CN116064969A - 一种非洲猪瘟三重荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测试剂盒，包括ASFV p72基因特异引物探针、内参猪β‑actin的引物探针、ASFVI177L基因特异引物探针和ASFV CD2v基因特异引物探针中的至少一种，本发明提供的试剂盒针对非洲猪瘟病毒的p72基因、猪β‑actin基因、I177L基因和CD2v基因分别设计了荧光PCR引物和探针，建立了荧光PCR检测方法，可以快速鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域领域，具体涉及一种非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的急性、烈性、高度接触性的传染病，给全球养猪业带来了威胁。2020年，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家非洲猪瘟专业实验室在开展非洲猪瘟流行病学监测及病原学研究中发现，低致死率的非洲猪瘟2型自然变异流行株，如CD2v基因缺失株，这些基因缺失株与典型强毒致病力降低，但仍具有明显的残留毒力，较高剂量接种猪可引起亚急性、慢性病程和部分死亡，较低剂量感染则主要引起持续感染和慢性病程，具有很强的水平传播能力。
目前商品化的试剂盒大部分为P72单一基因的PCR扩增，并不能同时满足于P72、I177L和CD2v三种基因的鉴别诊断，无法快速而又准确的监测非洲猪瘟疫情的发生。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明实施例的目的在于提供一种非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测试剂盒，本发明提供的试剂盒针对非洲猪瘟病毒的p72基因、猪β-actin基因、I177L基因和CD2v基因分别设计了荧光PCR引物和探针，建立了荧光PCR检测方法，可以快速鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株，本发明的PCR引物探针组包括SEQ ID NO.1所示的P72-F、SEQ ID NO.2所示的P72-R、SEQ ID NO.3所示的P72-探针，SEQ ID NO.4所示的内参-F、SEQ ID NO.5所示的内参-R、SEQ ID NO.6所示的内参-探针，SEQ ID NO.7所示的I177L-F、SEQ ID NO.8所示的I177L-R、SEQ ID NO.9所示的I177L-探针，SEQ ID NO.10所示的CD2v-F、SEQ ID NO.11所示的CD2v-R、SEQ ID NO.12所示的CD2v-探针。将该引物探针组制备成试剂盒，可特异的同时检测非洲猪瘟P72基因、I177L基因和CD2v基因，灵敏度能达到5拷贝/μl。本发明的试剂盒的最低检测线可达5拷贝/μL，试剂盒提供的内参避免了假阴性的出现，提供的dUTP/UNG防污染系统避免了气溶胶污染、防止非特异性扩增，提供的抗PCR抑制物因子确保了扩增结果的准确性。因此，本发明在避免假阳性、假阴性、防止非特异性的基础上，建立了一种新的灵敏度更高、特异性更好、稳定性更优的鉴别非洲猪瘟野毒株及多种变异株的荧光定量PCR方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测试剂盒，包括ASFV p72基因特异引物探针、内参猪β-actin的引物探针、ASFVI177L基因特异引物探针和ASFV CD2v基因特异引物探针。
(1)针对p72基因的如下引物探针：
P72基因正向引物：5’-TCTGCAGCTCTTACATAC-3’(SEQ ID NO:1)
P72基因反向引物：5’-CTTGCTCTGGATACGTTA-3’(SEQ ID NO:2)
P72基因探针：5’-CCACTACGGAGGCAATGCGA-3’(SEQ ID NO:3)
(2)针对猪β-actin的引物和探针
内参基因正向引物：5’-CGGCTGAGAGAACATGGA-3’(SEQ ID NO:4)
内参基因反向引物：5’-GGCATAAACCCCACTCCT-3’(SEQ ID NO:5)
内参基因探针：5’-CGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTG-3’(SEQ ID NO:6)
(3)针对I177L基因的如下引物探针：
I177L基因正向引物：CCACTAACAACCAAATCA(SEQ ID NO:7)
I177L基因反向引物：CCACATTAAAAGATTATTATATTCG(SEQ ID NO:8)
I177L基因探针：ACAACTTTGTCACCAGATGTTACAT(SEQ ID NO:9)
(4)针对CD2v基因的如下引物探针：
CD2v基因正向引物：5’-TCTGCAGCTCTTACATAC-3’(SEQ ID NO:10)
CD2v基因反向引物：5’-CTTGCTCTGGATACGTTA-3’(SEQ ID NO:11)
CD2v基因探针：5’-CCACTACGGAGGCAATGCGA-3’(SEQ ID NO:12)
所述p72探针的5’端标记报告荧光基团为FAM，3’端标记荧光猝灭基团为BHQ1；所述内参探针的5’端标记报告荧光基团为HEX，3’端标记荧光猝灭基团为BHQ1；所述I177L探针的5’端记报告荧光报告基团为ROX，3’端标记荧光猝灭基团为BHQ2；所述CD2v探针的5’端记报告荧光基团为Cy5，3’端标记荧光猝灭基团为BHQ3；三种探针采用不同的报告基因和猝灭基团修饰，在本发明中引物探针组可以应用于检测非洲猪瘟全病毒与基因缺失株的试剂盒的制备，以及用于鉴别非洲猪瘟全病毒感染与非洲猪瘟基因缺失株的试剂盒的制备。
作为本发明进一步的方案，试剂盒中还包括多重PCR反应扩增用试剂、阳性对照和阴性对照的一种或几种，阳性对照标准品为包含ASFV p72基因核苷酸片段的重组质粒、包含内参基因核苷酸片段的重组质粒、包含ASFV I177L基因片段的重组质粒和包含ASFVCD2v基因核苷酸片段的重组质粒；所述阴性对照为ddH2O；所述多重PCR反应扩增用试剂中含基于化学法修饰的热启动DNA聚合酶、dUTP/UNG防污染系统、抗PCR抑制物因子等。
作为本发明进一步的方案，PCR反应体系中p72基因引物的浓度为0.4～0.8μM，p72基因探针的浓度为0.08～0.8μM；所述内参基因引物的浓度为0.4～0.8μM，内参基因探针的浓度为0.08～0.8μM；所述PCR反应体系中I177L基因浓度为0.4～0.8μM，I177L基因探针的浓度为0.08～0.8μM；所述PCR反应体系中CD2v基因引物的浓度为0.4～0.8μM，CD2v基因探针的浓度为0.08～0.8μM。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明可以在ASFV鉴别诊断野毒感染或基因缺失毒株感染，当猪感染野毒时，P72基因、内参基因、I177L基因和CD2v基因均有扩增曲线；而当猪为基因缺失毒感染时，P72基因、内参基因有扩增曲线，I177L基因或(和)CD2v基因无扩增曲线。本发明采用荧光定量PCR方法，不但可以快速、简便的对猪体的感染情况进行确诊，还可以对病原进行定量分析。本发明设计的P72基因引物、I177L基因引物和CD2v基因引物的最低检测限为5个拷贝数，且本发明设计的内参引物的应用可避免假阳性的产生，同时引入了dUTP/UNG防污染系统，可完全消除来自扩增产物的气溶胶污染，反应液中添加抗PCR抑制物因子，使本发明所提供的方法更适用于复杂的动物临床样本的检测。
2、本发明的非洲猪瘟病毒P72基因、I177L基因和CD2v基因的荧光定量PCR检测方法与猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、株繁殖与呼吸综合征病毒、猪口蹄疫病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒均无交叉反应，特异性好。
为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对本发明进行详细说明。
附图说明
图1本发明中实施例4灵敏度验证试验扩增曲线示意图。
注：淡蓝色曲线是1.0×104拷贝/μl，深蓝色曲线是1.0×103拷贝/μl，紫色为1.0×102拷贝/μl，红色是1.0×101拷贝/μl，黄色是5.0拷贝/μl。
具体实施方式
下面将结合附图和有关知识对本发明作出进一步的说明，进行清楚、完整地描述，显然，所描述的应用仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
一种非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测试剂盒，包括ASFV p72基因特异引物探针、内参猪β-actin的引物探针、ASFVI177L基因特异引物探针和ASFV CD2v基因特异引物探针，其中针对P72基因的如下引物探针：
P72基因正向引物：5’-TCTGCAGCTCTTACATAC-3’(SEQ ID NO:1)
P72基因反向引物：5’-CTTGCTCTGGATACGTTA-3’(SEQ ID NO:2)
P72基因探针：5’-CCACTACGGAGGCAATGCGA-BHQ1-3’(SEQ ID NO:3)
p72引物探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为FAM，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为BHQ1。所述p72引物能灵敏且特异的检测非洲猪瘟病毒感染。
进一步优选，针对内参猪β-actin基因的如下引物探针：
内参基因正向引物：5’-CGGCTGAGAGAACATGGA-3’(SEQ ID NO:4)
内参基因反向引物：5’-GGCATAAACCCCACTCCT-3’(SEQ ID NO:5)
内参基因探针：5’-CGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTG-BHQ1-3’(SEQ ID NO:6)
内参引物探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为HEX，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为BHQ1。所述内参引物能准确监控反应体系的稳定性。
在本发明中，针对CD2v基因的如下引物探针：
针对I177L基因的如下引物探针：
I177L基因正向引物：CCACTAACAACCAAATCA(SEQ ID NO:7)
I177L基因反向引物：CCACATTAAAAGATTATTATATTCG(SEQ ID NO:8)
I177L基因探针：ACAACTTTGTCACCAGATGTTACAT(SEQ ID NO:9)
I177L引物探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为ROX，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为BHQ2。所述CD2v引物能灵敏且特异的检测非洲猪瘟病毒感染。
在本发明一优选的实施例中，引物探针包括针对CD2v基因的如下引物探针：
针对CD2v基因的如下引物探针：
CD2v基因正向引物：5’-TCTGCAGCTCTTACATAC-3’(SEQ ID NO:10)
CD2v基因反向引物：5’-CTTGCTCTGGATACGTTA-3’(SEQ ID NO:11)
CD2v基因探针：5’-CCACTACGGAGGCAATGCGA-BHQ2-3’(SEQ ID NO:12)
CD2v引物探针的5’端标记报告荧光染料Fluorophore为Cy5，3’端标记荧光淬灭基团Quencher为BHQ3。所述CD2v引物能灵敏且特异的检测非洲猪瘟病毒感染。本发明设计的P72基因引物、I177L基因引物和CD2v基因引物的最低检测限为5个拷贝数，且本发明设计的内参引物的应用可避免假阳性的产生，同时引入了dUTP/UNG防污染系统，可完全消除来自扩增产物的气溶胶污染，反应液中添加抗PCR抑制物因子，使本发明所提供的方法更适用于复杂的动物临床样本的检测。
更进一步地，试剂盒的荧光PCR反应体系为2×Ex Tag Mix for qPCR 12.5μl，10μmol/L P72-F/P72-R各0.5μl，10μmol/L内参F/内参R各0.5μl，10μmol/L I177L-F/I177L-R各0.5μl，10μmol/L CD2v-F/CD2v-R各0.5μl，加入3.5μl灭菌水使PCR体系为20μl，模板DNA的体积为5μl，总体系为25μl。
以及，PCR反应体系中p72基因引物的浓度为0.4～0.8μM，p72基因探针的浓度为0.08～0.8μM；所述PCR反应体系中内参基因引物的浓度为0.4～0.8μM，内参基因探针的浓度为0.08～0.8μM；所述PCR反应体系中I177L基因引物浓度为0.4～0.8μM，I177L基因探针的浓度为0.08～0.8μM；所述PCR反应体系中CD2v基因引物浓度为0.4～0.8μM，CD2v基因探针的浓度为0.08～0.8μM。
在本实施例中，试剂盒的PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃15s，60℃30s，此步采集荧光，同时采集FAM、HEX、ROX和Cy5四个通道的荧光值，共进行40个循环。
本发明可以在ASFV鉴别诊断野毒感染或基因缺失毒株感染，当猪感染野毒时，P72基因、内参基因、I177L基因和CD2v基因均有扩增曲线；而当猪为基因缺失毒感染时，P72基因、内参基因有扩增曲线，I177L基因或(和)CD2v基因无扩增曲线。本发明采用荧光定量PCR方法，不但可以快速、简便的对猪体的感染情况进行确诊，还可以对病原进行定量分析。
本发明的非洲猪瘟病毒P72基因、I177L基因和CD2v基因的荧光定量PCR检测方法与猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、株繁殖与呼吸综合征病毒、猪口蹄疫病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒均无交叉反应，特异性好。
实施例2
一种非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测试剂盒，特异性引物及探针的设计；根据Genbank上ASFV的全序列用Primer 5.0软件设计特异性TagMan探针、引物。引物及探针见表1。
表1引物列表
重组质粒的构建
根据Genbank上ASFV的全序列设计包括引物序列在内的片段，连接T载体之后转入大肠杆菌，提取重组质粒，分别命名为P72重组质粒、内参重组质粒、177L重组质粒和CD2v重组质粒，并对质粒序列进行测序，确认序列正确后检测质粒浓度，分别用灭菌蒸馏水稀释至10μg/ml。
荧光定量PCR的扩增
在反应管中加入2×Ex Tag Mix 12.5μl、10μmol/L p72-F/p72-R各0.5μl，10μmol/L内参F/内参R各0.5μl，10μmol/L、177L-F/177L-R各0.5μl，10μmol/L CD2v-F/CD2v-R各0.5μl，加入3.5μl灭菌水使PCR体系为20μl；阴性对照加入5μl去离子水，阳性对照加入5μl质粒，混匀。扩增条件为：50℃2min，95℃预变性2min，95℃15s，60℃30s，此步采集荧光，同时采集FAM、HEX、ROX和Cy5四个通道的荧光值，共进行40个循环。
结果判定
①有效性判定阳性对照应出现特异性扩增曲线，且Ct值应＜30，阴性对照应无Ct值；否则试验结果无效。
②FAM通道测定Ct值≤40的样本，且ROX通道和CY5通道Ct值≤40，判定为非洲猪瘟野毒阳性；
③FAM通道测定Ct值≤40的样本，且ROX通道Ct值≤40，CY5通道No Ct，判定为CD2v单基因缺失株阳性；
④FAM通道测定Ct值≤40的样本，且CY5通道Ct值≤40，ROX通道No Ct，判定为I177L单基因缺失株阳性；
⑤FAM通道测定Ct值≤40的样本，且CY5通道和ROX通道No Ct，判定为I177L、CD2v双基因缺失株阳性；
⑥对于FAM通道测定No Ct，HEX通道测定No Ct，ROX通道测定No Ct，判定为非洲猪瘟野毒及基因缺失株阴性。
实施例3
一种非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测试剂盒，特异性验证；
从猪伪狂犬病毒活疫苗生产厂家、猪瘟病毒活疫苗生产厂家、猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗生产厂家购买相应疫苗；猪口蹄疫病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒均来自田间分离株。用病毒DNA/RNA提取试剂盒提取相应核酸作为模板，同时以非洲猪瘟病毒DNA作为阳性对照，以去离子水作为阴性对照，利用本发明试剂盒进行扩增，结果见表2。
表2本发明试剂盒对不同病毒的检测结果
结果显示，本发明试剂盒与猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪口蹄疫病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒均无交叉反应，特异性好。
实施例4
一种非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测试剂盒，敏感性验证；
将ASFV P72基因、I177L基因、CD2v基因的阳性标准品分别定量到106拷贝/μl，依次稀释至1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、5.0拷贝/μl，进行灵敏度检验。检验结果见图1，结果表明本方法的P72基因、I177L基因和CD2v基因的检测灵敏度为5.0单拷贝/μl，灵敏度高于市场上常见试剂盒。
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理，仅是本发明的优选实施方式。本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括ASFV p72基因特异引物探针、内参猪β-actin的引物探针、ASFVI177L基因特异引物探针和ASFV CD2v基因特异引物探针中的至少一种。
2.如权利要求1所述的一种非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，其中针对ASFV p72基因的如下引物探针：
P72基因正向引物：5’-TCTGCAGCTCTTACATAC-3’(SEQ ID NO:1)
P72基因反向引物：5’-CTTGCTCTGGATACGTTA-3’(SEQ ID NO:2)
P72基因探针：5’-CCACTACGGAGGCAATGCGA-3’(SEQ ID NO:3)
p72探针的5’端标记报告荧光基团为FAM，3’端标记荧光猝灭基团为BHQ1。
3.如权利要求1所述的一种非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，针对内参猪β-actin的引物和探针：
内参基因正向引物：5’-CGGCTGAGAGAACATGGA-3’(SEQ ID NO:4)
内参基因反向引物：5’-GGCATAAACCCCACTCCT-3’(SEQ ID NO:5)
内参基因探针：5’-CGACTGCACTGCACTTGGTCGATCTG-3’(SEQ ID NO:6)；内参探针的5’端标记报告荧光基团为HEX，3’端标记荧光猝灭基团为BHQ1。
4.如权利要求1所述的一种非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，
针对ASFVI177L基因的如下引物探针：
I177L基因正向引物：CCACTAACAACCAAATCA(SEQ ID NO:7)
I177L基因反向引物：CCACATTAAAAGATTATTATATTCG(SEQ ID NO:8)
I177L基因探针：ACAACTTTGTCACCAGATGTTACAT(SEQ ID NO:9)；I177L探针的5’端记报告荧光报告基团为ROX，3’端标记荧光猝灭基团为BHQ2。
5.如权利要求1所述的一种非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，
针对ASFV CD2v基因的如下引物探针：
CD2v基因正向引物：5’-TCTGCAGCTCTTACATAC-3’(SEQ ID NO:10)
CD2v基因反向引物：5’-CTTGCTCTGGATACGTTA-3’(SEQ ID NO:11)
CD2v基因探针：5’-CCACTACGGAGGCAATGCGA-3’(SEQ ID NO:12)；CD2v探针的5’端记报告荧光基团为Cy5，3’端标记荧光猝灭基团为BHQ3。
6.如权利要求1所述的一种非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括ASFV p72基因特异引物探针、内参猪β-actin的引物探针、ASFVI177L基因特异引物探针和ASFV CD2v基因特异引物探针。
7.如权利要求6所述的一种非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，试剂盒的荧光PCR反应体系为2×Ex Tag Mix for qPCR 12.5μl，10μmol/L P72-F/P72-R各0.5μl，10μmol/L内参F/内参R各0.5μl，10μmol/L I177L-F/I177L-R各0.5μl，10μmol/L CD2v-F/CD2v-R各0.5μl，加入3.5μl灭菌水使PCR体系为20μl，模板DNA的体积为5μl，总体系为25μl。
8.如权利要求7所述的一种非洲猪瘟三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，PCR反应体系中p72基因引物的浓度为0.4～0.8μM，p72基因探针的浓度为0.08～0.8μM；PCR反应体系中内参基因引物的浓度为0.4～0.8μM，内参基因探针的浓度为0.08～0.8μM；PCR反应体系中I177L基因引物浓度为0.4～0.8μM，I177L基因探针的浓度为0.08～0.8μM；PCR反应体系中CD2v基因引物浓度为0.4～0.8μM，CD2v基因探针的浓度为0.08～0.8μM。
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| CN117701779A (zh) * | 2024-02-04 | 2024-03-15 | 湖南派智生物科技有限公司 | 鉴别非洲猪瘟毒株的方法、引物探针组合、试剂、试剂盒及应用 |
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