RU2812858C1

RU2812858C1 - Способ опосредованного определения титра инфекционной активности вобудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени

Info

Publication number: RU2812858C1
Application number: RU2023120223A
Authority: RU
Inventors: Максим Игоревич Доронин; Татьяна Сергеевна Галкина; Дмитрий Валерьевич Михалишин; Марина Николаевна Гусева; Татьяна Владимировна Оковытая; Надежда Николаевна Медведева; Марина Анатольевна Прокопенко
Filing date: 2023-07-31
Publication date: 2024-02-05

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени, отличающийся тем, что предполагает использование разработанных оригинальных олигонуклеотидных праймеров и зонда. Технический результат заключается в разработке высокочувствительного, высокоспецифичного, быстрого и объективного, не предполагающего применения линий клеток способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 5 пр.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и производству вакцин против парвовирусного энтерита собак, а именно к способу опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени.

Возбудитель парвовирусного энтерита Canine parvovirus (CPV) вызывает острый, иногда с летальным исходом, гастроэнтерит у собак.

Собачий парвовирус является важным патогеном для домашних собак и некоторых видов диких хищников. Он принадлежит к роду Protoparvovirus семейства Parvoviridae. Вирус автономно реплицируется в клетках-хозяевах и генетически связан с парвовирусом кошек (FPV) и вирусом энтерита норок (MEV), которые инфицируют разных животных-хозяев. Оригинальный CPV был впервые идентифицирован в 1978 году и быстро распространился по всему миру [1, 2].

Геном возбудителя парвовирусного энтерита представлен двуцепочечной молекулой ДНК длиной около 4200-4300 п.н. В результате проведения его картирования определили, что участок ДНК в диапазоне 1…2007 п.н. кодирует два неструктурных белка NS1 и NS2. Структурный белок VP₁ кодируется участками в диапазонах 2014…2044 и 2117…2514 п.н., a VP₂ - 2515…4269 п.н. [3].

В настоящее время известны следующие генотипы CPV: 1, 2а, 2b, 2с, 3, которые по-разному распространены в популяции собак во всем мире [4-6].

Система мер для борьбы с парвовирусным энтеритом собак и его профилактика предусматривает иммунизацию домашних животных [1]. Для этой цели применяют вакцинные препараты. При их изготовлении вируссодержащее сырье исследуют на определение титра инфекционной активности CPV для оценки его активности в клетках. В 1,0 см³ суспензии вируса определяют количество тканевых цитопатических доз, вызывающих 50%-ное поражение клеток, что фактически отражает концентрацию вирионов, содержащих ДНК возбудителя парвовирусного энтерита собак.

Традиционно для определения титра инфекционной активности CPV применяют метод титрования в перевиваемой монослойной культуре клеток почки кошек (CrFK), с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50% клеток (прототип) [7]. Данный метод имеет некоторые недостатки: 1) длительная процедура титрования, связанная с поражением клеток возбудителем заболевания; 2) субъективность при оценке результатов исследования; 3) высокая стоимость клеточной линии CrFK как тест-системы и затраты на ее поддержание; 4) высокая вероятность риска контаминации культуры клеток CrFK.

В связи с этим целесообразно провести поиск альтернативного способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени.

Предложенный метод является высокочувствительным и специфичным, объективным и позволяет определять титр инфекционной активности CPV в вируссодержащих суспензиях в течение 3 часов, не требует использования культуры клеток для анализа, не предполагает контаминации исследуемых образцов, исключает фактор субъективной оценки результатов исследования, поскольку проводится учет конечных данных с помощью приборного обеспечения.

Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного, высокоспецифичного, быстрого и объективного, не предполагающего применения линий клеток способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря созданию способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени. Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности CPV до 3 ч; 2) исключить вероятность контаминации исследуемого образца; 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров и молекулярного зонда, рассчитанных для VP₂-гена CPV; 4) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между титром инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита (T_CPV) и циклом количественной оценки (C_q), представленной в виде логарифмической функции:

lg T_CPV=-0,3003×C_q+9,4227

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9965) и эффективностью амплификации 99,73%. Предложенная модель позволяет опосредованно определять титр инфекционной активности CPV в сырье для вакцин с помощью разработанного способа.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Нуклеотидная последовательность прямого, обратного праймеров и молекулярного зонда для ДНК CPV. Примечание: А - дизайн прямого праймера, Б - дизайн молекулярного зонда, В - дизайн обратного праймера.

Фиг. 2 - Зависимость титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак (T_CPV) и величины цикла количественной оценки (C_q) с помощью метода ПЦР в режиме реального времени (n=7, отмечены точки, отображающие средние значения циклов количественной оценки).

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность ДНК возбудителя парвовирусного энтерита собак штамма «CPV-N»;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот возбудителя парвовирусного энтерита собак штамма «CPV-N».

Сущность изобретения заключается в подходе по опосредованному определению титра инфекционной активности CPV в сырье для вакцин с помощью ПНР в режиме реального времени. Заявляемый способ основан на: 1) экстрагировании ДНК CPV с применением 5 М раствора гуанидинизотиоцианата и 85% раствора изопропилового спирта; 2) проведении амплификации специфического фрагмента VP₂-гена CPV с применение оригинальных специфических праймеров CPV-T-F3493, CPV-T-R3718, а также молекулярного зонда CPV-T-P3627, меченого флуоресцентным красителем FAM (λ_max флуоресценции=520 нм) и тушителем свечения RTQ-1 (λ_max поглощения=520 нм); 3) проведение реакции амплификации с выявлением ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде логистической кривой; 4) определении титра инфекционной активности CPV с применением логарифмической функции, выраженной в виде уравнения:

lg T_CPV=-0,3003×C_q+9,4227

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9994) и эффективностью амплификации 99,73%.

Молекулярные методы диагностики значительно улучшились за последние годы, что дает огромный потенциал для их применения в клинической диагностике, где требуется более быстрое и точное выявление инфекционных возбудителей [8].

В настоящее время метод ПНР в режиме реального времени применяют для индикации нуклеиновых кислот и проведения филогенетического анализа различных инфекционных агентов, в том числе возбудителя парвовирусного энтерита собак [8-9]. Для опосредованного определения титра инфекционной активности CPV ранее данный метод с применением разработанной системы оригинальных праймеров и молекулярного зонда не использовался. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени авторами не обнаружено.

Разработанный способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом 1ГЦР в режиме реального времени по сравнению с прототипом отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, объективностью и экспрессностью выполнения анализа и значительным снижением риска контаминации.

В отличие от прототипа разработанный способ включает этапы экстрагирования ДНК CPV с применением 5М раствора гуанидинизотиоцианата; проведения реакции амплификации специфического фрагмента VP₂-гена CPV с применение оригинальных специфических праймеров CPV-T-F3493, CPV-T-R3718, а также молекулярного зонда CPV-T-Р3627; определения титра инфекционной активности CPV с применением логарифмической функции, выраженной в виде уравнения:

lg T_CPV=-0,3003×C_q+9,4227.

Применение предложенного способа позволит сократить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра инфекционной активности CPV до 3 ч; исключить вероятность контаминации и использование клеточных линий; повысить специфичность и чувствительность анализа; увеличить достоверность проводимого анализа. Иными словами, актуально применять предложенный способ для опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени.

Ключевым элементом заявляемого способа является определение значений циклов количественной оценки реакции амплификации ДНК CPV в ПЦР режиме реального времени и расчет титра инфекционной активности данного вируса с использованием разработанной логарифмической модели зависимости C_q и титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа на основе ПЦР в режиме реального времени, с применением оригинальных специфичных праймеров и молекулярного зонда, рассчитанных на участок VP₂-гена CPV, и разработанной логарифмической функцией зависимости величины цикла количественной оценки и титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак для опосредованного определения титра инфекционной активности данного вируса в сырье для вакцин.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графике зависимости титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак (T_CPV) и величины цикла количественной оценки (C_q) с помощью метода ПЦР в режиме реального времени (n=7, отмечены точки, отображающие средние значения циклов количественной оценки) (фиг. 2).

С целью определения титра инфекционной активности CPV подготавливают контрольную панель стандартов возбудителя парвовирусного энтерита, в качестве которых используют лиофильно высушенные суспензии вируса с титрами: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД₅₀/см³, которые разводят 1/15 М фосфатно-буферным раствором до требуемого объема и титра инфекционной активности. В качестве отрицательных контролей применяют суспензию клеток CrFK, не контаминированную микроорганизмами.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяют ДНК с использованием 5 М раствора гуанидинизотиоцианата (соотношение пробы и ГТЦ=1/5) в процессе детергирования на стекловолокнистых фильтрах в течение 10 мин и последующим трехкратным промывании с использованием 85%-ного раствора изопропилового спирта (по 500 мкл на пробу).

На следующем этапе проводят реакцию амплификации в режиме реального времени для исследования контрольных образцов и проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь, рецептура которой представлена в таблице 1. Дизайн праймеров и молекулярного зонда отражены в таблице 2.

Расчет дизайна праймеров и зонда проводили на основании нуклеотидных последовательностей VP₂-гена CPV 20 штаммов и изолятов, опубликованных в базах данных GenBank [3].

В качестве гомологичных участку VP₂-гена возбудителя парвовирусного энтерита олигонуклеотидов используют:

CPV-T-F3493-праймер (5'-GAAGCTACTATTATGAGACCA-3'),

CPV-Т-R3718-праймер (5'-TCTTCCTGTATCTTGATGTGC-3') и

CPV-Т-Р3627-зонд (5'-FAM-AGCAGATGGTGATCCAAGA-RTQ1-3') (фиг. 1) в концентрации 5 пМ на реакцию. Для элонгации применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с их концентрацией в реакционной смеси по 0,25 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5х), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. В смесь также добавляют хлорида магния до концентрации 3,0 мМ. В качестве катализатора ПЦР в режиме реального времени применяют Tag ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (1 ед.). Элюаты РНК CPV каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.

Олигонуклеотиды для кДНК-матрицы подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работах В. Deiman и R. Sooknanan. Длины CPV-T-F3493, CPV-T-R3718 и CPV-T-P3627 составляют 21, 21, 19 н.о. каждый, что соответствует требованиям. Молекулярный вес олигонуклеотидов прямого, обратного праймеров и зонда равен 6438,3; 6369,2; 5885,9, соответственно. Праймеры и зонд очищены в полиакриламидном геле и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответственно. Нуклеотидная последовательность зонда не комплементарна олигонуклеотидным праймерам. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и зонда. Флуорофор FAM присоединен к 5'-концу, а гаситель флуоресценции RTQ1 - к 3'-концу. Данные условия соответствуют требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным праймерам и молекулярному зонду, которые участвуют в ПЦР в режиме реального времени. В качестве флуоресцентного красителя был выбран FAM с длиной волны максимальной флуоресценцией 520 нм. Для тушения свечения использовали гаситель флуоресценции RTQ1 с длиной волны максимального поглощения при 520 нм и возможном диапазоне гашения 470-570 нм. Иными словами, была выбрана подходящая пара «флуорофор-гаситель».

При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров и зонда не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя. Расчет вероятности образования «шпилек» и димеров олигонуклеотидов проводили при условии, что минимальное количество пар оснований, необходимых для димеризации, - 5, а для образования «шпилек», - 4.

Проведено определение температур плавления (T_m) для олигонуклеотидных праймеров и зонда. Точное определение температуры плавления играет важную роль в молекулярно-биологических исследованиях, в том числе при подборе олигонуклеотидных праймеров и зонда для ПЦР в режиме реального времени ДНК CPV. Для оценки температуры плавления олигонуклеотидов применяли метод, учитывающий концентрации ионов K⁺и диметилсульфооксида (DMSO).

Физические, термодинамические константы и расчет температур плавления разработанных олигонуклеотидных праймеров и молекулярного зонда представлены в таблице 3. Из нее следует, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для прямого праймера составили 156,4 ккал/моль, 23,2 ккал/моль, 413,3 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для обратного праймера составили 161,8 ккал/моль, 24,8 ккал/моль, 425,6 кал/(°K×моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для молекулярного зонда - 148,7 ккал/моль, 23,3 ккал/моль, 388,2 кал/(°K×моль), соответственно. Данные значения необходимы для расчета температур плавления представленных олигонуклеотидов. T_m при использовании алгоритма ближайших соседей для прямого, обратного праймеров и зонда составили 55, 57, 55°С, соответственно.

Экспериментально было выявлено, что оптимальная температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов составляет 56°С. Для проведения ПЦР в режиме реального времени было решено проводить гибридизацию праймеров и зонда с участком VP₂-гена CPV при температуре 56°С.

Последовательности разработанных праймеров и молекулярного зонда проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности нуклеиновых кислот парвовируса. Последовательности праймеров и зонда также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold. Выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.

Постановку реакции осуществляли в детектирующем термоциклере любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4.

Перед проведением ПЦР в режиме реального времени осуществляют предварительный прогрев смеси при температуре 95°С в течение 10 мин. для активации фермента Taq ДНК-полимеразы.

ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию осуществляют при температуре 95°С в течение 15 с, отжиг олигонуклеотидов проводят при температуре 56°С в течение 30 с, элонгацию при температуре 72°С в течение 20 с (табл. 4).

Результаты реакции амплификации в режиме реального времени анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки C_q, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции F1=f (C_q). Учет результатов в реакции происходит на каждом цикле. Флуориметр определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл реакции амплификации. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической ДНК-матрицы CPV кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость (график представлен в виде логистической кривой). Положительными считаются пробы, которым соответствуют сигмоиды, полученные при анализе флуоресценции красителя FAM, входящего в состав молекулярного зонда. Пробы считаются отрицательными, если при их анализе отсутствует логистическая кривая в виде графика, приближенного к экспоненте.

Устанавливают зависимость между циклом количественной оценки и титром инфекционной активности CPV в сырье для вакцин в процессе построения логарифмической функции. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле: Е=(10^-"^1/k-1),

где, k - угловой коэффициент в зависимости: C_q=-k× lg T_CPV+b, а также достоверность аппроксимации (R²). На основе разработанной модели рассчитывают значение титра инфекционной активности CPV в сырье для вакцин.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Выявление зависимости титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцины и цикла количественной оценки ПЦР в виде логарифмической функции.

Для выявления зависимости титра инфекционной активности CPV в сырье для вакцин и цикла количественной оценки ПЦР подготавливали контрольную панель стандартов CPV, в качестве которых использовали лиофилизированные суспензии вируса с титрами: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД₅₀/см³, которые растворяли в 1/15 М фосфатном буферном растворе до требуемого объема. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток CrFK, не контаминированную микроорганизмами.

Из всех стандартных положительных образцов и отрицательных контролей, а также тестируемых проб выделяли ДНК в соответствии с методикой, представленной выше.

Проводили ГЩР в режиме реального времени для исследования стандартов, как описано выше. Результаты реакции анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки C_q, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции F1=f (C_q). Устанавливали зависимость между циклом количественной оценки и титром инфекционной активности CPV в сырье для вакцин в процессе построения логарифмической функции. Полученные данные отражены на фиг. 2 и выражены в виде логарифмической функции: lg T_CPV=-0,3003×C_q+9,4227, с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9994) и эффективностью амплификации 99,73%. Предложенная модель позволяет опосредованного определять титр инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита в сырье для вакцин с помощью разработанного способа.

Пример 2. Применение способа опосредованного определения титра инфекционной активности CPV в сырье для вакцин с использованием ПЦР в режиме реального времени.

В исследовании использовали 6 суспензий культурального CPV с титрами инфекционной активности 6,50; 6,75; 7,00; 7,25; 7,50; 7,75 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно (пробы №1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального CPV с титром инфекционной активности 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток CrFK, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в 7 повторностях. Этап элюирования ДНК и постановку ПЦР в режиме реального времени проводили, как описано выше.

Средние значения пороговых циклов амплификации для проб №1-6 составляли 9,66±0,01, 8,93±0,02, 8,07±0,01, 7,20±0,01, 6,35±0,01, 5,61±0,01, соответственно. Пользуясь разработанной логарифмической функцией:

lg T_CPV=-0,3003×C_q+9,4227

с высокой достоверностью аппроксимации (R²=0,9994) и эффективностью амплификации 99,73%, рассчитали средние значения титра инфекционной активности CPV для проб №1-6, которые составили 6,52; 6,74; 7,00; 7,26; 7,52; 7,74 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 8,07±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности CPV, равному 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие CPV в данных образцах. Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцины с помощью ПЦР в режиме реального времени. Таким образом, разработанный способ позволяет рассчитывать титр инфекционной активности CPV в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени.

Пример 3. Выявление степени достоверности определения титра инфекционной активности CPV в сырье для вакцин с применением разработанного способа.

Для анализа использовали 300 суспензий культурального CPV с титрами инфекционной активности от 1,00 до 8,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве положительного контроля применяли суспензию культурального CPV с титром инфекционной активности вируса 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток CrFK, не зараженную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы экстрагирования нуклеиновых кислот и постановку ПГДР в режиме реального времени проводили, как отражено выше. Результаты анализа представлены в таблице 5.

Интерпретацию результатов проводили, пользуясь разработанной логарифмической функцией:

lg T_CPV=-0,3003×C_q+9,4227,

(R²=0,9994, Е=99,73%) с получением значений T_CPV для каждой из 300 проб. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 8,07±0,01, что соответствовало титру инфекционной активности CPV, равному 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие CPV в данных образцах.

Анализируемые пробы и контроли также тестировали в ПЦР в режиме реального времени. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали со значениями стандартов на 99,64-100,00% для 8,0-6,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=75), на 98,21-99,59% для 5,9-4,0 lg ТЦД₅₀/см³ (n=75), на 96,99-99,54% для 3,9-1,5 lg ТЦД₅₀/см³ (n=75), на 96,19-99,11% для 1,4-1,0 lg ТЦД₅о/см³ (n=75). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра инфекционной активности CPV в сырье для вакцин с помощью ПЦР в режиме реального времени. Таким образом, разработанный способ позволяет с высокой степенью достоверности определять титр инфекционной активности CPV в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени.

Пример 4. Определение аналитической чувствительности способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени.

При определении аналитической чувствительности способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени подготавливали серию стандартов CPV разных штаммов с титрами инфекционной активности, равными 1,00-8,00 lg ТЦД₅₀/см³ с шагом 0,1 lg ТЦД₅₀/см³. Контрольные образцы тестировали в 4 повторностях. Этапы элюирования нуклеиновой кислоты и постановку ПЦР в режиме реального времени, как описано выше. Выявлено, что с достоверностью 96,19-100,00% разработанным способом определены титры инфекционной активности CPV со значениями от 1,0 до 8,0 lg ТЦД₅₀/см³. При изготовлении вакцин применяют вируссодержащее сырье только с титрами инфекционной активности вируса ≥4,00 lg ТЦД₅₀/см³. Для данных образцов достоверность определения титра инфекционной активности CPV составляла 98,21-100,00%.

Аналитическая чувствительность тест-системы, разработанной для способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени составляет не менее 1,0 lg ТЦД₅₀/см³ с достоверностью результатов исследования не менее 96,19%.

Пример 5. Исследование специфичности способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени.

При анализе специфичности способа опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени, исследовали суспензии CPV, а также штамма «РВ-97» вируса бешенства, штамма «Рич» возбудителя коронавирусного энтерита собак, штамма «ВГНКИ» аденовируса 1 серотипа. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял не менее 4,0 lg ТЦД₅₀/см³. Исследования проводили в 5 повторностях.

Этапы исследования проводили, как описано выше. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,005 у.е.) (табл. 6). Таким образом, разработанный способ является специфичным по отношению к возбудителю парвовирусного энтерита собак и может быть использован для его количественного определения.

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность исключить вероятность контаминации в ходе реакции и субъективность при учете результатов анализа; снизить время проведения анализа вируссодержащего сырья для вакцин до 3,0 ч; увеличить специфичность и чувствительность анализа по определению титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак. В предлагаемом изобретении между титром инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак (T_CPV) и циклом количественной оценки (C_q) установлена зависимость, отраженная в виде логарифмической функции: lg T_CPV=-0,3003×C_q+9,4247

(R²=0,9994, Е=99,73%).

Разработанная математическая модель дает возможность определять титр инфекционной активности CPV в сырье при производстве вакцин.

Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности рассчитывать титр инфекционной активности CPV в сырье для вакцин на основе разработанного способа с применением оригинальных специфических олигонуклеотидных праймеров и зонда для участка VP₂-гена CPV и разработанной логарифмической модели.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени»:

1. Decaro N, Buonavoglia C, Barrs VR. Canine parvovirus vaccination and immunisation failures: Are we far from disease eradication? Vet Microbiol. 2020 Aug;247:108760. doi: 10.1016/j.vetmic.2020.108760. Epub 2020 Jun 15. PMID: 32768213; PMCID: PMC7295477.

2. Kang BK, Song DS, Lee CS, Jung KI, Park SJ, Kim EM, Park BK. Prevalence and genetic characterization of canine parvoviruses in Korea. Virus Genes. 2008;36:127-33. doi: 10.1007/s11262-007-0189-6.

3. GenBank. Canine parvovirus. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=Canine+parvovirus (Дата обращения: 17.05.2023).

4. Wang НС, Chen WD, Lin SL, Chan JP, Wong ML. Phylogenetic analysis of canine parvovirus VP2 gene in Taiwan. Virus Genes. 2005;31:171-4. doi: 10.1007/s 11262-005-1791-0.

5. Mohan Raj J, Mukhopadhyay HK, Thanislass J, Antony PX, Pillai RM. Isolation, molecular characterization and phylogenetic analysis of canine parvovirus. Infect Genet Evol. 2010;10:1237-41.doi: 10.1016/j.meegid.2010.08.005.

6. Phromnoi S, Sirinarumitr K, Sirinarumitr T. Sequence analysis of VP2 gene of canine parvovirus isolates in Thailand. Virus Genes. 2010;41:23-9. doi: 10.1007/s11262-010-0475-6.

7. Нао X, Li Y, Xiao X, Chen B, Zhou P, Li S. The Changes in Canine Parvovirus Variants over the Years. Int J Mol Sci. 2022 Sep 29;23(19):11540. doi: 10.3390/ijms231911540. PMID: 36232841; PMCID: PMC9569878.

8. Decaro N, Elia G, Desario C, Roperto S, Martella V, Campolo M, Lorusso A, Cavalli A, Buonavoglia C. A minor groove binder probe real-time PCR assay for discrimination between type 2-based vaccines and field strains of canine parvovirus. J Virol Methods. 2006 Sep;136(l-2):65-70. Miranda C, Thompson G. Canine parvovirus: the worldwide occurrence of antigenic variants. J Gen Virol. 2016 Sep; 97(9):2043-2057. doi: 10.1099/jgv.0.000540. Epub 2016 Jul 7. PMID: 27389721.

9. Decaro N, Buonavoglia C. Canine parvovirus~a review of epidemiological and diagnostic aspects, with emphasis on type 2c. Vet Microbiol. 2012 Feb 24;155(1):1-12. doi: 10.1016/j.vetmic.2011.09.007. Epub 2011 Sep 12. PMID: 21962408; PMCID: PMC7173204.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="CPV Titre.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-06-10">

</ApplicationIdentification>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны

здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI "ARRIAH"</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ опосредованного определения

титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита

собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального

времени</InventionTitle>

<INSDSeq_length>4266</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..4266</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CPV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgtctggcaaccagtatactgaggaagttatggagggagtaaattggt

taaagaaacatgcagaaaatgaagcattttcgtttgtttttaaatgcgacaacgtccaactaaatggaaa

ggatgttcgctggaacaactataccaaaccaattcaaaatgaagagctaacatctttaattagaggagca

caaacagcaatggatcaaaccgaagaagaagaaatggactgggaatcggaagttgatagtctcgccaaaa

agcaagtacaaacttttgatgcattaattaaaaaatgtctttttgaagtctttgtttctaaaaatataga

accaaatgaatgtgtttggtttattcaacatgaatggggaaaagatcaaggctggcattgtcatgtttta

cttcatagtaagaacttacaacaagcaactggtaaatggctacgcagacaaatgaatatgtattggagta

gatggttggtgactctttgttcggtaaacttaacaccaactgaaaagattaagctcagagaaattgcaga

agatagtgaatgggtgactatattaacatacagacataagcaaacaaaaaaagactatgttaaaatggtt

cattttggaaatatgatagcatattactttttaacaaagaaaaaaattgtccacatgacaaaagaaagtg

gctattttttaagtactgattctggttggaaatttaactttatgaagtatcaagacagacaaattgtcag

cacactttacactgaacaaatgaaaccagaaaccgttgaaaccacagtgacgacagcacaggaaacaaag

cgcgggagaattcaaactaaaaaggaagtgtcaatcaaatgtactttgcgggacttggttagtaaaagag

taacatcacctgaagactggatgatgttacaaccagatagttatattgaaatgatggcacaaccaggagg

tgaaaatcttttaaaaaatacacttgaaatttgtactttgactttagcaagaacaaaaacagcatttgaa

ttaatacttgaaaaagcaaataatactaaactgactaactttgatcttgcaaattctagaacatgtcaaa

tttttagaatgcacggatggaattggattaaagtttgtcacgctatagcatgtgttttaaatagacaagg

tggtaaaagaaatacagttctttttcatggaccagcaagtacaggaaaatctatcattgctcaagccata

gcacaagctgtgggtaatgttggttgttataatgcagcaaatgtaaattttccatttaatgactgcacca

ataaaaatttaatttggattgaagaagctggtaactttggtcaacaagttaatcaatttaaagcaatctg

ttctggacaaacaattagaattgatcaaaaaggcaaaggaagtaagcaaattgaaccaactccagtaatt

atgacaactaatgaaaatataacaattgtgagaattggatgtgaagaaagacctgaacatacacaaccaa

taagagacagaatgttgaacattaagttagtatgtaagcttccaggagactttggtttggttgataaaga

agaatggcctttaatatgtgcatggttagttaaacatggttttgaatcaaccatggctaactatacacat

cattggggaaaagtaccagaatgggatgaaaactgggcggagcctaaaatacaagaaggtataaattcac

caggttgcaaagacttagagacacaagcggcaagcaatcctcagagtcaagaccaagttccaactcctct

gactccggacgtagtggaccttgcactggaaccgtggagtactccagatacgcctattgcagaaactgca

aatcaacaatcaaaccaacttggcgttactcacaaagacgtgcaagcgagtccaacgtggtccgaaatag

aggcagacctgagagccatctttacttctgaacaattggaagaagattttcgagacgacttggattaagg

tacgatggcacctccggcaaagagagccaggagaggtaagggtgtgttagtaaagtggggggaggggaaa

gatttaataacttaactaagtatgtgtttttttataggacttgtgcctccaggttataaatatcttgggc

ctgggaacagtcttgaccaaggagaaccaactaacccttctgacgccgctgcaaaagaacacgacgaagc

ttacgctgcttatcttcgctctggtaaaaacccatacttatatttttcgccagcagatcaacgctttata

gatcaaacaaaggacgctaaagattggggggggaaaataggacattatttttttagagctaaaaaggcaa

ttgctccagtattaactgatacaccagatcatccatcaacatcaagaccaacaaaaccaactaaaagaag

taaaccaccacctcatattttcatcaatcttgcaaaaaaaaaaaaagccggtgcaggacaagtaaaaaga

gacaatcttgcaccaatgagtgatggagcagtccaaccagacggtggtcagcctgctgtcagaaatgaaa

gagctacaggatctgggaacgggtctggaggcgggggtggtggtggttctgggggtgtggggatttctac

gggtactttcaataatcagacggaatttaaatttttggaaaacggatgggtggaaatcacagcaaactca

agcagacttgtacatttaaatatgccagaaagtgaaaattatagaagagtggttgtaaataatttggata

aaactgcagttaacggaaacatggctttagatgatactcatgcacaaattgtaacaccttggtcattggt

tgatgcaaatgcttggggagtttggtttaatccaggagattggcaattaattgttaatactatgagtgag

ttgcacttagttagttttgaacaagaaatttttaatgttgttttaaagactgtttcagaatctgctactc

agccaccaactaaagtttataataatgatttaactgcatcattgatggttgcattagacagtaataatac

tatgccatttactccagcagctatgagatctgagacattgggtttttatccatggaaaccaaccatacca

actccatggagatattatattcaatgggatagaacattaataccatctcatactggaactagtggcacac

caacaaatatataccatggtacagatccagatgatgttcaattttatactattgaaaattctgtgccagt

acacttactaagaacaggtgatgaatttgctacaggaacatttttttttgattgtaaaccatgtagacta

acacatacatggcaaacaaatagagcattgggcttaccaccatttctaaattctttgcctcaagctgaag

gaggtactaactttggttatataggagttcaacaagataaaagacgtggtgtaactcaaatgggaaatac

aaactatattactgaagctactattatgagaccagctgaggttggttatagtgcaccatattattctttt

gaggcgtctacacaagggccatttaaaacacctattgcagcaggacgggggggagcgcaaacagatgaaa

atcaagcagcagatggtgatccaagatatgcatttggtagacaacatggtcaaaaaactaccacaacagg

agaaacacctgagagatttacatatatagcacatcaagatacaggaagatatccagaaggagattggatt

caaaatattaactttaaccttcctgtaacagaagataatgtattgctaccaacagatccaattggaggta

aaacaggaattaactatactaatatatttaatacttatggtcctttaactgcattaaataatgtaccacc

agtttatccaaatggtcaaatttgggataaagaatttgatactgacttaaaaccaagacttcatgtaaat

gcaccatttgtttgtcaaaataattgtcctggtcaattatttgtaaaagttgcgcctaatttaacaaatg

aatatgatcctgatgcatctgctaatatgtcaagaattgtaacttactcagatttttggtggaaaggtaa

attagtatttaaagctaaactaagagcctctcatacttggaatccaattcaacaaatgagtattaatgta

gataaccaatttaactatgtaccaagtaatattggaggtatgaaaattgtatatgaaaaatctcaactag

caccaagaaaattatat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>1422</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1422</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CPV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>MSGNQYTEEVMEGVNWLKKHAENEAFSFVFKCDNVQLNGKDVRWNNYTK

PIQNEELTSLIRGAQTAMDQTEEEEMDWESEVDSLAKKQVQTFDALIKKCLFEVFVSKNIEPNECVWFIQ

HEWGKDQGWHCHVLLHSKNLQQATGKWLRRQMNMYWSRWLVTLCSVNLTPTEKIKLREIAEDSEWVTILT

YRHKQTKKDYVKMVHFGNMIAYYFLTKKKIVHMTKESGYFLSTDSGWKFNFMKYQDRQIVSTLYTEQMKP

ETVETTVTTAQETKRGRIQTKKEVSIKCTLRDLVSKRVTSPEDWMMLQPDSYIEMMAQPGGENLLKNTLE

ICTLTLARTKTAFELILEKANNTKLTNFDLANSRTCQIFRMHGWNWIKVCHAIACVLNRQGGKRNTVLFH

GPASTGKSIIAQAIAQAVGNVGCYNAANVNFPFNDCTNKNLIWIEEAGNFGQQVNQFKAICSGQTIRIDQ

KGKGSKQIEPTPVIMTTNENITIVRIGCEERPEHTQPIRDRMLNIKLVCKLPGDFGLVDKEEWPLICAWL

VKHGFESTMANYTHHWGKVPEWDENWAEPKIQEGINSPGCKDLETQAASNPQSQDQVPTPLTPDVVDLAL

EPWSTPDTPIAETANQQSNQLGVTHKDVQASPTWSEIEADLLLRAIFTSEQLEEDFRDDLDGTMAPPAKR

ARRGKGVLVKWGEGKDLITLSMCFFIGLVPPGYKYLGPGNSLDQGEPTNPSDAAAKEHDEAYAAYLRSGK

NPYLYFSPADQRFIDQTKDAKDWGGKIGHYFFRAKKAIAPVLTDTPDHPSTSRPTKPTKRSKPPPHIFIN

LAKKKKAGAGQVKRDNLAPMSDGAVQPDGGQPAVRNERATGSGNGSGGGGGGGSGGVGISTGTFNNQTEF

KFLENGWVEITANSSRLVHLNMPESENYRRVVVNNLDKTAVNGNMALDDTHAQIVTPWSLVDANAWGVWF

NPGDWQLIVNTMSELHLVSFEQEIFNVVLKTVSESATQPPTKVYNNDLTASLMVALDSNNTMPFTPAAMR

SETLGFYPWKPTIPTPWRYYIQWDRTLIPSHTGTSGTPTNIYHGTDPDDVQFYTIENSVPVHLLRTGDEF

ATGTFFFDCKPCRLTHTWQTNRALGLPPFLNSLPQAEGGTNFGYIGVQQDKRRGVTQMGNTNYITEATIM

RPAEVGYSAPYYSFEASTQGPFKTPIAAGRGGAQTDENQAADGDPRYAFGRQHGQKTTTTGETPERFTYI

AHQDTGRYPEGDWIQNINFNLPVTEDNVLLPTDPIGGKTGINYTNIFNTYGPLTALNNVPPVYPNGQIWD

KEFDTDLKPRLHVNAPFVCQNNCPGQLFVKVAPNLTNEYDPDASANMSRIVTYSDFWWKGKLVFKAKLRA

SHTWNPIQQMSINVDNQFNYVPSNIGGMKIVYEKSQLAPRKLY</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

1. Способ опосредованного определения титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцин методом ПЦР в режиме реального времени, отличающийся тем, что предполагает использование разработанных оригинальных олигонуклеотидных праймеров и зонда CPV-T-F3493-праймер с дизайном 5'-GAAGCTACTATTATGAGACCA-3', CPV-Т-R3718-праймер с дизайном 5'-TCTTCCTGTATCTTGATGTGC-3', CPV-Т-Р3627-зонд с дизайном 5'-FAM-AGCAGATGGTGATCCAAGA-RTQ1-3' и включающий следующие этапы:

- выделение ДНК возбудителя парвовирусного энтерита собак с помощью 5М раствора гуанидинизотиоцианата и 85% раствора изопропилового спирта;

- проведение ПЦР в режиме реального времени с детекцией флуоресцентного сигнала сигмоид для исследуемых образцов с использованием разработанных оригинальных олигонуклеотидов, которые рассчитаны на участок VP₂-гена возбудителя парвовирусного энтерита собак в диапазоне 3493…3738 п.н.;

- расчет цикла количественной оценки по данным ПЦР в режиме реального времени;

- определение титра инфекционной активности возбудителя парвовирусного энтерита собак в сырье для вакцины на основе разработанной логарифмической регрессионной функции: lg T_CVP=-0,3003×C_q+9,4227 с достоверностью аппроксимации 0,9994 и эффективностью амплификации 99,73%.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что время проведения анализа сокращается до 3,0 ч, аналитическая чувствительность составляет не менее 1,0 lg ТЦД₅₀/см³.