检测过程快速，高效，适合进行大批量检测，为鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失毒株提供了新手段，可用于生产实践中对非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的快速鉴定。

Description

一种鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重荧光定量PCR 检测引物及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，更具体地，涉及一种鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重荧光定量PCR检测引物及试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)是一种高度传染性和高度致死性家猪疾病的病原体，该病毒引起的非洲猪瘟(African swine fever，AS F)是一种烈性猪传染性疾病，对猪养殖业造成巨大的经济损失。目前生物安全和疫苗是预防和控制ASF流行病的最有效和最经济的方法，监控猪群是否被病原体感染是做好生物安全的重中之重。

ASFV基因缺失减毒疫苗已成为最有希望的ASF疫苗候选者，世界各大猪病研究机构都在大力研发有效的ASFV基因缺失疫苗。目前各个研究所和高校构建了多种ASFV基因缺失毒株，缺失的基因有MGF505-1R、MGF360-12L、MG F360-13L、MGF360-14L、MGF505-2R、MGF505-3R、CD2V、I177L、MGF360-18R、DP71L和DP96R。而大多研究所构建的ASFV基因缺失毒株所插入的筛选基因为EGFP和mCherry或RPF(RFP与mCherry具有高同源性)，而ASFV野毒不能检测出EGFP以及mCherry基因。据文献报道，国内某研究所构建了以EGFP和mCherry替换靶基因的ASFV△MFG△CD2v，另外一个研究所构建以E GFP和RFP替换靶基因的ASFV△MFG△CD2v，梅岛疾控中心制备了用mCher ry替换靶基因的ASFV△I177L毒株，插入以上三种筛选基因的缺失毒株进行的动物实验均表明其可100％抵抗亲本毒株攻击。若ASFV基因缺失毒株成功上市，那么能够准确区分ASFV野毒株与基因缺失毒株的检测方法是必不可少的。

目前，在多种基因缺失毒株疫苗研究的背景下，专利CN111676327A、CN111074000A、CN111020062A虽然都公开了一种区分检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的实时荧光定量PCR检测方法、试剂盒，但都仅仅局限于区分检测1种或2种基因缺失株，其应用明显受到了限制，所以亟需建立了一种新的更广泛地鉴别非洲猪瘟野毒株及多种变异株的荧光定量PCR方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中区分鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的不足，提供一种更加准确、广泛地区分检测非洲猪瘟野毒株与多种基因缺失株的三重荧光定量PCR检测引物及试剂盒。

本发明的第一个目的是提供一组检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重荧光定量PCR特异性引物。

本发明的第二个目的是提供一组检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的特异性荧光探针。

本发明的第三个目的是提供所述引物和/或所述探针在制备检测非洲猪瘟野毒株和/或基因缺失株试剂盒中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种检测非洲猪瘟野毒株和/或基因缺失株的三重荧光定量PCR检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明提供了一组检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重荧光定量PCR特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～6所示。

所述特异性引物分别为：检测B646L基因的特异性引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1～2所示；检测EGFP基因的特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示；检测mCherry基因的特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示。

本发明还提供了一组检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的特异性荧光探针，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7～9所示。

所述特异性引物分别为检测B646L、EGFP、mCherry基因的探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7～9所示。

所述探针的5'端分别修饰不同的荧光基团，3'端分别修饰不同的淬灭基团。

优选地，所述荧光基团为FAM、HEX和Cy5，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2和BHQ3。

更优选地，B646L基因探针的5’端荧光基团为FAM，3’端淬灭基团为BHQ1；EGFP基因探针的5’端荧光基团为HEX，3’端淬灭基团为BHQ1；mCherry基因探针的5’端修饰基团为Cy5，3’端淬灭基团为BHQ3。

以上所述引物和/或所述探针在制备检测非洲猪瘟野毒株和/或基因缺失株试剂盒中的应用，应在本发明的保护范围之内。

本发明要求保护一种检测非洲猪瘟野毒株和/或基因缺失株的三重荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含以上所述引物和/或所述探针。

优选地，所述试剂盒中还包括探针法荧光定量PCR预混液、阳性对照和阴性对照的一种或几种。

更优选地，所述探针法荧光定量PCR预混液为AceQ Universal U⁺Probe MasterMix V2。

优选地，所述阳性对照含有B646L、EGFP、mCherry基因，所述阴性对照为ddH₂O。

更优选地，所述阳性对照为分别含有B646L、EGFP、mCherry基因的阳性质粒。

优选地，所述检测试剂盒的PCR扩增反应体系为：探针法荧光定量PCR预混液10μL，10μM所述引物各0.4μL，10μM所述探针各0.2μL，核酸模板2μL，ddH₂O补至20μL。

优选地，所述检测试剂盒的PCR扩增反应条件为：37℃2min；95℃5min；95℃10s，60℃30s，40个循环。

本发明还提供一种鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

S1.提取待检样本的核酸；

S2.以步骤S1中提取的核酸为模板，采用以上所述引物和所述探针进行三重实时荧光定量PCR扩增反应；

S3.根据PCR扩增曲线及CT值，鉴别病毒类型。

优选地，步骤S2所述三重荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：37℃2min；95℃5min；95℃10s，60℃30s，40个循环。

优选地，步骤S2所述三重荧光定量PCR扩增反应的反应体系为：探针法荧光定量PCR预混液10μL，10μM所述引物各0.4μL，10μM所述探针各0.2μL，核酸模板2μL，ddH₂O补至20μL。

优选地，步骤S3所述鉴别病毒类型的方法为：

①当B646L、EGFP、mCherry基因探针对应的荧光信号通道均无扩增曲线或CT值＞38时，判定样本为非洲猪瘟病毒阴性；

②当B646L基因探针对应的荧光信号通道有扩增曲线且CT值＜35，EGFP、mCherry基因探针对应的荧光信号通道均无扩增曲线或CT值均＞38时，判定样本为非洲猪瘟野毒阳性；

③当B646L基因探针对应的荧光信号通道有扩增曲线且CT值＜35，EGFP、mCherry基因探针对应的任意一个或两个荧光信号通道有扩增曲线且CT值＜35时，判定样本为非洲猪瘟基因缺失株阳性；

④当样品检出35≤CT值≤38时，判定样品为可疑样品，应重复检测；若重复检测后CT值仍然介于35～38之间，则再根据以下方法判定样本中的病毒类型：

a.如果B646L基因探针对应的荧光信号通道CT值重复检测后仍介于35～38且有扩增曲线，而其他通道CT值均＞38，则判定样本为非洲猪瘟野毒阳性；

b.如果B646L基因探针对应的荧光信号通道CT值重复检测后仍介于35～38且有扩增曲线，而其他通道CT值重复检测后同样仍介于35～38且有扩增曲线，则判定样本为非洲猪瘟基因缺失株阳性；

c.如果B646L基因探针对应的荧光信号通道CT＞38或无扩增曲线，而另外两个通道检出35≤CT值≤38时，则判定样本为非洲猪瘟病毒核酸阴性。

需要注意的是，无论野生型非洲猪瘟毒株还是基因缺失毒株，都必须检测到B646L基因，否则说明样品为非洲猪瘟病毒核酸阴性，即没有感染非洲猪瘟野毒也没有接种基因缺失毒株。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

现有技术对于非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的区分检测大多是针对于1～3种基因缺失株的PCR检测，为了更加准确、广泛地区分检测非洲猪瘟野毒株与多种基因缺失株，本发明运用Taqman探针法多重实时荧光定量PCR技术，根据目前多数构建基因缺失毒株所插入的筛选基因为EGFP和mCherry，设计了三对分别靶向B646L、EGFP和mCherry基因的引物和探针，通过RT-PCR方法同时检测以上三种基因，就能确定样本是感染非洲猪瘟病毒野毒株还是存在基因缺失株。

本发明的引物和探针检测不会与PRRSV，PEDV，PCV-2，PRV，CSFV等毒株发生非特异性扩增，检测反应灵敏度高，特异性强，检测限可达5.85×10^-9ng/μL，检测范围广泛，能检测出多种非洲猪瘟病毒基因缺失株，且检测过程快速，高效，适合进行大批量检测。采用本发明设计的引物和探针制备的试剂盒可为我国非洲猪瘟病毒的临床检测和实验室诊断提供了新手段，可用于生产实践中对非洲猪瘟病毒株的快速鉴定以及对非洲猪瘟病毒的疫情监控和鉴别诊断。

附图说明

图1为非洲猪瘟病毒双基因缺失毒株(ASFV△CD2v△MFG)样品的扩增曲线；其中，1a，1b，1c分别是Cy5，FAM，HEX通道的扩增曲线。

图2为非洲猪瘟病毒(ASFV)和其他五种猪场常见病毒样品以及NC阴性对照的扩增曲线；其中，2：ASFV扩增曲线，3～7分别为：PRRSV，PEDV，PCV-2，PRV，CSFV病毒以及NC的扩增曲线。

图3为三重实时荧光定量PCR的灵敏度检测结果图；其中，A：B646L基因的灵敏度检测结果图；B：EGFP基因灵敏度的检测结果图；C：mCherry基因的灵敏度检测结果图。

图4为三重实时荧光定量PCR标准曲线的建立：其中，A：B646L基因的标准曲线图；B：EGFP基因的标准曲线图；C：mCherry基因的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1特异性引物和探针的设计

根据GenBank公布的B646L、EGFP和mCherry基因序列，在其保守区设计检测B646L、EGFP和mCherry基因的特异性引物和探针，特异性引物的核苷酸序列及扩增片段大小具体如表1所示，特异性探针的核苷酸序列具体如表2所示，引物和探针均由英潍捷基合成。其中，由于RFP基因与mCherry基因具有高同源性，这两种基因都可被本发明设计的针对mCherry基因的特异性引物和探针检测出来。

表1.特异性引物的核苷酸序列及扩增片段大小

表2.特异性探针的核苷酸序列

实施例2三重荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

1、三重荧光定量PCR检测试剂盒

一种检测非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组分：

(1)实施例1的特异性引物和探针；

(2)AceQ Universal U⁺Probe Master Mix V2、ddH₂O(阴性对照)；

(3)阳性质粒：以阳性质粒为阳性对照，阳性质粒为重组质粒载体pUC57-EGFP、pMD18-B646L和pUC57-mCherry，均保存于华南农业大学兽医学院传染病教研室。

2、三重荧光定量PCR检测方法

(1)样本核酸提取

使用康宁生物技术有限公司的Axygen核酸提取试剂盒提取样本核酸，组织样本用研磨棒碾碎后用PBS浸润，离心取上清提取核酸，口鼻拭子样本用PBS浸润后离心取上清提取核酸，并置于-20℃保存备用。

(2)PCR扩增反应

以提取的样本核酸为模板，使用以上PCR检测试剂盒在Bio-Rad CFX Manager3.1仪器上进行三重荧光定量PCR扩增分析，扩增反应体系的组成成分见表3，扩增反应的反应条件为：37℃2min；95℃5min；95℃10s，60℃30s，40个循环。

表3扩增反应体系的组成成分

(3)结果判定

实施例3三重荧光定量PCR的临床样本检测

1、临床样本检测

共收集来自广东省猪场的849份临床样本，其中513份为猪抗凝血，256份为猪口拭子，35份猪扁桃体，45份猪淋巴结；其中，有15份为非洲猪瘟病毒阳性样品，采自2头非洲猪瘟发病猪(来源于广州市黄浦区的农业农村部公布病例)提取的核酸，均由国家非洲猪瘟区域实验室(广州)制备和保存(因为基因缺失毒株的疫苗还尚未成功上市，因此目前只针对感染非洲猪瘟病毒野毒的临床样本进行检测)。使用实施例2的检测试剂盒和检测方法对这849份临床样本进行检测。

2、检测结果

共检测849份样品，结果显示，阳性样品有15个，其余834个样品均为阴性；所有15个阳性样品中的三重荧光定量PCR扩增结果只有FAM通道出现扩增曲线，表明这些阳性样品都是非洲猪瘟病毒野毒毒株。

实施例4三重荧光定量PCR特异性实验

1、实验方法

使用实施例2的检测试剂盒和检测方法对非洲猪瘟病毒(ASFV)、非洲猪瘟病毒双基因缺失毒株(ASFV△CD2v△MFG)，以及猪瘟病毒(CSFV)、蓝耳病病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、2型圆环病毒(PCV-2)、伪狂犬病毒(PRV)五种猪场常见病毒的阳性核酸进行检测。

2、实验结果

特异性检测结果如图1和图2所示，可以看出，ASFVΔCD2vΔMFG样本的FAM、HEX和Cy5通道以及ASFV的FAM通道出现扩增曲线，说明ASFV△CD2v△MFG中有EGFP和mCherry基因的存在，可鉴定为基因缺失毒株，其基因缺失片段被替换为为EGFP和mCherry；而对PRRSV、PEDV、PCV-2、PRV、CSFV五种病毒和NC阴性对照的检测均未出现扩增曲线，表明本发明的引物和探针对非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的检测特异性良好，可以用于临床和实验室检测。

实施例5三重荧光定量PCR灵敏度实验及标准曲线的建立

1、灵敏度实验

(1)实验方法

将原浓度分别为967ng/μL、584.9ng/μL、594.6ng/μL的阳性质粒pUC57-EGFP、pMD18-B646L和pUC57-mCherry进行连续10倍倍比稀释，使用实施例2的检测试剂盒和检测方法对倍比稀释后的质粒进行三重荧光定量PCR检测。根据DNA拷贝数计算公式[dsDNA拷贝数(copies/mL)＝6.02×10²³(copies/mol)×浓度(g/mL)/DNA长度×660]，得出三个质粒pUC57-EGFP、pMD18-B646L和pUC57-mCherry的拷贝数分别为：1.17×10¹¹copies/μL、1.6×10¹¹copies/μL和1.34×10¹¹copies/μL。

(2)实验结果

灵敏度检测结果如图3所示，通过计算得出三重荧光定量PCR所能检测pUC57-EGFP、pMD18-B646L、pUC57-mCherry的最低检测浓度分别为9.67×10^-9ng/μL、5.94×10^- ⁹ng/μL、5.85×10^-9ng/μL，每个反应检测的最低拷贝量分别为9.49copies、30.2copies和9.6copies，表明本发明设计的引物和探针对三个基因的检测具有很高的灵敏度。

2、标准曲线的建立

(1)实验方法

连续12次10倍稀释阳性质粒pUC57-EGFP、pMD18-B646L和pUC57-mCherry，选择10^-5～10^-12的8个稀释度，采用实施例2的检测试剂盒和检测方法进行三重荧光定量PCR的检测，使用软件绘制三重RT-PCR标准曲线。

(2)实验结果

结果如图4所示，pUC57-EGFP、pMD18-B646L和pUC57-mCherry三种阳性质粒标准曲线的斜率分别为-3.441、-3.317、-3.615，所绘制的标准曲线R²>0.99，说明各个稀释样品呈现很强的线性关系，实验数据真实可靠。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重荧光定量PCR检测引物及试剂盒

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aacatttccg taactgctca tggt 24

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgttaatatg accactgggt tggta 25

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tagttgccgt cgtccttgaa gaagatggtg 30

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcagaaga agaccatggg ctgggag 27

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggcgcgttcg tactgttcca cgatggtgta 30

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acccccgatg atccgggtgc gatga 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttcaagtccg ccatgcccga aggct 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acaaggccaa gaagcccgtg cagct 25

Claims

1.一组检测非洲猪瘟野毒株和/或基因缺失株的特异性引物和荧光探针，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示；所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～9所示。

2.根据权利要求1所述探针，其特征在于，所述探针的5'端分别修饰不同的荧光基团，3'端分别修饰不同的淬灭基团。

3.根据权利要求2所述探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM、HEX和Cy5，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2和BHQ3。

4.权利要求1所述引物和探针在制备检测非洲猪瘟野毒株和/或基因缺失株试剂盒中的应用。

5.一种检测非洲猪瘟野毒株和/或基因缺失株的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述引物和探针。

6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括探针法荧光定量PCR预混液、阳性对照和阴性对照的一种或几种。

7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述阳性对照含有B646L、EGFP、mCherry基因，所述阴性对照为ddH₂O。

8.根据权利要求5～7任一所述试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的PCR扩增反应体系为：探针法荧光定量PCR预混液10μL，10μM 权利要求1所述引物各0.4μL，10μM，所述探针各0.2μL，核酸模板2μL，ddH₂O补至20μL。

9.根据权利要求5～7任一所述试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的PCR扩增反应条件为：37°C 2min；95°C 5min；95°C 10s，60°C 30s，40个循环。