RU2812441C1 - Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq - Google Patents
Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq Download PDFInfo
- Publication number
- RU2812441C1 RU2812441C1 RU2023113418A RU2023113418A RU2812441C1 RU 2812441 C1 RU2812441 C1 RU 2812441C1 RU 2023113418 A RU2023113418 A RU 2023113418A RU 2023113418 A RU2023113418 A RU 2023113418A RU 2812441 C1 RU2812441 C1 RU 2812441C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cav
- canine
- hepatitis virus
- infectious
- virus genotype
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 96
- 208000037319 Hepatitis infectious Diseases 0.000 title claims abstract description 75
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 title claims abstract description 75
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title claims abstract description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 41
- 239000002994 raw material Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 101150104494 CAV1 gene Proteins 0.000 title claims abstract 8
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims abstract description 72
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 15
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 claims description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 4
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 13
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 6
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- 101150076401 16 gene Proteins 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 208000004467 Infectious Canine Hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 241000701157 Canine mastadenovirus A Species 0.000 description 2
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000701244 Mastadenovirus Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 101150040063 orf gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 206010001258 Adenoviral infections Diseases 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 241000004176 Alphacoronavirus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 1
- 241000282487 Vulpes Species 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 210000001739 intranuclear inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000009800 post vaccination immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq. Технический результат заключается в разработке высокочувствительного, высокоспецифичного, экспрессного, не предполагающего применения линий клеток способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральной вакцины методом ПЦР-РВ по циклу количественной оценки Cq с целью устранения вышеуказанных недостатков. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq.
Инфекционные респираторные болезни собак возникают преимущественно у животных, содержащихся группами, в том числе в приютах, питомниках и ветеринарных лечебницах. Несколько исследований по оценке естественных вспышек заболеваний продемонстрировали сложную этиологию и инфицирование различными вирусами и бактериями [1].
Аденовирусные инфекции собак проявляются в виде двух самостоятельных болезней: инфекционного гепатита, вызываемого аденовирусом собак серотипа 1 (CAV-1), и аденовироза, вызываемого аденовирусом собак серотипа 2 (CAV-2) [2].
Первым детально описал этиологию и симптомы CAV-1 шведский ученый Рубарт (1947), именем которого иногда и называют болезнь [3].
Инфекционный гепатит (CAV-1) (заразное воспаление печени собак, болезнь Рубарта, вирусный гепатит) - это остроконтагиозное заболевание, протекающее с явлениями лихорадки, воспалительных процессов слизистых оболочек глаз, носовой полости, желудочно-кишечного тракта, печени и желчного пузыря, сопровождающегося иногда нарушением деятельности центральной нервной системы. Вирус инфекционного гепатита собак относится к семейству Adenoviridae, роду Mastadenovirus, виду Canine Mastadenovirus (CAV-1) [4].
Вирионы CAV-1, как и все аденовирусы, представляют собой изометрические частицы кубического типа симметрии с диаметром вириона 70-90 нм. На вершинах икосаэдра имеются отростки (фиберы). Капсид вириона включает 252 капсомера без супаркапсидной оболочки. Капсид содержит 12 структурных белков. Имеется также белок сердцевины, связанный с вирионной ДНК. Нуклеиновая кислота вириона представлена двуспиральной линейной молекулой ДНК размером около 30 500 п.н., которая кодирует белки orf 1-orf 30 [5, 6]. В геноме вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 выделяют различные консервативные области, в частности, ген, ответственный за синтез белка orf 16 (позиции в геноме 16757…19474 п.н.).
Антигенного родства вируса CAV-1 с аденовирусом человека не обнаружено. Штаммы вируса CAV-1, выделенные в разных регионах страны, антигенно-родственны. Вирус содержит преципитирующий, гемагтлютинирующий и комплементсвязывающий антигены и индуцирует образование соответствующих антител. Штаммы CAV-1 успешно репродуцируются в клеточных линиях почки щенков собак, песцов, лисиц [7, 8]. Из перевиваемых культур к этому вирусу высокочувствительна культура клеток почки собаки Мадина-Дарби MDCK (Madin Darbey canine kidney). При использовании данной клеточной линии цитопатическое действие достигает 95-100% через 48 ч и характеризуется округлением клеток, образованием конгломератов, напоминающих гроздья винограда. В клетках обнаруживаются внутриядерные тельца-включения. Большинство эпизоотических штаммов вируса CAV-1 обладают гемагглютинирующей активностью в отношении эритроцитов морской свинки и человека [9, 10, 11].
Система мер борьбы с инфекционным гепатитом собак генотипа CAV-1 и его профилактики предусматривает иммунизацию животных, а также контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [12, 13, 14].
Для иммунизации щенков применяют различные вакцины против инфекционного гепатита генотипа CAV-1 у собак [15, 16]. При изготовлении данных вакцин вируссодержащую суспензию исследуют на определение титра инфекционной активности для оценки его активности в клетках. В 1,0 см3 суспензии вируса определяют количество клеточных культуральных инфекционных доз, вызывающих 50%-ное поражение клеток, что фактически отражает концентрацию полных вирусных частиц, содержащих ДНК в активном состоянии.
Традиционно для определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита генотипа CAV-1 применяют метод титрования в монослойной перевиваемой клеточной линии почки собаки Мадина-Дарби (MDCK), с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50% клеток (прототип) [10]. Данный метод имеет некоторые ограничения в применении, а именно: 1) длительная процедура анализа, связанная с развитием цитопатического действия; 2) определенная степень субъективности при оценке результатов анализа; 3) высокая стоимость клеточной линии MDCK как тест-системы и затраты на ее поддержание; 4) высокая вероятность риска контаминации культуры клеток MDCK.
В связи с этим целесообразно провести поиск альтернативного способа определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) по циклу количественной оценки Cq.
Предложенный метод является высокочувствительным и специфичным, позволяет определять титр инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцин в течение 3 часов, не требует использования клеточной линии для анализа, не предполагает контаминации исследуемых образцов.
Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного, высокоспецифичного, экспрессного, не предполагающего применения линий клеток способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральной вакцины методом ПЦР-РВ по циклу количественной оценки Cq с целью устранения вышеуказанных недостатков.
Данная задача решена благодаря созданию нового опосредованного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин при использовании метода ПЦР-РВ по циклу количественной оценки Cq. Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности вируса в сырье для вакцины до 3 ч; 2) исключить вероятность контаминации исследуемого материала; 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров и ДНК-зонда, рассчитанных для orf 16-гена вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцины; 4) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между титром инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 (TCAV-1) и циклом количественной оценки (Cq), представленной в виде логарифмической функции:
lg TCAV-1=-0,2979×Ct+9,2595
с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9941) и эффективностью амплификации 99,38%. Предложенная модель позволяет опосредованно определять титр инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях:
Фиг. 1 - Нуклеотидная последовательность прямого, обратного праймеров и молекулярного ДНК-зонда при выравнивании с ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1. Примечание: используя выравнивания других изолятов и производственных штаммов получили тот же дизайн олигонуклеотидов.
Фиг. 2 - Зависимость титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 (TCAV-1) и величины цикла количественной оценки (Cq) с помощью метода ПЦР в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq (n=12, отмечены точки, отображающие средние значения Cq).
Сущность изобретения заключается в подходе по опосредованному определению титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцины методом ПЦР в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq. Заявляемый способ основан на:
1) элюировании ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применением экстракции смесью 5 М гуанидинизотиоцианата и 80%-ного раствора изопропилового спирта;
2) амплификации специфического фрагмента orf 16 ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применение оригинальных специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем FAM (λmax флуоресценции = 520 нм) и тушителем свечения RTQ-1 (λmax поглощения = 520 нм);
4) проведение реакции амплификации с детекцией ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды, стремящейся к экспоненте;
5) определении титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применением логарифмической функции, выраженной в виде уравнения lg TCAV-1=-0,2979×Ct+9,2595 с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9941) и эффективностью амплификации 99,38%.
В настоящее время ПЦР в режиме реального времени применяют для индикации нуклеиновых кислот различных инфекционных агентов, в том числе возбудителя инфекционного гепатита собак. Для опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 ранее данный метод с применением разработанной системы оригинальных праймеров и молекулярного зонда не использовался. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцины не обнаружено.
Разработанный способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцины с помощью метода ПЦР в режиме реального времени по сравнению с прототипом отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, объективностью и экспрессностью выполнения анализа и значительным снижением риска контаминации.
В отличие от прототипа разработанный способ включает этап элюирования ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применением экстракции смесью 5 М гуанидинизотиоцианата и 80%-ного раствора изопропилового спирта; амплификацию специфического фрагмента orf 16 ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применение оригинальных специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем FAM и тушителем свечения RTQ-1; проведение реакции амплификации с детекцией ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоиды, стремящейся к экспоненте; определение титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применением логарифмической функции, выраженной в виде уравнения lg TCAV-1=-0,2979×Ct+9,2595.
Применение предложенного способа позволит сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности CAV-1 до 3 ч; исключить вероятность контаминации и использование клеточных линий; повысить специфичность и чувствительность анализа; увеличить достоверность проводимого анализа. Таким образом, актуально применять предложенный способ для опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцины методом ПЦР в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq.
Ключевым элементом заявляемого способа является определение значений циклов количественной оценки Cq нуклеиновой кислоты вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в ПЦР режиме реального времени и расчет титра инфекционной активности данного вируса с использованием разработанной логарифмической модели зависимости цикла количественной оценки и титра.
Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа на основе ПЦР в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq, оригинальных специфичных праймеров и молекулярного зонда, рассчитанных на участок orf 16-гена, и разработанной логарифмической функции зависимости величины цикла количественной оценки и титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 для опосредованного определения титра инфекционной активности данного вируса в сырье для вакцин.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графике зависимости величины цикла количественной оценки (Cq) и титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 (TCAV-1) (n=12) (фиг. 2).
С целью определения титра инфекционной активности вируса инфекционнего гепатита собак генотипа CAV-1 подготавливают контрольную панель стандартов данного вируса, в качестве которых используют лиофильно высушенные суспензии возбудителя инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с титрами: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД50/см3, которые разводят 1/15 М фосфатно-буферным раствором до требуемого объема и титра инфекционной активности. В качестве отрицательных контролей применяют суспензию клеток MDCK, не зараженную вирусом.
Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяют ДНК с использованием 5 М раствора гуанидинизотиоцианата (соотношение пробы и ГТЦ=1/5) в процессе детергирования на стекловолокнистых фильтрах в течение 10 мин и последующим трехкратным промывании с использованием 80%-ного раствора изопропилового спирта (по 500 мкл на пробу).
На следующем этапе проводят ПЦР в режиме реального времени для исследования контрольных образцов и проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь, рецептура которой представлена в таблице 1. Дизайн праймеров и молекулярного зонда отражены в таблице 2. Расчет праймеров и зонда проводили на основании нуклеотидных последовательностей гена orf 16 штаммов вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1, опубликованных в базах данных GenBank и полученных в рамках исследований в «Федеральном центре охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).
В качестве гомологичных участку гена orf 16 олигонуклеотидов используют:
CAV-1-T-F-праймер (5'-CGTAATGGAAACCTAGGGG-3'),
CAV-1-T-R-праймер (5'-TCTGTGTTTCTGTCTTGG-3') и
CAV-1-Т-Pb-зонд (5'-FAM-CCAATCATCTCAACTAAATGCCGTG-RTQ1-3') (фиг. 1) в концентрации 5 пМ на реакцию. Для элонгации применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с их концентрацией в реакционной смеси по 0,2 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5×), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. Буферный раствор включает в свой состав ионы калия (К+) (5×10-2 М) и диметилсульфооксид (DMSO) (1,3%). В смесь также добавляют хлорида магния до концентрации 3 мМ. В качестве катализатора ПЦР в режиме реального времени применяют Tag ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (1 ед.). Элюаты ДНК каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.
Олигонуклеотиды для кДНК-матрицы подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работах В. Deiman и R. Sooknanan [14]. Длины CAV-1-T-F-праймер, CAV-1-T-R-праймер и CAV-1-Т-Pb-зонд составляют 19, 18 и 25 н.о., что соответствует требованиям. Молекулярный вес олигонуклеотидов прямого, обратного праймеров и зонда равен 59,01,9; 5493,6; 7570,0, соответственно. Праймеры и зонд очищены в полиакриламидном геле и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответственно. Нуклеотидная последовательность зонда не комплементарна олигонуклеотидным праймерам. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и зонда. Флуорофор FAM присоединен к 5'-концу, а гаситель флуоресценции RTQ1 - к 3'-концу. Данные условия соответствуют требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным праймерам и молекулярному зонду, которые участвуют в ПЦР в режиме реального времени. В качестве флуоресцентного красителя был выбран FAM с длиной волны максимальной флуоресценцией 520 нм. Для тушения свечения использовали гаситель флуоресценции RTQ1 с длиной волны максимального поглощения при 520 нм и возможном диапазоне гашения 470-570 нм. Иными словами, была выбрана подходящая пара «флуорофор-гаситель».
При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров и зонда не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя. Расчет вероятности образования «шпилек» и димеров олигонуклеотидов проводили при условии, что минимальное количество пар оснований, необходимых для димеризации, - 5, а для образования «шпилек», - 4.
Проведено определение температур плавления (Tm) для олигонуклеотидных праймеров и зонда. Точное определение температуры плавления играет важную роль в молекулярно-биологических исследованиях, в том числе при подборе ДНК-праймеров и зонда для ПЦР в режиме реального времени ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1. Для оценки температуры плавления олигонуклеотидов применяли метод учета концентрации солей в буферном растворе и метод ближайших соседей.
Физические, термодинамические константы и расчет температур плавления разработанных олигонуклеотидных ДНК-праймеров и молекулярного зонда представлены в таблице 3. Из нее следует, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для прямого праймера составили 158,1 ккал/моль, 23,8 ккал/моль, 471 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для обратного праймера составили 142,1 ккал/моль, 21,0 ккал/моль, 374,3 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для молекулярного ДНК-зонда - 198,9 ккал/моль, 31,7 ккал/моль, 523,1 кал/(°K×моль), соответственно. Данные значения необходимы для расчета температур плавления представленных олигонуклеотидов. Tm при использовании алгоритма ближайших соседей для прямого, обратного праймеров и зонда составили 49, 49 и 57°С, соответственно.
При использовании более простого метода, учитывающего концентрации ионов K+ и диметилсульфооксида (DMSO) Tm для прямого, обратного праймеров и зонда составили 57, 51 и 64°С.
Экспериментально было выявлено, что оптимальная температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов составляет 55°С. Для проведения ПЦР в режиме реального времени было решено проводить гибридизацию праймеров и зонда с участком orf 16-гена ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 при температуре 55°С.
Последовательности разработанных праймеров и молекулярного зонда проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности нуклеиновых кислот CAV-1. Последовательности праймеров и зонда также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold. Выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.
Постановку реакции осуществляли в детектирующем термоциклере любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4. Перед проведением ПЦР в режиме реального времени осуществляют предварительный прогрев смеси при температуре 96°С в течение 5 мин. для активации фермента Taq ДНК-полимеразы. ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию проводят при температуре 95°С в течение 10 с, отжиг олигонуклеотидов - при температуре 55°С в течение 17 с, элонгацию - при температуре 60°С в течение 20 с (табл. 4). Количество циклов количественной оценки для амплификации процесса составило 40.
Данные ПЦР в режиме реального времени анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки Cq, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl=f(Cq). Учет результатов в реакции происходит на каждом цикле. Флуориметр определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл реакции амплификации. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической ДНК-матрицы кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость. Положительными считаются пробы, которым соответствуют сигмоиды, полученные при анализе флуоресценции красителя, входящего в состав молекулярного зонда. Пробы считаются отрицательными, если при их анализе отсутствует экспоненциальная кривая.
Устанавливают зависимость между циклом количественной оценки и титром инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцины в процессе построения логарифмической функции. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле: Е=(10-1/k-1), где k - угловой коэффициент в зависимости Ct=-k×lg TCAV-1+b, а также достоверность аппроксимации (R2). На основе разработанной модели рассчитывают значение титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Выявление зависимости титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин и цикла количественной оценки Cq.
Для выявления зависимости титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцины и цикла количественной оценки Cq подготавливали контрольную панель стандартов данного вируса, в качестве которых использовали лиофилизированные суспензии вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с титрами: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД50/см3, которые растворяли в 1/15 М фосфатном буферном растворе до требуемого объема. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток MDCK, не содержащую посторонней микрофлоры.
Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяли ДНК, как описано выше. Проводили ПЦР в режиме реального времени для исследования стандартов, как описано выше. Результаты реакции анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки. Устанавливали зависимость между Cq и титром инфекционной активности вируса в сырье для вакцины в процессе построения логарифмической функции. Полученные данные отражены на фиг. 2 и выражены в виде логарифмической функции:
lg TCAV-1=-0,2979×Ct+9,2595
с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9941) и эффективностью амплификации 99,38%. Предложенная модель позволяет опосредованно определять титр инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин.
Пример 2. Применение способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq.
В исследовании использовали 6 суспензий культурального вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с титрами инфекционной активности 6,50; 6,75; 7,00; 7,25; 7,50; 7,75 lg ТЦД50/см3, соответственно (пробы №1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с титром инфекционной активности 7,00 lg ТЦД50/см3. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток MDCK, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в 12 повторностях. Этапы выделения ДНК, и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как описано выше.
Средние значения циклов количественной оценки для проб №1-6 составляли 9,31±0,01, 8,48±0,02, 7,64±0,02, 6,81±0,01, 5,98±0,01, 5,14±0,02, соответственно. Пользуясь разработанной логарифмической функцией lg TCAV-1=-0,2979×Ct+9,2595, рассчитали средние значения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 для проб №1-6, которые составили 6,49; 6,75; 7,00; 7,25; 7,50; 7,74 lg ТЦД50/см3, соответственно. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 7,64±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1, равному 7,00 lg ТЦД50/см3. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в данных образцах.
Исследуемые образцы параллельно тестировали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии MDCK. Обнаружили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом титрования в культуре клеток на 99-100% (n=12). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq. Таким образом, разработанный способ позволяет оценивать титр инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцины методом ПЦР в режиме реального времени.
Пример 3. Выявление степени достоверности определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцин с применением разработанного способа.
Для анализа использовали 210 суспензий культурального вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с титром инфекционной активности от 1,00 до 8,00 lg ТЦД50/см3. В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с титром инфекционной активности вируса 7,00 lg ТЦД50/см3. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток MDCK, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы экстрагирования нуклеиновых кислот и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как отражено выше. Результаты анализа представлены в таблице 5.
Интерпретацию результатов проводили, пользуясь разработанной логарифмической функцией lg TCAV-1=-0,2979×Ct+9,2595 с получением значений TCAV-1 для каждой из 210 проб. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 7,64±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1, равному 7,00 lg ТЦД50/см3. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие возбудителя инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в исследуемых пробах.
Анализируемые пробы и контроли также исследовали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии MDCK и в ПЦР в режиме реального времени. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали со стандартными значениями на 99,57-100,00% для 8,0-6,0 lg ТЦД50/см3 (n=42), на 98,13-99,56% для 5,9-4,0 lg ТЦД50/см3 (n=42), на 95,41-98,14% для 3,9-1,5 lg ТЦД50/см3 (n=84), на 94,21-97,56% для 1,4-1,0 lg ТЦД50/см3 (n=42). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцин. Таким образом, разработанный способ позволяет с высокой степенью достоверности оценивать титр инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцин.
Пример 4. Оценка аналитической чувствительности способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq.
При определении аналитической чувствительности способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq подготавливали серию стандартов вируса с TCAV-1, равными 1,00-8,00 lg ТЦД50/см3 с шагом 0,1 lg ТЦД50/см3. Контрольные образцы тестировали в 5 повторностях. Этапы элюирования нуклеиновой кислоты и постановку ПЦР в режиме реального времени, как описано выше. Подтверждено, что достоверность проводимого анализа с помощью разработанного способа составляет 99,57-100,00% для 8,0-6,0 lg ТЦД50/см3, на 98,13-99,56% для 5,9-4,0 lg ТЦД50/см3, на 95,41-98,14% для 3,9-1,5 lg ТЦД50/см3, на 94,21-97,56% для 1,4-1,0 lg ТЦД50/см3. При изготовлении вакцин применяют вируссодержащее сырье только с титрами инфекционной активности вируса ≥6,00 lg ТЦД50/см3. Для данных образцов достоверность определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 составляла 99,57-100%. Аналитическая чувствительность тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для вакцин составляет не менее 1,0 lg ТЦД50/см3 с достоверностью результатов исследования не менее 94,21%.
Пример 5. Оценка специфичности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq.
При оценке специфичности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq, исследовали суспензии вируса инфекционного гепатита собак генотипов CAV-1 и CAV-2, калицивируса FCV, вируса бешенства RabV, альфа-коронавируса собак CCoV. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял не менее 6,0 lg ТЦД50/см3. Исследования проводили в 5 повторностях.
Этапы элюирования нуклеиновой кислоты и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как описано выше. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,01 у.е.) (табл. 6). Таким образом, разработанный способ является специфичным по отношению к вирусу инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 и может быть использован для его количественного определения.
Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность исключить вероятность контаминации в ходе реакции; снизить время проведения анализа вируссодержащего сырья для вакцины до 3 ч; увеличить специфичность и чувствительность анализа по определению титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1. В предлагаемом изобретении между титром инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 (TCAV-1) и циклом количественной оценки (Cq) установлена зависимость, отраженная в виде логарифмической функции lg TCAV-1=-0,2979×Ct+9,2595 с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9941) и эффективностью амплификации 99,38%. Предложенная модель позволяет опосредованно определять титр инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин.
Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять титр инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq»:
1. Buonavoglia С, Martella V. Canine respiratory viruses. Vet Res 2007; 38: 355-373.
2. Erles K, Shiu KB, Brownlie J. Isolation and sequence analysis of canine respiratory coronavirus. Virus Res 2007; 124: 78-87.
3. Schoehn G, El Bakkouri M, Fabry CM et al Three-dimensional structure of canine adenovirus serotype 2 capsid. J Virol 2008; 82: 3192-203.
4. Carlton WW, McGavin MD. Thomson's Special Veterinary Pathology. St. Louis: Mosby, 1995; 125-195.
5. Damián M, Morales E, Salas G, Trigo FJ. Immunohistochemical detection of antigens of distemper, adenovirus and parainfluenza viruses in domestic dogs with pneumonia. J Comp Pathol 2005; 133: 289-293.
6. Benetka V, Weissenböck H, Kudielka I, Pallan C, Rothmüller G, Möstl K. Canine adenovirus type 2 infection in four puppies with neurological signs. Vet Rec 2006; 158: 91-94.
7. Yoon SS, Park JW, Jean YH, Kim HJ, Han B, Han HR. Prevalence of lymphocyte nuclear pockets in Holstein-Friesian dairy cattle infected with bovine leukemia virus in Korea. Asian-Aust J Anim Sci 2005; 18: 879-883.
8. Hu RL, Huang G, Qiu W, Zhong ZH, Xia XZ, Yin Z. Detection and differentiation of CAV-1 and CAV-2 by polymerase chain reaction. Vet Res Commun 2001; 25: 77-84.
9. Ditchfield J, Macpherson LW, Zbitnew A. Association of Canine Adenovirus (Toronto A 26/61) with an Outbreak of Laryngotracheitis ("Kennel Cough"): A Preliminary Report. Can Vet J 1962; 3: 238-47.
10. Yoon KB, Kang MI, Park NY, Han DU. Seroepidemiological survey on canine distemper, canine parvovirus, canine coronavirus, canine adenovirus type 2, canine parainfluenzavirus of dogs by indirect immunofluorescent test. Korean J Vet Res 1995; 35: 75-85.
11. Chvala S, Benetka V, Möstl K, Zeugswetter F, Spergser J, Weissenböck H. Simultaneous canine distemper virus, canine adenovirus type 2, and Mycoplasma cynos infection in a dog with pneumonia. Vet Pathol 2007; 44: 508-12.
12. Ducatelle R, Thoonen H, Coussement W, Hoorens J. Pathology of natural canine adenovirus pneumonia. Res Vet Sci 1981; 31: 207-12.
13. Grad R, Sobonya RE, Witten ML et al Localization of inflammation and virions in canine adenovirus type 2 bronchiolitis. Am Rev Respir Dis 1990; 142: 691-699.
14. McCandlish IA, Thompson H, Cornwell HJ, Wright NG. A study of dogs with kennel cough. Vet Rec 1978; 102: 293-301.
15. Shahrabadi MS, Yamamoto T. Cytoplasmic inclusions in canine cells infected with infectious canine laryngotracheitis (ICL) adenovirus. Can J Microbiol 1975; 21: 1421-1427.
16. Chouinard L, Martineau D, Forget C, Girald C. Use of polymerase chain reaction and immunohistochemistry for detection of canine adenovirus type 1 in formalin fixed, paraffin embedded liver of dogs with chronic hepatitis or cirrhosis. J Vet Diagn Invest 1998; 10: 320-325.
Claims (6)
1. Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq, включающий следующие стадии:
- элюирование ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применением экстракции смесью 5 М гуанидинизотиоцианата и 80%-ного раствора изопропилового спирта;
- проведение амплификации специфического фрагмента orf 16 ДНК вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применение оригинальных специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем FAM и тушителем свечения RTQ-1: CAV-1-T-F-праймер с дизайном 5'-CGTAATGGAAACCTAGGGG-3', CAV-1-T-R-праймер с дизайном 5'-TCTGTGTTTCTGTCTTGG-3' и CAV-1-T-Pb-зонд с дизайном 5'-FAM-CCAATCATCTCAACTAAATGCCGTG-RTQ1-3';
- расчет цикла количественной оценки Cq по данным ПЦР в режиме реального времени;
- определение титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 с применением логарифмической функции, выраженной в виде уравнения lg TCAV-1=-0,2979×Ct+9,2595 с достоверностью аппроксимации 0,9941 и эффективностью амплификации 99,38%.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что время проведения анализа сокращается до 3 ч, аналитическая чувствительность составляет не менее 1,0 lg ТЦД50/см3.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2812441C1 true RU2812441C1 (ru) | 2024-01-30 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110499393A (zh) * | 2019-08-30 | 2019-11-26 | 金宇保灵生物药品有限公司 | 犬腺病毒、犬腺病毒i型和犬腺病毒ii型的实时荧光定量pcr检测及鉴别引物和探针 |
| CN110846438A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-02-28 | 金宇保灵生物药品有限公司 | 犬腺病毒ii型、犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的四重实时荧光定量pcr检测 |
| RU2756472C1 (ru) * | 2020-09-10 | 2021-09-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Способ опосредованного определения инфекционного титра вируса бешенства в неинактивированном сырье для антирабических вакцин при транскрипционной амплификации и детекции продуктов реакции с применением beacon-технологии |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110499393A (zh) * | 2019-08-30 | 2019-11-26 | 金宇保灵生物药品有限公司 | 犬腺病毒、犬腺病毒i型和犬腺病毒ii型的实时荧光定量pcr检测及鉴别引物和探针 |
| CN110846438A (zh) * | 2019-11-27 | 2020-02-28 | 金宇保灵生物药品有限公司 | 犬腺病毒ii型、犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的四重实时荧光定量pcr检测 |
| RU2756472C1 (ru) * | 2020-09-10 | 2021-09-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Способ опосредованного определения инфекционного титра вируса бешенства в неинактивированном сырье для антирабических вакцин при транскрипционной амплификации и детекции продуктов реакции с применением beacon-технологии |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Decaro N, Martella V, Buonavoglia C. Canine adenoviruses and herpesvirus. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2008 Jul;38(4):799-814, viii. doi: 10.1016/j.cvsm.2008.02.006. PMID: 18501279; PMCID: PMC7114865. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Belák | Molecular diagnosis of viral diseases, present trends and future aspects: A view from the OIE Collaborating Centre for the Application of Polymerase Chain Reaction Methods for Diagnosis of Viral Diseases in Veterinary Medicine | |
| Tao et al. | Application of CRISPR-Cas12a enhanced fluorescence assay coupled with nucleic acid amplification for the sensitive detection of African swine fever virus | |
| CN106244725B (zh) | 一种诊断猪脐带血伪狂犬病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途 | |
| CN106048094B (zh) | 猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的双重实时荧光定量pcr检测试剂盒及引物和探针 | |
| CN1710101B (zh) | 一种检测猪伪狂犬病毒荧光定量pcr试剂盒及应用 | |
| CN106435023B (zh) | 一种检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途 | |
| WO2020034317A1 (zh) | 塞内卡病毒和口蹄疫病毒双重实时荧光定量pcr检测试剂及试剂盒 | |
| Zeng et al. | Molecular detection of genotype II grass carp reovirus based on nucleic acid sequence-based amplification combined with enzyme-linked immunosorbent assay (NASBA-ELISA) | |
| CN105886663A (zh) | 一种锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量pcr的检测试剂盒 | |
| CN106350607B (zh) | 一种检测猪脐带血中猪流行性腹泻病毒野毒株的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途 | |
| Yi et al. | Development of a duplex TaqMan real-time RT-PCR assay for simultaneous detection of goose astrovirus genotypes 1 and 2 | |
| Dong et al. | Development of a three-panel multiplex real-time PCR assay for simultaneous detection of nine canine respiratory pathogens | |
| Steyer et al. | A diagnostic method based on MGB probes for rapid detection and simultaneous differentiation between virulent and vaccine strains of avian paramyxovirus type 1 | |
| RU2812441C1 (ru) | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вируса инфекционного гепатита собак генотипа CAV-1 в сырье для культуральных вакцин с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени по циклу количественной оценки Cq | |
| Ge et al. | Rapid and sensitive detection of mink circovirus by recombinase polymerase amplification | |
| CN107236827B (zh) | 猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒及检测方法 | |
| Ferreira et al. | Single-nucleotide polymorphism analysis to select conserved regions for an improved real-time reverse transcription–PCR test specific for Newcastle disease virus | |
| CN114395643A (zh) | 非洲猪瘟病毒的双通道数字pcr检测试剂盒及方法 | |
| CN109762941B (zh) | 一种检测致禽类死亡病原的液态芯片 | |
| KR101617142B1 (ko) | 개선된 검출 정확성을 제공해 줄 수 있는 핵산검사 기반의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 키트 | |
| RU2812858C1 (ru) | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вобудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени | |
| RU2815533C1 (ru) | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин методом обратной транскрипции и реакции амплификации в режиме реального времени | |
| RU2808585C1 (ru) | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности мастаденовируса собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени | |
| RU2808641C1 (ru) | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя инфекционного ринотрахеита кошек FHV в неинактивированном сырье для вакцин с применением полимеразной цепной реакции и количественной гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени | |
| RU2809224C1 (ru) | Способ опосредованного определения титра инфекционной активности альфа-коронавируса собак производственного штамма РИЧ в сырье для вакцины методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени |